肝脾舒對(duì)肝硬化大鼠腸屏障功能的保護(hù)作用

潘相學(xué)+祝峻峰+李勇

[摘要] 目的 探討肝脾舒對(duì)肝硬化大鼠腸黏膜屏障的保護(hù)作用。 方法 雄性SD大鼠36只，基于SAS proc plan 語(yǔ)句，按照體重從小到大的順序隨機(jī)分為4組，每組9只。空白組每日腹腔注射生理鹽水，模型組采用四氯化碳腹腔注射制備肝硬化模型，肝脾舒組和杜秘克組在模型組基礎(chǔ)上每日分別給予肝脾舒或杜秘克灌胃。取血漿檢測(cè)內(nèi)毒素（ET）、二胺氧化酶（DAO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白介素-1β（IL-1β）水平，取肝組織和回腸組織行HE染色觀察病理變化。 結(jié)果 肝脾舒組血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β濃度明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；肝脾舒組血漿DAO、IL-1β濃度明顯低于杜秘克組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。肝脾舒組及杜秘克組的肝組織及回腸組織病理改變均優(yōu)于模型組。 結(jié)論 肝脾舒對(duì)肝硬化大鼠腸黏膜屏障具有保護(hù)作用，可以截?cái)鄬?duì)腸黏膜屏障的損傷，進(jìn)而影響肝硬化的發(fā)展過(guò)程。

[關(guān)鍵詞] 四氯化碳；腸黏膜；肝硬化；肝脾舒

[中圖分類號(hào)] R287 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）12（c）-0021-04

[Abstract] Objective To explore the protective effect of Gan Pi Shu on intestinal mucosal barrier in rats with liver cirrhosis. Methods A total of 36 male SD rats were divided randomly into 4 groups based on SAS proc plan sentence according to the order of weight to be large， with 9 rats in each group. The rats in the blank group were injected intraperitoneally with saline daily. The rats in the model group were injected intraperitoneally with carbon tetrachloride to establish the model of liver cirrhosis. The rates in the Gan Pi Shu group and the Duphalac group were given Gan Pi Shu and Duphalac respectively based on the model group. The plasma levels of endotoxin （ET）， diamine oxidase （DAO）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and interleukin-1β （IL-1β） were measured. The pathological changes of liver and ileum tissue were observed by HE staining. Results The plasma levels of ET， DAO， TNF-α and IL-1β in Gan Pi Shu group were lower than those of model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. DAO and IL-1β in Gan Pi Shu group were lower than those of Duphalac group， with statistically significant difference （P < 0.05）. The pathological changes of liver and ileum tissue in Gan Pi Shu and Duphalac group was better than that of model group. Conclusion Gan Pi Shu has the protective effect on the intestinal mucosal barrier in rats with liver cirrhosis， which can truncate the development process between intestinal mucosal barrier dysfunction and cirrhosis.

[Key words] Diamine oxidase； Intestinal mucosa； Cirrhosis； Gan Pi Shu

肝硬化是臨床常見的慢性進(jìn)行性肝病，晚期常出現(xiàn)上消化道出血、肝性腦病等全身各系統(tǒng)并發(fā)癥，病死率高。多項(xiàng)研究證實(shí)，腸屏障功能障礙與肝硬化并發(fā)癥密切相關(guān)，在其發(fā)生、發(fā)展中起到了樞紐的作用[1-3]。腸源性內(nèi)毒素血癥（IETM）[4]是肝硬化患者常有的并發(fā)癥，在內(nèi)毒素（ET）的作用下，腸道黏膜下固有層的肥大細(xì)胞被激活，通過(guò)活化脫顆粒釋放大量炎癥介質(zhì)如白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，通過(guò)一系列的生理、病理變化促進(jìn)肝硬化的發(fā)展[5]，最終造成腸屏障功能損傷—內(nèi)毒素血癥—肝損傷加重—多臟器衰竭的惡性循環(huán)[6-8]。因此，尋求有效的藥物，截?cái)喔斡不陌l(fā)展，是當(dāng)今醫(yī)學(xué)界面臨的重大課題。本研究應(yīng)用中藥肝脾舒治療肝硬化獲得了良好的效果，進(jìn)一步闡明了該藥的藥效機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 對(duì)象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

ET、TNF-α、二胺氧化酶（DAO）及IL-1β檢測(cè)試劑盒：南京建成科技有限公司；四氯化碳（CCl4）：成都科龍化工試劑廠（生產(chǎn)批號(hào)：150508）。endprint

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠36只，2個(gè)月大，平均體重（200±20） g，雄性，SPF級(jí)，由中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（合格證號(hào)：2013000649953）提供。實(shí)驗(yàn)前于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，飼養(yǎng)條件：符合晝夜光線變化要求的房間，恒溫（22～24℃）、恒濕（50%），所有大鼠均自由進(jìn)水和進(jìn)食。

1.3 動(dòng)物造模

本研究應(yīng)用CCl4的造模方法[9]，依據(jù)大鼠的體重分?jǐn)?shù)，按0.3 mL/100 g的標(biāo)準(zhǔn)，每只大鼠給予40%CCl4溶液進(jìn)行腹腔注射，首劑加倍（0.6 mL/100 g），隔日1次，持續(xù)注射90 d。

1.4 分組和處理

將大鼠按體重排序，基于SAS proc plan語(yǔ)句，36只大鼠被隨機(jī)分為4組，分別為空白組、模型組、肝脾舒組和杜秘克組（陽(yáng)性對(duì)照組），每組各9只。各組在造模同時(shí)給藥，肝脾舒組給予肝脾舒20 mL/kg灌胃，藥物組成：虎杖（批號(hào)：13060064）、生白術(shù)（批號(hào)：1305068）、枳實(shí)（批號(hào)：1305024）、當(dāng)歸（批號(hào)：1306015）、廣郁金（批號(hào)：1303042），所有藥物均為江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的顆粒劑，按照30 g ∶ 9 g ∶ 9 g ∶ 6 g ∶ 9 g比例混合，加水200 mL調(diào)成）。空白組、模型組用同等容量的生理鹽水灌胃。杜秘克組給予杜秘克（雅培生物科技公司，批號(hào)：253335），每日0.01 mg/kg灌胃。上述各實(shí)驗(yàn)組均連續(xù)給藥90 d，各組大鼠均自由飲水，并應(yīng)用普通飼料喂養(yǎng)。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

造模90 d，用烏拉坦（1.25 g/kg）行腹腔麻醉，然后抽取血液、剪取腸道及肝臟組織，檢測(cè)血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β，所有操作步驟嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，應(yīng)用723型分光光度計(jì)進(jìn)行上述項(xiàng)目的檢測(cè)。取肝右葉及回腸部分組織，于l0%中性甲醛固定，經(jīng)石蠟包埋、切片、脫蠟水化，常規(guī)HE染色后，應(yīng)用普通光鏡觀察肝組織及回腸組織的病理變化。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用Origin 8.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。兩組間比較，當(dāng)方差齊性時(shí)，采用組間t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)，采用t'校正檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)用SNK-q法，方差不齊時(shí)用Dunnett′s T3法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 模型評(píng)價(jià)

模型組與空白組血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β含量比較，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01），提示造模成功。見表1。

2.2 三組血漿ET、DAO、TNF-α和IL-1β含量比較

三組血漿ET比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。進(jìn)一步兩兩比較，肝脾舒組ET水平低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；與杜秘克組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。肝脾舒組DAO濃度低于模型組和杜秘克組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。肝脾舒組血漿TNF-α及IL-1β濃度均低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；肝脾舒組TNF-α水平低于與杜秘克組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）；肝脾舒組IL-1β水平明顯低于杜秘克組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。杜秘克組TNF-α明顯低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表2。

2.3 肝組織HE染色結(jié)果

空白組肝組織整體清晰、肝小葉分布正常，肝細(xì)胞排列規(guī)則，胞漿均勻，細(xì)胞核形態(tài)正常，肝血竇無(wú)異常改變。模型組大鼠的肝組織結(jié)構(gòu)相對(duì)松散和更加紊亂，肝細(xì)胞存在大量的點(diǎn)狀及灶狀壞死，肝索模糊或消失，肝間質(zhì)有大量的纖維組織增生，具有假小葉形成的特點(diǎn)。杜秘克組部分肝細(xì)胞發(fā)生氣泡樣變性，并有少量細(xì)胞發(fā)生了壞死，明顯存在肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，存在較多的纖維組織增生，但形成間隔較少。肝脾舒組盡管仍存在肝小葉結(jié)構(gòu)受損的特點(diǎn)，但只有少量的纖維組織增生，并有少數(shù)肝細(xì)胞發(fā)生了氣泡樣變性，未見假小葉形成。

2.4 回腸HE染色結(jié)果

空白組大鼠的腸絨毛組織結(jié)構(gòu)比較完整，排列整齊。模型組大鼠腸絨毛長(zhǎng)短不一、結(jié)構(gòu)比較紊亂，與空白組比較，大部分絨毛具有明顯縮短，部分出現(xiàn)斷裂、壞死及脫落，大腸肌層增厚。肝脾舒組和杜秘克組的HE染色相似，主要表現(xiàn)為腸絨毛排列基本整齊，結(jié)構(gòu)基本完整，脫落、倒伏情況明顯好于模型組，只有部分絨毛存在局部變短的特點(diǎn)，肌層增厚。

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝硬化的病因多為各種病毒侵襲人體（肝炎病毒屬中醫(yī)疫毒濕邪范疇），羈留體內(nèi)，長(zhǎng)期遷延不愈，或長(zhǎng)期嗜酒酗酒，或長(zhǎng)期恣食膏粱厚味等，導(dǎo)致肝臟代謝異常，形成肝硬化。因此，中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，濕熱邪毒是肝硬化的始動(dòng)因素，并貫穿肝硬化的整個(gè)病機(jī)過(guò)程，而正氣虧損是肝硬化發(fā)展的內(nèi)在原因，其盛衰的轉(zhuǎn)化是肝硬化轉(zhuǎn)歸的重要影響因素[10]。王靈臺(tái)[11]教授早年以清肝為則組方“清肝顆?！边M(jìn)行各種肝病的治療，顯著改善了患者的肝功能，并對(duì)病毒復(fù)制產(chǎn)生了明顯的抑制作用。中醫(yī)五行學(xué)認(rèn)為，肝屬木而脾屬土，肝病實(shí)則木克土，易乘脾犯胃，造成脾胃虛弱。所以中醫(yī)學(xué)有“見肝之病，知肝傳脾，當(dāng)先實(shí)脾”的說(shuō)法。“納呆、腹脹、便溏”是肝硬化患者的常見癥狀，也是中醫(yī)脾虛的典型癥狀，而事實(shí)上，這些癥狀與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)腸道的功能密切相關(guān)，提示現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的腸道、肝臟等臟腑共同囊括于了中醫(yī)學(xué)的肝脾理論中。在此基礎(chǔ)上，本研究以清肝實(shí)脾立法，組方肝脾舒，該方由虎杖、生白術(shù)、枳實(shí)、當(dāng)歸和廣郁金五味基本藥物組成，臨床根據(jù)患者癥狀靈活化裁，用于病毒性、酒精性肝炎、肝硬化等各種類型肝病患者，療效滿意，明顯緩解患者臨床癥狀，有效防止并發(fā)癥的發(fā)生。此外，該方還具有顯著改善便秘患者腸道癥狀的作用[12]，起到了“四季脾旺不受邪”的臨床治療效果。endprint

肝脾舒方的君藥為虎杖，虎杖的主要有效成分為虎杖苷、白藜蘆醇以及大黃素等。研究認(rèn)為，上述提取物有顯著的抗EI作用[13]；白藜蘆醇具有有效抑制TNF-α產(chǎn)生的藥理效果，同時(shí)，在重癥急性胰腺炎的發(fā)生中，該藥還具有抗氧化作用[14]。另有研究顯示[15-18]白藜蘆醇可通過(guò)增加活性氧含量，強(qiáng)化氧化應(yīng)激，降低線粒體膜電位，在多發(fā)性骨髓瘤H929、人肺腺癌A549、彌漫大B淋巴瘤及卵巢癌SKOV-3細(xì)胞中啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。其主要成份大黃素抗菌抗病毒并促進(jìn)腸道平滑肌蠕動(dòng)的藥理效果目前已經(jīng)被醫(yī)學(xué)界廣泛認(rèn)可，能夠顯著發(fā)揮腸黏膜屏障的保護(hù)作用。另外，近年來(lái)的研究顯示，大黃素在抗肝纖維化方面也表現(xiàn)出了明顯的治療效果[19]。還有實(shí)驗(yàn)表明[20]，大黃素尚可下調(diào)Wnt/β-catemin通路中的促血管生成因子表達(dá)從而抑制裸鼠結(jié)腸癌移植瘤的生長(zhǎng)及微血管的形成。

本研究模型組肝組織HE染色的結(jié)果提示已經(jīng)形成了肝硬化，另外，模型組血漿EI水平與空白組相比明顯升高，提示模型組已經(jīng)形成了IETM。與模型組比較，而肝脾舒組與杜秘克組肝硬化病理變化的程度均有不同程度的減輕，血漿EI水平也顯著低于模型組。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠回腸HE染色提示其腸黏膜機(jī)械屏障受到較嚴(yán)重的損傷，而肝脾舒組回腸組織的HE染色較模型組有不同程度減輕。由于DAO主要存在于小腸黏膜絨毛上層細(xì)胞中，是該類胞質(zhì)中具有高度活性的細(xì)胞內(nèi)酶，因此，通過(guò)檢測(cè)血清中的DAO水平，能夠早期反映腸道的黏膜屏障功能。TNF-α、IL-1β為炎癥介質(zhì)，其含量的增加顯示局部或全身炎性反應(yīng)，本研究結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組血清的ET、DAO、TNF-α、IL-1β水平明顯升高，提示模型組的腸黏膜上皮層受到一定程度的損傷，并存在EI血癥及全身炎性反應(yīng)，肝脾舒組的血清DAO、ET、DAO、TNF-α、IL-1β水平較對(duì)照組低，提示中藥肝脾舒能夠減輕IETM，減輕炎性反應(yīng)，對(duì)腸黏膜機(jī)械屏障、免疫屏障都具有一定的保護(hù)作用，這可能是肝脾舒減慢肝硬化進(jìn)程的機(jī)制之一。

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（收稿日期：2017-09-18 本文編輯：王 娟）endprint