培哚普利改善心室重構(gòu)作用與Gal-3的相關(guān)性

張躍華，李樹仁，鄧文浩，楊玲玲，郝 瀟，李 沙

(河北醫(yī)科大學(xué)研究生學(xué)院/河北省人民醫(yī)院心內(nèi)一科，石家莊 050051)

心力衰竭是一種復(fù)雜的臨床征候群，是各種心血管疾病的嚴(yán)重階段，而心室重構(gòu)被認(rèn)為是心力衰竭發(fā)展的基礎(chǔ)[1]。已有眾多基礎(chǔ)和臨床研究表明，心室重構(gòu)在心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[2-4]。近年來，減慢或延緩心室重構(gòu)的進(jìn)展成為治療心力衰竭的主要方向。目前半乳糖凝集素-3(Galectin-3，Gal-3)與心力衰竭和心室重構(gòu)的關(guān)系備受關(guān)注。近期研究表明Gal-3促進(jìn)心肌纖維化、參與心肌炎性改變和心室重塑等過程[5]。所以Gal-3有可能作為一種新型的心力衰竭指標(biāo)，運(yùn)用在心力衰竭的診斷和預(yù)后方面，而抑制Gal-3的表達(dá)和作用也將成為治療心力衰竭的一個(gè)新方向。然而血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑(ACEI)作為心力衰竭的治療的基石，可以改善心室重構(gòu)，但其機(jī)制還不完全清楚，ACEI改善缺血性心力衰竭家兔心室重構(gòu)作用是否與Gal-3的表達(dá)相關(guān)尚不明確。本研究通過應(yīng)用培哚普利治療心肌梗死后心功能障礙家兔，檢測(cè)家兔心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的 mRNA 和蛋白的表達(dá)、血清Gal-3水平和心功能的變化，觀察應(yīng)用培哚普利治療和未應(yīng)用培哚普利治療對(duì)Gal-3的水平、心功能的影響，探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)選用健康 3 月齡新西蘭雄性家兔(合格證號(hào)：1606173)30只，每只體質(zhì)量約2.5 kg，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2試驗(yàn)與儀器 培哚普利片(雅施達(dá)制藥有限公司，中國)；注射用青霉素鈉 (華北制藥，中國)；兔血清Galectin-3 ELISA試劑盒(上海藍(lán)基科技公司，中國)；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(CWbio.Co.Ltd，中國)、UltraSYBR Mixture(CWbio.Co.Ltd，中國)、5 RNA上樣緩沖(CWbio.Co.Ltd，中國)。心臟超聲儀(TOSHIBA，日本)；低速臺(tái)式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，中國)；渦旋振蕩儀QL-902(海門市其林貝爾儀器制造有限公司，中國)；分光光度計(jì)NANODROP 2000(Thermo scientific，美國)；熒光定量PCR儀Line Gene 9600 Plus(Bioer Technology，中國)；雙垂直電泳槽(CAVOY MP-8001，中國)；轉(zhuǎn)移槽(CAVOY MP-3030，中國)；溫控?fù)u床(其林貝爾TS-2000A，中國)；電泳儀(CAVOY PP-1150，中國)。

1.2方法

1.2.1分組及處理 30只家兔分為假手術(shù)組、心力衰竭組和培哚普利組，每組10只，分別檢測(cè)術(shù)后2周左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)，LVEF<50%為模型制作成功。模型制作成功后假手術(shù)組和心力衰竭組均以2 mL·kg-1·d-1的生理鹽水灌胃4 周，培哚普利組以2 mL·kg-1·d-1的培哚普利(藥物的濃度為0.33 mg/mL) 灌胃4 周。

1.2.2動(dòng)物模型制備 采用結(jié)扎前降支的方法制作心功能障礙模型。記錄術(shù)前心電圖后開胸結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，模型制備成功標(biāo)準(zhǔn)為心尖部及左室前壁由紅色變?yōu)榘底仙?，局部心肌運(yùn)動(dòng)異常，心電圖示胸前導(dǎo)聯(lián) ST 段持續(xù)弓背向上抬高[6]。假手術(shù)組只開胸不結(jié)扎冠狀動(dòng)脈前降支，模型制備后心尖部及左室前壁無顏色變化，心肌運(yùn)動(dòng)無異常，心電圖示胸前導(dǎo)聯(lián) ST 段未抬高。兩組術(shù)后 3 d每天青霉素 80 萬單位肌內(nèi)注射。

1.2.3心功能檢測(cè) 術(shù)前、術(shù)后2周及4周由同一人行超聲心動(dòng)圖檢查，測(cè)量兩組LVEF、左室舒張末期內(nèi)徑(end diastolic diameter，EDD)。所有測(cè)量值均取3 次測(cè)量的平均值。

1.2.4梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的mRNA的表達(dá)的檢測(cè) 給藥4 周后，取心肌梗死區(qū)域心肌組織進(jìn)行研磨，提取總RNA，瓊脂糖凝膠電泳測(cè)其完整性;按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為:42 ℃ 50 min，95 ℃ 5 min。Actin 上游引物5′-AGA TCG TGC GGG ACA TCA AG-3′,下游引物5′-CAG GAA GGA GGG CTG GAA GA-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為182 bp；Ⅰ型膠原的上游引物為5′-TGA GCC AGC AGA TTG AGA ACA T-3′，下游引物為5′-TGT CGC AGA AGA CCT TGA TGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為165 bp;Ⅲ型膠原 的上游引物5′-GTA CAA CTA GCA TTC CTC CGA CTG-3′，下游引物為5′-TTA GAG CAG CCA TCC TCC AGA AC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為203 bp;Gal-3的上游引物為5′-CTG TGC CTT ATG ACC TGC CTC T-3′，下游引物為5′-TCA TTG ACC GCA ACC TTG AAG TG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物為301 bp。將獲得的cDNA 按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒操作說明書方法擴(kuò)增目的基因，PCR 熱循環(huán)參數(shù)為96 ℃ 4 min，然后3 步反應(yīng):95 ℃10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，45個(gè)循環(huán)。以Actin為內(nèi)參照，將目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值用于統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。PCR采用2-ΔΔCt(ΔCt=目的基因Ct值-Actin Ct值，ΔΔCt = 目的基因ΔCt 值- 內(nèi)參照基因ΔCt 值) 法計(jì)算結(jié)果[7]。將所得的Gal-3 mRNA表達(dá)量與LVEF 進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.5梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的檢測(cè) 將梗死區(qū)的心肌組織稱重后研磨提取組織中的蛋白，根據(jù)目的蛋白的分子量，配制8%、12%的分離膠，5%濃縮膠，進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳，然后濕轉(zhuǎn)膜，最后用Western blot 試劑盒顯色、ECL發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)并分析目的蛋白。將所得的Gal-3蛋白水平與LVEF 進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.2.6血清中Gal-3的檢測(cè) 分別在術(shù)前、術(shù)后2、4周，經(jīng)家兔耳中動(dòng)脈取血，離心15 min 后取上清液，按照ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作;依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度及其A值計(jì)算相應(yīng)公式;依據(jù)公式和樣品A值計(jì)算標(biāo)本Gal-3的濃度，然后將所得的血清Gal-3 的濃度與LVEF 進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1造模結(jié)果 30只新西蘭雄性家兔在造模術(shù)后共有24 只存活。假手術(shù)組存活8只，死亡2只，其中1只于手術(shù)過程中大出血死亡，另1只開胸過程中發(fā)生氣胸而死亡。心力衰竭組存活 8只，死亡2只,2只于結(jié)扎前降支的過程中誘發(fā)室顫而死亡。培哚普利組存活8只，死亡2只，1只于開胸過程中發(fā)生氣胸而死亡，另1只于結(jié)扎前降支的過程中誘發(fā)室顫而死亡。

2.2心功能檢查結(jié)果 對(duì)術(shù)前3組的超聲結(jié)果行單因素方差分析，結(jié)果顯示LVEF差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與假手術(shù)組相比，術(shù)后2周心力衰竭組和培哚普利組的LVEF明顯減小(P<0.05),術(shù)后4周培哚普利組較心力衰竭組的LVEF上升(P<0.05)，見表1、圖2。

圖2 各組術(shù)后4周的超聲心動(dòng)圖

2.3梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA的表達(dá) 與假手術(shù)組相比，心力衰竭組與培哚普利組梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA的表達(dá)明顯增加(P<0.05)，培哚普利組較心力衰竭組梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的mRNA的表達(dá)減少(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示Gal-3與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.912，P<0.05)，見表2。

表1 各組間術(shù)前、術(shù)后2、4周后LVEF的比較

a：P<0.05,與假手術(shù)組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

表2 梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)的比較

a：P<0.05,與假手術(shù)組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

2.4梗死區(qū)心肌組織Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原及Gal-3的蛋白水平 Western blot的檢測(cè)結(jié)果表明,與假手術(shù)組相比，心力衰竭組和培哚普利組梗死區(qū)心肌組織中Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的蛋白水平增加(P<0.05)，培哚普利組較心力衰竭組Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原的蛋白水平減少(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示Gal-3與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.809，P<0.05)，見表3，圖3。

表3 梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白水平比較

a：P<0.05,與假手術(shù)組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

圖3 梗死區(qū)心肌組織Gal-3、Ⅰ型膠原及Ⅲ型膠原Western-blob的檢測(cè)結(jié)果

2.5血清Gal-3水平 3組術(shù)前血清中Gal-3的水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。術(shù)后4周培哚普利組血清Gal-3水平較心力衰竭組下降(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)性分析顯示，Gal-3與LVEF呈負(fù)相關(guān)(r=-0.925，P<0.05)，見表4。

表4 各組間術(shù)前、術(shù)后2、4周Gal-3的濃度比較

a：P<0.05,與假手術(shù)組比較；b：P<0.05,與心力衰竭組比較

3 討 論

1989年BAUMBACH等[8]提出心室重構(gòu)這個(gè)概念。心室重構(gòu)被認(rèn)為是心力衰竭發(fā)展的基礎(chǔ)，是心力衰竭患者發(fā)病率和死亡率的決定因素，所以減慢或延緩心室重構(gòu)的進(jìn)展成為治療心力衰竭的主要方向。然而ACEI作為心力衰竭的治療基石，其在逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)和心肌纖維化的作用越來越受關(guān)注。近幾年的研究表明ACEI逆轉(zhuǎn)心室重構(gòu)的作用機(jī)制除了抑制血管緊張素Ⅱ生成外，還可增加前列腺素的合成、抑制緩激肽的降解等，但其抑制心肌纖維化的研究尚少，機(jī)制不完全明確。近期已有研究表明，Gal-3在眾多心血管疾病中也起著重要作用[9-12]，其參與心肌纖維化，促進(jìn)了心室重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)展。同時(shí)期也有研究表明Gal-3可能是抗心室重構(gòu)治療的一個(gè)靶點(diǎn)[13-15]。

縱觀國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，RASS系統(tǒng)與Gal-3之間關(guān)系研究較為少見。本研究檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，培哚普利組與心力衰竭組比較，心肌組織中的纖維蛋白明顯減少，與此同時(shí)Gal-3的表達(dá)也明顯減少。由此可見培哚普利改善心肌纖維化很可能與Gal-3的表達(dá)減少有關(guān)。Gal-3 mRNA表達(dá)水平、Gal-3蛋白水平都與LVEF存在負(fù)相關(guān)，這就表明隨著Gal-3水平的下降心功能在逐漸升高。這也反映培哚普利改善心功能很有可能與Gal-3水平降低有關(guān)。由此可見培哚普利在抑制心肌纖維化、減緩心室重構(gòu)過程中與Gal-3的表達(dá)存在很大相關(guān)性。

本研究通過應(yīng)用培哚普利治療心肌梗死后心功能障礙家兔，改善缺血性心力衰竭家兔的心功能，驗(yàn)證了培哚普利減少Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原表達(dá)，抑制心肌纖維化，減緩心室重構(gòu)過程與Gal-3的表達(dá)存在很大相關(guān)性。Gal-3很可能是培哚普利改善心室重構(gòu)作用的一個(gè)新的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步研究。

[1]KALYANASUNDARAM A,LACOMBE V A,BELEVYCH A E,et al.UP-regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+uptake leads to cardiac hypertrophy，contractile dysfunction and early mortality in mice deficient in CASQ2[J].Car Res,2013,98(2):297-306.

[2]BRAMBATTI M,GUERRA F,MATASSINI M V,et al.Cardiac resynchronization therapy improves ejection fraction and cardiac remodelling regardless of patients′age[J].Europace,2013,15(5):704-710.

[3]CHEN P P,PATEL J R,POWERS P A,et al.Dissociation of structural and functional phenotypes in cardiac myosin-binding protein C conditional knockout mice[J].Circulation,2012,126(10):1194-1205.

[4]PSARRAS S,MAVROIDIS M,SANOUDOU D,et al.Regulation of adverse remodelling by osteopontin in agenetic heart failure model[J].Eur Heart J,2012,33(15):1954-1963.

[5]MEIJERS W C,VELDE AR V D,PASCUAL-FIGAL D A,et al.Galectin-3 and post-myocardial infarction cardiac remodeling[J].Eur J Pharmacol,2015,763(Pt A):115-121.

[6]郝瀟，李樹仁，孟田田，等．不同劑量培哚普利對(duì)缺血性心功能障礙家兔心功能及ACE2 /Ang-(1-9) /Ang-(1-7) 軸的影響[J]．中國病理生理雜志，2016，32(3):554-557．

[7]SCHMITTGEN T D,LIVAK K J．Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method[J].Nat Protoc,2008,3(6):1101-1108.

[8]BAUMBACH G L,HEISTAD D D.Remodeling of cerebral arterioles in chronic hypertension[J].Hypertension,1989,13(6):968-972.

[9]DE BOER R A,VAN VELDHUISEN D J,GANSEVOORT R T,et al.The fibrosis marker galectin-3 and outcome in the general population[J].J Intern Med,2012,272(1):55-64.

[10]MCCULLOUGHPA,OLOBATOKE

A,VANHECKE T E.Galectin-3:a novel blood test for the evaluation and management of patients with heart failure[J].Rev Cardiovasc Med,2011,12(4):200-210.

[11]LOK D J,KLIP I T,LOK S I,et al.Incremental prognostic power of novel biomarkers (growth-differentiation factor-15,high-sensitivity C-reactive protein,galectin-3,and high-sensitivity troponin-T) in patients with advanced chronic heart failure[J].Am J Cardiol,2013,112(6):831-837.

[12]WEIR R A,PETRIE C J,MURPHY C A,et al.Galectin-3 and cardiac function in survivors of acute myocardial infarction[J].Circ Heart Fail,2013,6(3):492-498.

[13]CALVIER L,MARTINEZ-MARTINEZ E,MIANA M,et al．The impact of galectin-3 inhibition on aldosterone-induced cardiac and renal injuries[J].JACC Heart Failure,2015,3(1):59-67.

[14]LIN Y H,CHOU C H,WU X U,et al.Aldosterone induced galectin-3 secrtion in vitro:from cells to humans[J].PLoS One,2014,9(9):e95254.

[15]VERGARO G,PRUD′HOMME M,FAZAL L,et al.Inhibition of galectin-3 pathway prevents isoproterenol-induced left ventricular dysfunction and fibrosis in mice[J].Hypertension,2016,67(3):606-612.