補(bǔ)陽還五湯對ApoE基因缺陷小鼠血脂及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊炎癥反應(yīng)的影響

李土明，吳瀅，徐麗英，鐘萍

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，上海 200082

脂質(zhì)代謝異常和炎癥反應(yīng)是動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)形成和發(fā)展的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。炎癥不僅是AS斑塊發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，也是誘發(fā)斑塊不穩(wěn)定的關(guān)鍵因素[1]。脂蛋白相關(guān)磷脂酶A2(Lipoprotein-associated phospholipase A2，Lp-PLA2)被認(rèn)為是動(dòng)脈粥樣硬化過程中調(diào)節(jié)多種炎癥因子和炎癥細(xì)胞的中心物質(zhì)之一，參與了動(dòng)脈粥樣斑塊形成、發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段[2]?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(Matrix Metalloproteinase-9，MMP-9)可通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，使AS斑塊向易損斑塊轉(zhuǎn)化，誘發(fā)斑塊破裂，導(dǎo)致血栓形成及栓塞事件。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為AS的基本特征為本虛標(biāo)實(shí)，臨床以氣虛血瘀證型較為常見，益氣活血治療能明顯降低該病的發(fā)病率、致殘率和病死率[3]。本課題組前期臨床觀察中發(fā)現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯可改善腦梗死患者神經(jīng)功能缺損評分，并可明顯降低炎癥因子超敏C-反應(yīng)蛋白和白細(xì)胞介素-6等水平[4～5]。本研究運(yùn)用益氣活血中藥的名方—補(bǔ)陽還五湯對動(dòng)脈粥樣硬化動(dòng)物模型進(jìn)行干預(yù)，觀察對血脂和炎癥因子Lp-PLA2、MMP-9的影響，以進(jìn)一步探討其抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雄性ApoE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠34只(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司)，SPF級，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(京)2012-0001，體質(zhì)量16～18 g，動(dòng)物合格證號：11400700191696。上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級動(dòng)物房適應(yīng)性喂養(yǎng)2周，室溫保持在22～24℃，相對濕度50%，光照時(shí)間7：00～19：00。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)陽還五湯(藥物組成：黃芪30 g，當(dāng)歸尾12 g，赤芍、川芎、干地龍、紅花、桃仁各6 g)由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房提供，加工成生藥2 g/mL的濃縮液備用。阿托伐他汀(輝瑞制藥有限公司，批號：J26050，規(guī)格20 mg/片)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 采用HITACHI7600-020全自動(dòng)生化分析儀(日本日立公司)檢測總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)和低密度脂蛋白(LDL-C)。Lp-PLA2及MMP-9試劑盒由上海博谷生物科技有限公司提供，用芬蘭Thermo公司全自動(dòng)酶標(biāo)儀(DENLEY DRAGON Wellscan MK 3)進(jìn)行檢測，嚴(yán)格按照說明書要求操作。HE染色主要試劑為蘇木精染液、伊紅染液等(珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。OLYMPUS CX41顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，IMS圖象分析系統(tǒng)(上海基爾頓生物科技有限公司)，離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。

1.4 模型制備 34只ApoE-/-小鼠給予高脂飲食(由基礎(chǔ)飼料80.5%、膽固醇2.0%、豬膽鹽2.5%、蛋黃10.0%、豬油5.0%組成，蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司提供)12周，隨機(jī)處死4只，取主動(dòng)脈根部，10%甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚5 μm，每間隔100 μm連續(xù)取2張切片。常規(guī)HE染色，光鏡下觀察主動(dòng)脈組織動(dòng)脈粥樣硬化病理變化，確定造模成功。

1.5 動(dòng)物分組與給藥 將造模成功小鼠稱重編號，使用隨機(jī)數(shù)字表法按照體質(zhì)量將小鼠隨機(jī)分成模型組、補(bǔ)陽還五湯組、阿托伐他汀組，每組10只。補(bǔ)陽還五湯組給予補(bǔ)陽還五湯20 g/(kg·d)灌胃；阿托伐他汀組給予阿托伐他汀5 mg/(kg·d)灌胃；模型組給予等量生理鹽水，共給藥4周。

1.6 標(biāo)本采集 給藥4周后，于取材前夜禁食，10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血，抗凝，在3 000 r/min離心，0.5 mL血清用作血脂檢測。余血清置于-80℃冰柜保存，以備測定Lp-PLA2及MMP-9水平。

1.7 血脂測定 TC、TG、HDL-C和LDL-C，采用HITACHI7600-020全自動(dòng)生化分析儀測定。

1.8 Lp-PLA2和MMP-9水平測定 采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定。用抗小鼠Lp-PLA2單抗包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品中的Lp-PLA2與單抗結(jié)合，加入生物素化的抗小鼠Lp-PLA2，形成免疫復(fù)合物連接在板上，辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素與生物素結(jié)合，加入底物工作液顯藍(lán)色，最后加終止液硫酸，在450 nm處測OD值，Lp-PLA2濃度與OD值成正比，可通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線求出標(biāo)本中Lp-PLA2濃度。MMP-9測定與Lp-PLA2測定方法基本類似。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.2進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以(±s)表示，組間比較采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間，各組動(dòng)物反應(yīng)靈敏，皮毛色白、致密有光澤，進(jìn)食活躍，活動(dòng)良好。實(shí)驗(yàn)過程各組小鼠均無死亡。

2.2 模型組小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊的觀察 見圖1。HE染色光鏡下可見：主動(dòng)脈根部可以看到明顯的動(dòng)脈粥樣斑塊形成，泡沫細(xì)胞、脂質(zhì)核明顯，纖維帽薄，局部可見巨噬細(xì)胞聚集，血管中膜結(jié)構(gòu)嚴(yán)重破壞，脂質(zhì)侵蝕，萎縮及鈣化，顯示出易損斑塊的特征。

圖1 模型組小鼠主動(dòng)脈組織病理圖片 (×200)

2.3 各組小鼠血脂水平比較 見表1。與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組、阿托伐他汀組TC、TG及LDL-C水平均下降，HDL-C水平升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)義(P＜0.05)。補(bǔ)陽還五湯組血脂指標(biāo)與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表1 各組小鼠血脂水平比較(±s) mmol/L

表1 各組小鼠血脂水平比較(±s) mmol/L

與模型組比較，①P＜0.05

組 別模型組補(bǔ)陽還五湯組阿托伐他汀組n 10 10 10 TC 18.64±2.39 16.57±1.02①15.88±0.91①TG 1.82±0.34 1.44±0.17①1.49±0.12①LD L-C 2.02±0.35 1.31±0.32①1.20±0.43①HD L-C 0.71±0.11 1.50±0.47①1.48±0.51①

2.4 各組小鼠血清Lp-PLA2和MMP-9水平比較與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組、阿托伐他汀組血清Lp-PLA2和MMP-9水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。補(bǔ)陽還五湯組血清 Lp-PLA2和MMP-9水平與阿托伐他汀組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

表2 各組小鼠血清Lp-PLA2和MMP-9水平比較(±s)ng/mL

表2 各組小鼠血清Lp-PLA2和MMP-9水平比較(±s)ng/mL

與模型組比較，①P＜0.05

組 別模型組補(bǔ)陽還五湯組阿托伐他汀組n 10 10 10 Lp-PLA 2 14.50±3.74 8.20±3.58①8.19±2.99①M(fèi) M P-9 314.80±68.11 249.45±60.09①217.16±75.92①

3 討論

ApoE-/-小鼠由于先天體內(nèi)缺少ApoE基因，導(dǎo)致對脂蛋白代謝異常，加以高脂飲食喂養(yǎng)極易形成動(dòng)脈粥樣硬化及自發(fā)性高膽固醇血癥，其動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展包括脂質(zhì)條紋到有纖維帽覆蓋的成熟斑塊等各個(gè)階段，與人類AS斑塊類似，其優(yōu)點(diǎn)是速度更快、質(zhì)量更高、更加接近自然發(fā)生的動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，是目前研究AS斑塊較為理想的動(dòng)物模型[6]。在本實(shí)驗(yàn)中以高脂飼料飼養(yǎng)的ApoE-/-小鼠，主動(dòng)脈根部可見典型動(dòng)脈粥樣斑塊(被纖維帽包裹的粥樣脂質(zhì)核，脂質(zhì)核內(nèi)可見膽固醇結(jié)晶和大量泡沫細(xì)胞)，提示造模成功。

脂質(zhì)代謝紊亂是AS發(fā)病的主要機(jī)制之一，通過降脂治療，血漿膽固醇水平的降低可使斑塊內(nèi)的脂質(zhì)減少，LDL-C的降低使進(jìn)入斑塊內(nèi)的膽固醇下降，HDL-C的升高有利于LDL從血管壁及巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)移，增加斑塊的穩(wěn)定性[7～8]。他汀類藥物可明顯降低LDL-C，升高HDL-C，減輕氧化修飾低密度脂蛋白膽固醇的致AS及細(xì)胞毒性作用，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，臨床上廣泛應(yīng)用于治療缺血性心腦血管疾病。

炎癥細(xì)胞和因子幾乎參與了動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展的全部過程。Lp-PLA2是一種由巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞等在炎癥的刺激作用下產(chǎn)生和分泌的一種磷脂酶，其可以水解低密度脂蛋白(LDL)表面的磷脂甘油支架sn-2位上的乙?；?，生成促炎物質(zhì)溶血卵磷脂(LysoPC)和游離的氧化脂肪酸(oxFA)。這兩種較強(qiáng)的致炎和致動(dòng)脈粥樣硬化因子通過上調(diào)黏附因子、細(xì)胞因子和CD40配體的表達(dá)水平，削弱內(nèi)皮依賴的血管擴(kuò)張功能，同時(shí)刺激巨噬細(xì)胞的增殖和炎癥細(xì)胞的趨化，并產(chǎn)生金屬蛋白酶，最終導(dǎo)致粥樣硬化斑塊的形成[9]。Lp-PLA2在動(dòng)脈粥樣硬化患者體內(nèi)水平升高，且其酶促反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)一步促進(jìn)了動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡的進(jìn)程，使斑塊容易發(fā)生破裂，可以作為預(yù)測斑塊穩(wěn)定性的一個(gè)新的分子學(xué)指標(biāo)[10]。近幾年來，國外指南已明確提出Lp-PLA2可作為卒中或急性動(dòng)脈粥樣硬化高風(fēng)險(xiǎn)者的評估指標(biāo)[11]。MMP-9是一種屬于金屬蛋白酶家族的明膠酶，是一種消化細(xì)胞外基質(zhì)并降解基底膜成分的酶。MMP-9通過降解細(xì)胞外基質(zhì)，可使斑塊表面纖維帽的完整性遭到破壞，使AS斑塊向易損斑塊轉(zhuǎn)化，誘發(fā)斑塊破裂，導(dǎo)致血栓形成及栓塞事件[12]。MMP-9是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定的生化標(biāo)志，血清MMP-9水平越高，斑塊的穩(wěn)定性越低[13]，可以作為降低急性心腦血管事件發(fā)生的潛在治療靶點(diǎn)。

中醫(yī)藥有多成分、多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)、多效應(yīng)，不良反應(yīng)少，協(xié)同作用強(qiáng)和整體調(diào)節(jié)的特點(diǎn)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本虛標(biāo)實(shí)是AS的基本特征，氣虛血瘀是AS的臨床常見證型，益氣活血能明顯改善臨床癥狀。補(bǔ)陽還五湯為益氣活血的代表方劑，藥理研究表明：其能改善微循環(huán)，提高組織耐氧的能力；改變血液流變學(xué)的性質(zhì)，降低血脂；抑制血液凝固，抗血栓形成及預(yù)防血栓再發(fā)；促進(jìn)組織的修復(fù)和再生；抑制膠原纖維的合成，抗組織增生，促進(jìn)增生性病變的轉(zhuǎn)化和吸收；抗血小板聚集、降低纖維蛋白原；抗血栓形成及預(yù)防血栓形成，具有抗AS作用[14]。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)陽還五湯能夠明顯降低TC、TG及LDL-C水平，升高HDL-C水平，具有抗動(dòng)脈粥樣硬化作用；補(bǔ)陽還五湯組能夠明顯降低炎癥因子Lp-PLA2和MMP-9的水平。補(bǔ)陽還五湯具有穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的作用，機(jī)制可能與其能夠加速脂質(zhì)代謝和抗炎性反應(yīng)有關(guān)。

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