不同參數(shù)組合電針對(duì)炎性痛模型大鼠鎮(zhèn)痛效果及炎癥因子的影響

周杰，陳貞羽，龔杰，莊晟堅(jiān)，邵曉梅，方劍喬

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院，浙江 杭州 310005

2.杭州市下城區(qū)人民醫(yī)院，浙江 杭州 310000

3.杭州市蕭山區(qū)中醫(yī)院，浙江 杭州 311201

4.溫州市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 溫州 325000

5.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053

炎性痛是臨床上最常見(jiàn)疼痛類型，如常見(jiàn)的骨關(guān)節(jié)炎、肩周炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等均屬于炎性痛，可以說(shuō)“有炎癥，就有炎性疼痛”，也是世界醫(yī)學(xué)難題之一?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)的主要治療手段是應(yīng)用非甾體抗炎藥消炎鎮(zhèn)痛，然而長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致胃腸道黏連、潰瘍、出血，甚至穿孔等危及生命的副作用[1～2]。電針鎮(zhèn)痛早已是不爭(zhēng)的事實(shí)，電刺激參數(shù)是電針鎮(zhèn)痛起效的關(guān)鍵，但有一份調(diào)查顯示78.4%的中醫(yī)師不清楚應(yīng)用哪種刺激參數(shù)達(dá)到最佳的鎮(zhèn)痛效果[3]。文獻(xiàn)表明，研究人員應(yīng)用不同頻率電針對(duì)疼痛模型動(dòng)物均有明顯的鎮(zhèn)痛作用[4～5]，這讓臨床醫(yī)生無(wú)所適從。課題組前期發(fā)現(xiàn)電針治療慢性疼痛應(yīng)選用頻率為2 Hz、100 Hz的電針，不推薦使用頻率為15 Hz、50 Hz的電針[6]。課題組在前期研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)不同頻率與波寬組合，其鎮(zhèn)痛效應(yīng)有所差別，即頻率為2 Hz時(shí)，波寬選用50 μs鎮(zhèn)痛效果最好，而頻率為100 Hz時(shí)，波寬選用200 μs鎮(zhèn)痛效果最好。本研究選用弗氏完全佐劑致大鼠炎性痛模型[7]，應(yīng)用Master-9電脈沖刺激器，模擬電針儀輸出波形、波寬、頻率、電流等刺激參數(shù)組合，通過(guò)對(duì)炎性痛大鼠行為學(xué)觀察和相關(guān)炎癥因子檢測(cè)，客觀評(píng)價(jià)不同電刺激參數(shù)組合的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，篩選出治療炎性痛的最優(yōu)電針參數(shù)，使其更好地應(yīng)用于臨床，也對(duì)電針儀研發(fā)人員有一定參考意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選用清潔級(jí)健康雄性SD大鼠30只，體質(zhì)量(180±20)g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)為SCXK(滬)2014-0016。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料(由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)及自由攝食與飲水，溫度(25±2)℃，濕度30%～40%，12 h循環(huán)燈光。實(shí)驗(yàn)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。

1.2 儀器和試劑 脈沖刺激器(以色列AMPI公司，型號(hào)Master-9)；電刺激隔離器(以色列AMPI公司，型號(hào)ISO-Flex)；Digital Von Frey測(cè)痛儀(法國(guó)Bioseb公司，型號(hào)BIO-EVF3)。弗氏完全佐劑(美國(guó)Sigma公司)；水合氯醛(上?；瘜W(xué)試劑采購(gòu)供應(yīng)五聯(lián)化工廠 )； IL-β ELISA kit(美 國(guó) Abcam 公 司 )； TNF-α ELISAkit(美國(guó)Abcam公司)。華佗牌無(wú)菌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格0.25 mm×13 mm)。

1.3 分組與模型的制備 將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用SPSS17.0軟件隨機(jī)分為空白組(N組)、模型組(M組)、2 Hz組、100 Hz組、2/100 Hz組，每組6只。大鼠俯臥位，于右后足墊底部碘伏消毒，75%酒精脫碘，取1 mL注射器抽取適量完全弗氏佐劑(Complete Freund's Adjuvant，CFA)，除N組外，其余組別大鼠均在右后足跖皮下按照0.1 mL/只緩慢注射，注射完成后用干棉球按壓以防止出血和CFA的滲出。N組大鼠于右后足跖皮下注射等量的生理鹽水即可。

1.4 電刺激器參數(shù)設(shè)置 (1)2Hz組波形：雙向?qū)ΨQ矩形波；頻率：2 Hz；波寬：50 μs；刺激強(qiáng)度和時(shí)間：1 mA15 min，再2 mA15 min，共30 min。(2)100 Hz組波形：雙向?qū)ΨQ矩形波；頻率：100 Hz；波寬：200 μs；刺激強(qiáng)度和時(shí)間：1 mA 15 min，再2 mA 15 min，共30 min。(3)2/100 Hz組波形：雙向?qū)ΨQ矩形波；頻率：2 Hz持續(xù)3 s，然后100 Hz持續(xù)3 s，兩者自動(dòng)切換；波寬：2 Hz時(shí)，波寬為50 μs，100 Hz時(shí)，波寬為200 μs；刺激強(qiáng)度和時(shí)間：1mA 15 min，再2 mA15 min，共30 min。

1.5 處理與治療 N組不做任何處理，自由活動(dòng)。M組用特制的布套固定，不行針灸干預(yù)；其余各電針干預(yù)組大鼠均選取右側(cè)的足三里穴(膝關(guān)節(jié)后外側(cè)，在腓骨小頭下約5 mm處)和昆侖穴(后肢外踝與跟腱之間的凹陷中)穴(參照華興邦大鼠穴位圖譜)，并用特制的布套固定，選用0.25 mm×13 mm針灸針刺激，導(dǎo)線分別連接Master-9針灸針和脈沖刺激器，刺激器參數(shù)如上所述。每天干預(yù)1次，連續(xù)10天。

1.6 痛閾測(cè)試 本實(shí)驗(yàn)使用EvF(Electronic von Frey)測(cè)量?jī)x檢測(cè)大鼠右后機(jī)械縮足閾值(Paw Withdrawal Thresholds，PWTs)，分別于造模前(Base)，造模后24 h(After CFA)，干預(yù)第1、3、5、7、10天，共7個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，每次測(cè)量時(shí)間不少于5 s，間隔時(shí)間不少于10 s，每只大鼠共測(cè)量3次，取其平均值作為該只大鼠的機(jī)械縮足閾值。

1.7 取材 大鼠干預(yù)第10天結(jié)束后統(tǒng)一處死，用眼科剪剪取大鼠患側(cè)即右后足跖炎癥組織，立即稱重后放入事先預(yù)冷的10 mL離心管中，于-80℃的超低溫冰箱中凍存待用。

1.8 指標(biāo)檢測(cè) 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)足跖炎癥組織白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)。將事先凍存的足跖炎癥組織樣本于冰浴下解凍，將預(yù)配制的PBS溶液，按照樣本重量以1∶9的比例加入離心管中，隨后在冰浴環(huán)境下，使用組織勻漿機(jī)將足跖炎癥組織充分勻漿，然后置于落地高效冷凍離心機(jī)中離心，設(shè)置參數(shù)為：4℃，3 000 rpm，離心10 min，離心后取上清液1 mL于離心管中，-80℃凍存待測(cè)。ELISA樣本檢測(cè)在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心完成。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s)表示，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)；組間兩兩比較，方差齊性時(shí)采用LSD(Least-Significant-Difference)檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Dunnett's T3檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠痛閾檢測(cè)結(jié)果比較 見(jiàn)圖1。造模后24 h，除N組外，其余各組大鼠PWTs均顯著下降(P＜0.01)，提示造模成功。與M組比較，電針刺激干預(yù)后，電針組各時(shí)間點(diǎn)PWTs明顯上升(P＜0.01)。在干預(yù)后第1、3、5天3個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)痛閾后發(fā)現(xiàn)，電針組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)；在電針干預(yù)后第7天，2/100 Hz組大鼠痛閾高于2 Hz組和100 Hz組(P＜0.01)；干預(yù)后第9天，2/100 Hz組和100 Hz組大鼠痛閾高于2 Hz組(P＜0.05，P＜0.01)；干預(yù)后第10天，2/100 Hz組大鼠痛閾高于2 Hz組(P＜0.01)。

圖1 各組大鼠痛閾檢測(cè)結(jié)果比較

2.2 各組大鼠足跖炎癥因子IL-1β含量比較 見(jiàn)表1。與N組比較，M組大鼠足跖炎癥因子IL-1β含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與M組比較，2 Hz組、100 Hz組和2/100 Hz組大鼠足跖炎癥因子IL-1β含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

2.3 各組大鼠足跖炎癥因子TNF-α含量比較 見(jiàn)表2。與N組比較，M組大鼠足跖炎癥因子TNF-α含量顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與M組比較，100 Hz組和2/100 Hz組大鼠足跖炎癥因子TNF-α含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。與2 Hz組比較，100 Hz組和2/100 Hz組大鼠足跖炎癥因子TNF-α含量顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

表1 各組大鼠足跖炎癥因子IL-1β含量比較(±s) pg/mL

表1 各組大鼠足跖炎癥因子IL-1β含量比較(±s) pg/mL

與N組比較，①P＜0.05；與M組比較，②P＜0.05，③P＜0.01

組別N組M組2 H z組100 H z組2/100 H z組n66666 IL-1β 790.08±51.51 1 244.99±68.11①915.14±35.73②833.71±99.27③836.80±149.80③

表2 各組大鼠足跖炎癥因子TNF-α含量比較(±s)pg/mL

表2 各組大鼠足跖炎癥因子TNF-α含量比較(±s)pg/mL

與N組比較，①P＜0.01；與M組比較，②P＜0.01；與2 Hz組比較，③P＜0.05，④P＜0.01

組別N組M組2 H z組100 H z組2/100 H z組n66666 TN F-α 78.87±10.06 160.45±32.99①164.55±12.98 95.14±7.79②③91.22±6.65②④

3 討論

炎性痛是指由創(chuàng)傷、感染以及手術(shù)等引起的外周組織損傷并導(dǎo)致炎癥時(shí)所產(chǎn)生的疼痛，是臨床最常見(jiàn)的病理性疼痛類型，其主要表現(xiàn)為持續(xù)性的痛覺(jué)過(guò)敏。本研究選用的CFA模型能很好地模擬臨床炎性痛過(guò)程，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的研究炎性痛的典型模型[8]。本研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)大鼠在造模后第1天痛閾明顯下降，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束；與此同時(shí)，大鼠足跖炎癥因子明顯高于正常組，說(shuō)明造模成功。

電針廣泛應(yīng)用于各類疼痛性疾病，其鎮(zhèn)痛機(jī)制在于電針刺激信號(hào)與疼痛信號(hào)在神經(jīng)系統(tǒng)相互整合，鑒于目前對(duì)疼痛發(fā)生機(jī)制尚不完全清楚，因此用疼痛行為學(xué)作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)來(lái)研究針刺鎮(zhèn)痛更為合適。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CFA大鼠患側(cè)足PWTs來(lái)反映電針鎮(zhèn)痛效果，研究結(jié)果表明3種參數(shù)組合(2 Hz/50 μs，100 Hz/200 μs及2/100 Hz)電針均有明顯鎮(zhèn)痛效果，且從電針治療起始終優(yōu)于模型組。在電針干預(yù)1周之內(nèi)，無(wú)論是低頻、高頻還是疏密波電刺激，均能提高模型大鼠的痛閾，3組之間無(wú)差異；而電針干預(yù)1周以后，發(fā)現(xiàn)2/100 Hz組大鼠痛閾不同程度優(yōu)于2 Hz組和100 Hz組。由于疼痛的發(fā)生與維持是由不同傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的，因此，筆者認(rèn)為這種差異可能源于不同電刺激信號(hào)可以特異性地激活不同傳導(dǎo)通路，特異性地作用于疼痛的發(fā)生階段或維持階段?？梢?jiàn)病程在1周以內(nèi)選這3個(gè)頻率(2 Hz，100 Hz，2/100 Hz)不影響療效，而治療后期應(yīng)該選2/100 Hz，這提示在臨床治療中，炎性痛病程較長(zhǎng)者應(yīng)選用疏密波來(lái)治療。

IL-1β、TNF-α等炎癥因子在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)過(guò)程中起重要作用。本研究采用ELISA法檢測(cè)大鼠足跖炎癥組織中IL-1β、TNF-α含量，除2Hz組炎癥因子TNF-α含量與模型組無(wú)差異，其余各組均能明顯降低IL-1β、TNF-α含量，這與課題組前期結(jié)果一致[9～10]。研究結(jié)果提示3種參數(shù)組合電針均可降低大鼠足跖炎癥組織因子IL-1β含量，且3組間無(wú)差異。100 Hz組和2/100 Hz組大鼠足跖炎癥因子TNF-α的含量低于模型組和2 Hz組，表明100 Hz和2/100 Hz電針較2 Hz電針治療具有更好的抗炎作用。因此，筆者認(rèn)為100 Hz和2/100 Hz電針鎮(zhèn)痛效果優(yōu)于2 Hz電針可能與前者可以同時(shí)抑制兩種炎癥因子有關(guān)。

考慮到疏密波可以降低實(shí)驗(yàn)對(duì)象或患者對(duì)電針的耐受性，且疏密波可以讓4種阿片肽全部釋放[11]，結(jié)合本研究結(jié)果看，建議電針治療炎性痛時(shí)選用2/100 Hz電針，不推薦使用連續(xù)波電針治療。

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