顯色原位雜交技術在石蠟切片EBER檢測中的應用

王弦

EB病毒（epstein-barr virus，EBV）為人類皰疹病毒第四型的簡稱，是多種惡性腫瘤（如鼻咽癌、NK/T細胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、淋巴上皮瘤樣癌等）的病因之一，主要感染人類口咽部的上皮細胞和B淋巴細胞。EBER是EBV編碼的小RNAs，在EBV感染的細胞中有非常高的拷貝數(shù)，并且在病毒感染的各個時期都有表達[1-5]。

顯色原位雜交技術（chromogenic in situ hybridization，CISH）是以設計與標本中的靶序列互補的探針為基礎，利用堿基互補配對原則，通過雜交、酶標顯色，從而確定標本中是否有目的核酸片段的一種檢測方法。筆者所在單位于2010年開展顯色原位雜交技術檢測石蠟切片中EBER，在此結合其近年的制片工作經(jīng)驗，將本實驗中常見問題及注意事項進行介紹與探討。

1 材料與方法

1.1 材料收集

選取安徽醫(yī)科大學病理學科2014年6月—2016年3月 40例鼻咽部病理活檢組織，2名中級以上職稱病理醫(yī)生閱片，依據(jù)阿克曼外科病理學組織學類型分別為15例鼻咽黏膜慢性炎，25例鼻咽非角化鱗狀細胞癌，以上患者均未接受放射與化學治療。所有標本均經(jīng)10%中性緩沖福爾馬林固定16 h，常規(guī)脫水透明浸蠟，石蠟包埋切片，切片厚度4 μm。

1.2 雜交試劑與設備

顯色原位雜交試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，EBER探針為地高辛標記的RNA探針；雜交儀為美國雅培ThermoBrite原位雜交儀；正電荷黏附載玻片購自江蘇世泰實驗器材有限公司；孵育溫箱購自上海躍進醫(yī)療器械有限公司。

1.3 實驗方法

顯色原位雜交法檢測EBER步驟如下：（1）4 μm石蠟切片，62℃烤片2 h；（2）二甲苯脫蠟，無水酒精處理后干燥；（3）滴加胃蛋白酶工作液（預先配置），37℃消化15～30 min；（4）棄去胃酶，逐級酒精脫水，空氣干燥；（5）滴加探針5～10 μl，加蓋蓋玻片，雜交儀中37℃ 過夜；（6）次日取出切片，置入PBST緩沖液浸泡，直至蓋玻片脫落，PBST沖洗3×3 min；（7）滴加HRP-地高辛抗體，37℃ 30 min，PBST沖洗3×3 min；（8）DAB顯色，適時終止；（9）蘇木素復染細胞核，脫水透明，封片。

2 結果

經(jīng)顯色原位雜交檢測，EBER陽性信號定位于細胞核，染色效果良好，無背景染色。15例鼻咽黏膜慢性炎中有2例EBER呈點狀陽性（陽性率13.3%），25例鼻咽非角化鱗狀細胞癌全部陽性（陽性率100%）。

3 討論

原位雜交技術（in situ hybrization，ISH）是分子病理的一門重要技術。經(jīng)過多年的發(fā)展，原位雜交技術根據(jù)探針標記物的不同，主要分為顯色原位雜交（chromogenic in situ hybridization，CISH），熒光原位雜交（Fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）；根據(jù)所用探針和靶核酸的不同，可分為DNA-DNA雜交，RNA-DNA雜交及RNA-RNA雜交。本文檢測EB病毒所采用是RNA-RNA雜交的顯色原位雜交法。對于臨床病理檢測來說，無論是剛開展此技術的實驗室還是已經(jīng)熟練掌握此技術的單位都應建立自己的質控體系，現(xiàn)將從以下幾個方面對本實驗注意事項進行介紹：

3.1 良好的實驗操作

工作人員具備良好的實驗室經(jīng)驗是完成此項工作的基礎，操作者應具備基本的分子生物學、免疫學和病理學相關知識結構和實踐經(jīng)驗，專人負責，嚴格質控；EBER是EBV編碼的小RNA，具有較高的拷貝數(shù)，大量存在于EBV潛伏感染的細胞核中，其具有穩(wěn)定的二級結構，不像細胞內其他的RNA分子容易降解[6]，所以整個實驗過程與以往科研實驗中涉及RNA的原位雜交有所不同，但不代表完全不需要注意RNA酶的問題，所以整個實驗流程盡量避免皮膚直接接觸切片，應帶口罩、手套進行實驗操作。

3.2 完善的組織固定

對于原位雜交實驗來說，組織固定最主要的目的是最大限度的保存核酸的完整。因此應選擇良好的固定液以及及時有效的固定，建議組織離體以后立即投入中性緩沖福爾馬林液中，固定時間一般需要在12～24 h。

3.3 良好的切片

為防止實驗過程脫片，建議使用防脫載玻片，目前市場上陽離子玻片使用效果良好；同時，切片過程應完整無刀痕，為保證切片中有足夠的EBER核酸拷貝數(shù)，故厚度不能太薄，一般應在3～4 μm。

3.4 組織的烤片及脫蠟

切片烤片溫度應在62～65℃，溫度不宜過高，烤片時間≥2 h，這樣能較好的保證核酸的完整性；脫蠟應徹底，否則影響后期酶的消化以及探針的穿透。

3.5 合理的消化

眾所周知，酶消化的作用是增加組織的通透和增強探針的穿透[7]。本實驗選用的酶是胃蛋白酶，為保證酶的活性，建議臨用臨配，同時應嚴格按照試劑說明，以保證酶的pH值；酶在消化的過程中，針對不同的組織，時間也應有所差別，不可千篇一律[6]。為了保證消化的合理，建議在消化過程中用顯微鏡觀察組織消化程度，當腫瘤細胞出現(xiàn)“荷包蛋”凸起時，方可適時終止消化。

3.6 雜交

雜交是本實驗的關鍵步驟。筆者實驗室所使用的是北京中杉金橋公司生產(chǎn)的EBER原位雜交檢測試劑盒，為提高低拷貝數(shù)病毒的檢出率，防止假陰性結果的出現(xiàn)，建議采用過夜雜交的方式進行，一般雜交時間≥10 h可獲得較好的實驗效果。因本實驗是RNA-RNA雜交，不涉及DNA雙鏈的解旋，因此沒有變性的步驟，所以避免了因變性不徹底導致的雜交效率底的弊端。在滴加探針時，因氣泡的出現(xiàn)會導致組織局部沒有探針覆蓋，故應防止氣泡的產(chǎn)生，可采取將探針滴加在蓋玻片上，然后采用“反吸”的方式；探針的滴加量沒有固定的要求，原則是整張切片完全被探針覆蓋；探針滴加蓋玻片加蓋之后，為防止孵育過程中干片，可以在蓋玻片四周加封橡膠水泥；雜交的過程，建議有條件的單位盡量選擇原位雜交儀進行[8]，原因主要有三個方面：（1）雜交儀操作便捷，相對于恒溫箱而言，條件設定恒定，人為干擾因素較少；（2）雜交儀中的加熱板使切片雜交溫度更均勻和準確；（3）雜交儀是密閉的系統(tǒng)，對于切片雜交的濕度環(huán)境要求和避光環(huán)境非常適合。

3.7 雜交后洗滌及抗體孵育

雜交后洗滌要充分徹底，去除蓋玻片四周的橡膠水泥之后，建議直接放入洗滌液浸泡10～15 min，使蓋玻片自動脫落，這樣可以防止直接揭去蓋玻片時粘去待檢組織；洗滌液采用PBST（PBS+Tween20），Tween20是良好的表面活性劑，可以有效的去除非特異性染色背景；抗地高辛抗體孵育時間和溫度應嚴格把握，時間過久、溫度過高都會產(chǎn)生非特異性背景染色；抗體滴加應充分甩干切片上的緩沖液，緩沖液殘留會稀釋抗體出現(xiàn)假陰性，另外濕盒孵育要防止干片，抗體蒸發(fā)會間接導致抗體濃度提高，出現(xiàn)非特異性染色。

3.8 顯色和蘇木素襯染

抗體采用辣根過氧化物酶標記，顯色時用DAB顯色劑，顯色時間應在顯微鏡下控制，避免因顯色時間過久產(chǎn)生背景染色；由于EBER陽性定位在細胞核，所以蘇木素襯染不應過深，否則影響會覆蓋陽性信號，影響判讀。

3.9 對照的設立

在正確實驗操作的基礎上，建議每一張切片都附上陽性質控對照，可以選用日常工作中積累的已經(jīng)確定的陽性蠟塊，也可以采用液態(tài)陽性對照[9]。

綜上所述，顯色原位雜交技術檢測石蠟切片中EBER是目前診斷EB病毒感染的最有效、最準確的方法，我們在實驗中須準確掌握實驗原理、把握實驗技巧、優(yōu)化實驗流程及設置合理對照，才能制作出良好的切片，為診斷提供有效依據(jù)。

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