炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型建立及血管生成抑制因子1在結(jié)直腸癌中的表達(dá)

王磊+時軍利+李炳慶

[摘要] 目的 探討炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的建立，及血管生成抑制因子1（VASH-1）在結(jié)直腸癌中的表達(dá)。 方法 將雄性小鼠（C57BL/6）30只按體重大小隨機(jī)分為兩組。A組給予氧化偶氮甲烷（AOM）10 mg/kg右側(cè)腹腔注射，后于第1、4、7周給予1.5%～2.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）自由飲用7 d，其余時間自由飲清水。B組給予生理鹽水0.1 mL/10 g右側(cè)腹腔注射，此后給予清水自由飲用。均在第10周末處死小鼠，查看成瘤情況。免疫組織化學(xué)染色法探討VASH-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)。 結(jié)果 造模結(jié)束后A組成瘤率為53.33%，病理提示為腺癌，B組成瘤率為0.00%，兩組成瘤率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。VASH-1在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，在正常結(jié)直腸組織中低表達(dá)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 本方法建立的炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型成瘤率較高。VASH-1在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)高于正常結(jié)直腸組織。

[關(guān)鍵詞] 炎癥性腸?。唤Y(jié)直腸腫瘤；動物模型；血管生成抑制因子

[中圖分類號] R735.3 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）12（c）-0017-04

[Abstract] Objective To investigate the establishment of mice model of inflammation-associated colorectal cancer and expression of vasohibin-1 （VASH-1） in colorectal cancer. Methods Thirty male mice （C57BL/6） were randomly divided into two groups according to the body weight. Group A was given right intraperitoneal administration of azoxymethane （AOM） 10 mg/kg first， and free drink of 1.5%-2.5% dextran sulfate sodium （DSS） at the first， fourth， seventh week later for 7 d， which drunk distilled water on the other time. Group B was given right intraperitoneal administration of normal saline 0.1 mL/10 g， then the mice were given distilled water on the other time. The mice of both groups were killed at the end of tenth week to observe the conditions of tumor formation. The immunohistochemical staining was performed to evaluate the expression of VASH-1 in the of tissue colorectal cancer. Results After modeling， the tumor formation rate of group A was 53.33%， with the pathologic findings of adenocarcinoma， which of group B was 0.00%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. VASH-1 had high expression in the colorectal cancer and low expression in normal colorectal tissues， with significant difference （P < 0.05）. Conclusion The tumor formation rate of mice model of inflammation-associated colorectal cancer induced by this method is high. The expression of VASH-1 in colorectal cancer is higher than that in normal colorectal tissues.

[Key words] Inflammatory bowel disease； Colorectal cancer； Animal model； Vasohibin

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，結(jié)直腸癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，包括遺傳[1]、生活習(xí)慣及高脂飲食等原因[2]，此外炎癥性腸病是引起結(jié)直腸癌的另一類原因[3]。結(jié)直腸癌的動物模型可模擬結(jié)直腸癌的多種生物學(xué)特征，是研究結(jié)直腸癌發(fā)病機(jī)制及治療的重要手段。炎癥性腸病引起的結(jié)直腸癌常用的動物模型造模方法為氧化偶氮甲烷（azoxymethane，AOM）腹腔注射，之后自由飲用葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）溶液[4]，文獻(xiàn)報道的關(guān)于自由飲用DSS的濃度及造模時間多種多樣，但應(yīng)用有效的DSS及縮短造模時間仍在進(jìn)一步研究中。腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移需要依賴腫瘤血管的生成。有些抗腫瘤藥物通過抑制腫瘤血管的生成來抑制腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移，而在腫瘤血管生成中血管生成抑制因子1（vasohibin-1，VASH-1）是血管生成抑制因子中的一種。本研究探討炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠模型的建立及VASH-1在炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌小鼠中的表達(dá)情況，或許可以找到抗腫瘤治療的新靶點。endprint

1 對象與方法

1.1 實驗動物

5～6周齡雄性C57BL/6小鼠[購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，動物合格證號：SCXK（京）2012-0001]30只。

1.2 主要儀器與試劑

AOM購于Sigma公司，DSS購于MPBio公司，VASH-1購于SANTA公司，DAB試劑盒及生物素-鏈霉卵白素免疫組化試劑盒均購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實驗分組及處理

小鼠飼養(yǎng)1周后按體重大小隨機(jī)分為兩組。A組：第1天給予AOM 10 mg/kg右側(cè)腹腔注射，同時給予2.5% DSS自由飲用4 d，清洗水瓶后給予新配制的2.5% DSS自由飲用3 d，清洗水瓶后給予清水自由飲用2周，第4周給予1.5% DSS自由飲用4 d，清洗水瓶后給予新配制的1.5% DSS自由飲用3 d，清洗水瓶后給予清水自由飲水2周，第7周重復(fù)第4周的步驟，第8周以后給予清水自由飲用，第10周末處死小鼠。B組：第1天給予生理鹽水0.1 mL/10 g右側(cè)腹腔注射，此后給予清水自由飲用，第10周末處死小鼠。實驗過程已通過承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院動物倫理委員會論證。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 成瘤率 兩組小鼠從直腸至回盲部完整留取結(jié)直腸組織，沿長軸切開結(jié)直腸，生理鹽水反復(fù)沖洗，計數(shù)腫瘤個數(shù)，采用意向性分析原則計算成瘤率，實驗中死亡小鼠計為未成瘤。

1.4.2 HE染色 兩組小鼠結(jié)直腸組織標(biāo)本均甲醛固定48 h以后進(jìn)行石蠟包埋，切片后進(jìn)行HE染色。

1.4.3 免疫組化 免疫組織化學(xué)染色方法（SP法）判定VASH-1在結(jié)直腸癌組織及正常組織中的表達(dá)情況。VASH-1抗體濃度采用1∶300，同時PBS作空白對照。每個標(biāo)本照取圖片（400×）。按細(xì)胞陽性率及著色強(qiáng)度分別記分，細(xì)胞陽性率記分：著色陽性細(xì)胞占圖片內(nèi)細(xì)胞比例≤5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分；著色強(qiáng)度記分：不著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分?？偡?細(xì)胞陽性率記分×著色強(qiáng)度記分。總分≤0分為陰性，1～4分為弱陽性，5～8分為陽性，9～12分為強(qiáng)陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0處理數(shù)據(jù)。計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用t檢驗，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

給藥前A組小鼠體重為（18.707±0.976）g，B組為（18.147±1.448）g，兩組體重比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。腹腔注射藥物當(dāng)時B組死亡1只，第1周的第4天A組小鼠逐漸出現(xiàn)便血情況，第6天A組死亡1只，第7天A組死亡2只，解剖后觀察腸腔內(nèi)可見殘留血液。第8周A組死亡1只，B組死亡2只，解剖后結(jié)直腸內(nèi)未見腫瘤及出血。

2.2 造模成瘤情況

A組8只小鼠可見腫瘤生長，成瘤率為53.33%，病理提示為腺癌，見圖1。B組未見腫瘤生長，成瘤率為0.00%，兩組成瘤率比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

2.3 VASH-1表達(dá)情況

VASH-1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，在正常結(jié)直腸組織中低表達(dá)，見圖2（封三）。A組中陽性表達(dá)9只，強(qiáng)陽性表達(dá)2只，陰性表達(dá)及弱陽性表達(dá)0只，陽性表達(dá)率為100%。B組中陰性表達(dá)9只，弱陽性表達(dá)2只，陽性表達(dá)1只，陽性表達(dá)率為25%。兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

結(jié)直腸癌是常見的惡性腫瘤，其發(fā)生部位常見于直腸，其次是乙狀結(jié)直腸，結(jié)直腸癌的發(fā)生與多種因素有關(guān)，比如遺傳、高脂肪飲食、炎癥性腸病等。炎癥性腸病在亞洲發(fā)病率成上升趨勢，那么由此導(dǎo)致的結(jié)直腸癌就不容忽視，而動物實驗是研究炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的常用方法。關(guān)于炎癥性腸病導(dǎo)致結(jié)直腸癌的動物研究模型常用AOM+DSS來造模，其造模成功率較高[5]。AOM是致癌物，可導(dǎo)致遠(yuǎn)端結(jié)直腸腫瘤，DSS可以誘導(dǎo)結(jié)直腸炎癥，從而加速腫瘤的形成，用AOM+DSS來進(jìn)行結(jié)直腸癌動物模型建立能反映炎癥性腸病相關(guān)性的結(jié)直腸癌情況[6]。

基于導(dǎo)致結(jié)直腸癌發(fā)生的原因有很多，已有大量文章報道了多種基因與結(jié)直腸癌發(fā)生有關(guān)，一些基因敲除后可導(dǎo)致或抑制結(jié)直腸癌的發(fā)生，包括APC、IL-10、Myd88[7-9]、TLR4[10]等。本研究觀察炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌模型的建立，為剔除上述原因干擾，我們應(yīng)用了C57BL/6野生型小鼠為實驗對象。同時也已有文獻(xiàn)[11]報道了在AOM/DSS誘導(dǎo)小鼠炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌的模型中，雌激素可促進(jìn)結(jié)直腸癌的形成，所以在本研究中僅應(yīng)用雄性小鼠造模來剔除雌性激素的干擾。Day等[12]報道了高脂肪飲食導(dǎo)致的結(jié)直腸癌可能由炎癥介導(dǎo)，本研究中小鼠的食物剔除高脂肪作用。

本研究采用了AOM和DSS來建立結(jié)直腸癌模型，AOM腹腔注射1次，此后行3個周期的1.5%～2.5%DSS口服，為自由飲用，造模時間為10周，達(dá)到的成瘤率為53.33%，瘤體大小中等，完全能夠達(dá)到實驗所用標(biāo)本數(shù)量的要求，也有學(xué)者[6]報道了應(yīng)用AOM腹腔注射1次，此后進(jìn)行1個周期的DSS自由飲用，造模時間為120 d，然而DSS引起結(jié)直腸炎癥是急性炎癥，停止口服DSS后結(jié)直腸炎癥逐漸消失，這不符合炎癥性腸病慢性炎癥的特征，所以本研究應(yīng)用3個DSS口服周期來模擬炎癥性腸病的慢性炎癥。結(jié)直腸癌的形成與DSS劑量呈正相關(guān)[13]，但大劑量的DSS會導(dǎo)致結(jié)直腸嚴(yán)重炎癥，最終導(dǎo)致小鼠死亡。本研究中第1個DSS循環(huán)中第4天小鼠即出現(xiàn)便血，DSS誘導(dǎo)結(jié)直腸炎癥成功，但此后3 d內(nèi)A組小鼠死亡3只，解剖后發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)血液滯留，考慮死亡原因為消化道出血，不能除外DSS應(yīng)用劑量過大引起，遂在此后兩個循環(huán)中采用1.5% DSS喂養(yǎng)，小鼠仍有便血，但死亡率減少，然而在10周末成瘤率卻很高。endprint

腫瘤的發(fā)生是源于局部的抑制腫瘤生成因子及促進(jìn)腫瘤生成因子平衡被打破，但這些因子與脈管系統(tǒng)無直接關(guān)系，然而新生血管的生成在腫瘤形成及發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，目前越來越多的研究關(guān)注于腫瘤血管的形成，并深入到分子學(xué)機(jī)制。VASH-1是一個受VEGF-A負(fù)反饋調(diào)節(jié)的血管生成抑制因子，能夠抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，促進(jìn)凋亡，抑制病理性血管生成[14-15]。然而在腫瘤環(huán)境中，其抑制血管生成作用卻被抑制了[16]。本研究指出在腫瘤組織中VASH-1高表達(dá)，在正常結(jié)直腸組織中低表達(dá)，兩者表達(dá)情況存在著統(tǒng)計學(xué)差異，這表明了VASH-1基因在炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中起著重要作用，但具體機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

有研究表明VASH-1的表達(dá)在組織學(xué)惡性程度越高、存在轉(zhuǎn)移的腫瘤中表達(dá)越高，在結(jié)直腸癌[17]、腎癌[18]、頭頸鱗狀細(xì)胞癌[19]、卵巢癌中[20]與腫瘤預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，這表明了VASH-1可作為腫瘤血管新生的腫瘤標(biāo)志物，同時可預(yù)測預(yù)后。在本研究中因AOM-DSS造模炎癥相關(guān)結(jié)直腸癌模型中，腫瘤均為原位癌，無法證實這種差異，但也一定程度上說明了VASH-1可以作為一種腫瘤標(biāo)志物來預(yù)測腫瘤及預(yù)后。臨床上，在對腫瘤的治療中，從腫瘤血管層面治療的有原發(fā)性肝癌、行肝動脈栓塞、化療等，在分子學(xué)層面上有索拉菲尼抑制腫瘤血管生成，針對腫瘤的治療，在血管層面上的治療方案能達(dá)到預(yù)期的結(jié)果，而VASH-1在腫瘤中表達(dá)的差異，或許為腫瘤分子層面的治療提供了新的靶點。

本研究采用AOM+DSS來進(jìn)行炎癥相關(guān)性結(jié)直腸癌模型建立成功，成瘤率達(dá)到53.33%，同時造模周期為10周，縮短了造模時間。VASH-1可作為腫瘤預(yù)測因子用于臨床，同時或許為腫瘤分子層面的治療提供了新的靶點。

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（收稿日期：2017-08-17 本文編輯：張瑜杰）endprint