HLA抗原特異性記憶B細胞在器官移植臨床的應用

李代紅，姚遠，趙一賀（.天津市第一中心醫(yī)院，天津 3009；.北京博富瑞基因診斷技術(shù)有限公司，北京 0076）

慢性腎功能衰竭（chronic kidney disease，CRF）是指由各種原因引起腎臟損傷，體積明顯萎縮，且已不能維持腎臟基本功能的病癥。CRF惡化至終末期時被稱為尿毒癥，此時藥物治療已無效，只有通過腎移植才能根治。目前我國有超過100萬名尿毒癥患者，但每年只有1萬名患者可以進行腎移植手術(shù)，許多等待或不能進行腎移植手術(shù)的患者只能不斷進行血液透析等替代治療來延續(xù)生命，不少患者在等待腎源過程中死亡。面對我國如此稀缺的腎臟資源，如何通過優(yōu)化腎臟資源選取，減少尿毒癥重癥患者腎源的等待時間，提高移植腎存活率，一直是臨床醫(yī)生最為關(guān)注的問題。

多年臨床實踐表明，大多數(shù)（＞80%）受體接受具有一個或多個人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）錯配的移植物，其最終失敗與產(chǎn)生針對錯配供體HLA的供體特異性人類白細胞抗原抗體（donor-specific human leukocyte antigenalloantibodies，DSA）相關(guān)，其介導各類排斥反應，如超急性排斥反應、急性排斥反應、加速性排斥反應和慢性排斥反應［1-2］。近年來，隨著新型強效免疫抑制劑的臨床運用，腎移植的成功率明顯提高［3］，但由HLA抗體介導的體液免疫排斥反應（antibody-mediated rejection，AMR）仍影響著移植后的人腎存活率。

隨著檢測技術(shù)的進步，HLA抗體的檢測已由原來的補體依賴的微量淋巴細胞毒實驗［4］（complement dependent cytotoxicity，CDC）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）［5-6］和流式細胞術(shù)［7-8］發(fā)展為現(xiàn)在的基于Luminex平臺的微球分析法［9-10］，對HLA抗體檢測的靈敏性已滿足臨床需求。近年來利用以上方法對受體外周血DSA的檢測可以很好地預測移植后發(fā)生抗體介導的排斥反應和移植腎失功的風險［11-12］，但隨著臨床經(jīng)驗的積累和免疫學科的不斷發(fā)展，不少學者認為受體DSA水平不能直接代表其免疫狀態(tài)，因為其低估了記憶性B細胞對體液排斥反應的影響［13］。研究表明，當機體對某一蛋白抗原進行免疫響應時，將會同時產(chǎn)生漿細胞和記憶性B細胞。長壽漿細胞可以持續(xù)產(chǎn)生高親和性的抗體結(jié)合抗原，給予機體免疫保護，當機體再次遇到相同抗原時，記憶性B細胞可以迅速分化成長壽漿細胞和短壽漿細胞，瞬間增加機體的特異性抗體濃度［14］。在器官移植中，有兩種不同的情況，記憶性B細胞可能起關(guān)鍵作用：① 在慢性AMR的情況下，其中持續(xù)活化的記憶性B細胞導致與免疫抑制暴露不足相關(guān)的低度但進行性DSA形成，② 在高度致敏的患者中，接受含有先前由宿主識別的同種異體抗原的新移植物，從而觸發(fā)快速且在抗原再次暴露后強烈的繼發(fā)性DSA應答［15］?；谝陨蠗l件，我們發(fā)現(xiàn)供體特異性HLA記憶性B細胞對移植后抗體排斥反應的風險評估、優(yōu)化受體腎源選擇及減少受體等待時間具有重要的臨床意義。

1 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀

1.1 記憶性B細胞的研究進展：免疫記憶是高等脊椎動物獲得性免疫應答的顯著特征。體液免疫應答與細胞免疫應答是免疫記憶的兩大分支。記憶性B細胞是一類具有記憶功能并持續(xù)存在于宿主體內(nèi)的細胞，由成熟的初始B細胞通過抗原激活分化而來。當記憶性B細胞再次遇到相同抗原時，該細胞可迅速增殖并分化為漿細胞，以此產(chǎn)生高親和力的抗原特異性抗體，介導體液免疫應答，保護機體免受再次入侵抗原的感染［14］。

體液免疫的基本功能是抗體產(chǎn)生和抗體記憶。在感染、接種疫苗或是輸血、妊娠、移植后，通過B細胞受體（B cell receptor，BCR）對外來抗原的識別，成熟的初始B細胞會被激活，并分化為記憶性B細胞和漿細胞，使機體獲得免疫記憶功能［16］。維持機體免疫記憶功能的細胞主要是記憶性B細胞和長壽漿細胞，且這種免疫記憶的維持是不依賴于抗原的［17］。長壽漿細胞定居于骨髓中，能夠分泌抗體，低水平表達或不表達BCR，不能被刺激分化，也不能加速抗體產(chǎn)生。長壽漿細胞在抗原被清除后的一段時間內(nèi)仍可以持續(xù)釋放高水平的中和性抗體。記憶性B細胞則大部分在外周血中循環(huán)，小部分定居于次級淋巴組織和骨髓中，表達高親和力的BCR，但不自主分泌抗體。研究表明，當機體再次接觸相同抗原時，機體為了更有效清除入侵的非己物質(zhì)，IgG+B細胞可被快速活化，并增殖分化為產(chǎn)生高滴度、高親和力IgG抗體的分泌型細胞［16］。此外，記憶性B細胞除了分化為漿細胞產(chǎn)生抗體外，還可通過產(chǎn)生細胞因子或提呈抗原給T細胞，抵抗非己物質(zhì)的入侵［18］。

在初次免疫應答期間，存在兩種不同類型的記憶性B細胞在抗原再激發(fā)過程中表現(xiàn)出不同的功能：IgG+記憶性B細胞優(yōu)先分化成漿母細胞，而IgM+記憶性B細胞增殖更多并進入生發(fā)中心反應［15］。

1.2 記憶性B細胞體外檢測方法的研究進展：如何活化誘導記憶性B細胞在體外增殖是檢測、研究其生理特性首先要面臨的問題。因此，為精確評估HLA抗原特異性記憶B細胞在器官移植中的作用，需探索建立快速有效的B細胞活化方法。

經(jīng)典的初始B細胞活化途徑包括B細胞與抗原特異性結(jié)合以及抗原特異性T、B淋巴細胞的相互識別。但研究表明，記憶性B細胞的功能特性與初始B細胞存在差異，且活化方式也并不一致。因此，非抗原依賴的記憶性B細胞的活化增殖方案成為新的探索方向。研究發(fā)現(xiàn)，非抗原依賴的多克隆刺激劑CpG（cytosine-phosphate-guanine）、PWM（pokeweed mitogen） 和 SAC（staphylococcus aureus cowan）聯(lián)合誘導記憶性B細胞分化為抗體分泌細胞（antibody-secreting cells，ASC）［19］。而對于多種細胞因子的聯(lián)合應用，如CpG + CD40L +IL-2 + IL-10 + IL-15和R848 + IL-2的體外培養(yǎng)模型中，記憶性B細胞則更有效地分化為ASC，并分泌大量的IgM或IgG［20-21］。

目前已有多種使外周血記憶性B細胞增殖分化為ASC并產(chǎn)生相關(guān)抗體的成熟體外培養(yǎng)方案。但對于記憶性B細胞的活化卻只是一種非特異性的多克隆激活方式，并分泌多克隆抗體［22-23］。如何從眾多活化的記憶性B細胞中篩選出針對某種抗原的抗原特異性記憶B細胞依然是臨床亟待解決的問題。此前，國外已有不少器官移植相關(guān)試驗通過體外表達純化的HLA抗原蛋白或用商業(yè)化的HLAⅠ類位點和Ⅱ類位點抗原混合物為抗原，通過酶聯(lián)免疫斑點試 驗（enzyme linked immunospot，ELISPOT） 檢 測HLA抗原特異性記憶B細胞的含量［24-25］。ELISPOT法測量HLA抗原特異性記憶B細胞雖然靈敏度高，但操作較為繁瑣，耗時較長，且只能檢測患者是否存在HLA 抗原特異性記憶B細胞，并不能明確HLA抗原特異性記憶B細胞的HLA致敏位點。最近，隨著Luminex平臺技術(shù)的發(fā)展，HLA抗體檢測試劑盒的不斷成熟，國外已有實驗室用商品化的HLA抗體檢測試劑盒檢測刺激培養(yǎng)后的記憶性B細胞上清中的抗HLA抗體含量［26］。此方法雖然靈敏度不如ELISPOT法，但操作簡單、耗時小，且能準確知道HLA抗原特異性記憶B細胞的HLA致敏位點，現(xiàn)已被國外多家實驗室接受。

但基于Luminex平臺技術(shù)和HLA抗體檢測試劑盒（Luminex-single antigen bead，Luminex-SAB）發(fā)展起來的HLA抗原特異性記憶B細胞的檢測仍然存在以下缺陷：① HLA抗體檢測試劑盒中的HLA抗原是體外合成的，未必能反映體內(nèi)真實的抗原抗體結(jié)合反應；② HLA抗體檢測試劑盒只能通過檢測熒光強度大致反映患者由記憶性B細胞分泌出來HLA抗體的多少，既不能非常準確地分析檢測樣品中HLA抗體濃度也不能分析出樣品中HLA抗原特異性記憶B細胞的數(shù)量，遠不能達到定量分析患者體內(nèi)HLA抗原特異性記憶B細胞的水平，較難作為臨床診斷指標。

隨著記憶性B細胞研究的進一步深入，荷蘭萊頓醫(yī)學院免疫血液及輸血科建立了一種基于ELISPOT的定量檢測供體特異性記憶B細胞的方法［27］。該方法主要通過植物血凝素（phytohaemagglutinin，PHA）刺激供體外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），使PBMC持續(xù)分化，細胞中的HLA抗原含量上升，然后通過HLAⅠ類抗體和HLAⅡ類抗體獲取供體HLA抗原。并利用這一供體特異性的HLA抗原與患者的記憶性B細胞進行孵育，最終通過ELISPOT方法定量檢測出患者體內(nèi)含有供體HLA特異性記憶B細胞的數(shù)量。通過這一方法檢測患者的HLA抗原特異性記憶B細胞，無論是靈敏性、精確性還是可靠性都優(yōu)于Luminex-SAB檢測技術(shù)，但因為其要對供體細胞進行數(shù)日的誘導分化，使其在腎移植的臨床運用受到限制，目前只能用于活體移植中。

2 HLA抗原特異性記憶B細胞在腎移植臨床中的應用與前景

記憶性B細胞作為機體體液免疫的重要成員，在器官移植的免疫排斥反應中起到重要作用，國外不少實驗室已開始對HLA抗原特異性記憶B細胞指標在腎移植中的臨床應用進行了研究。

巴塞羅那醫(yī)學院腎臟內(nèi)科對10例腎移植術(shù)后發(fā)生AMR的患者進行回顧性分析發(fā)現(xiàn)［28］，其中5例患者術(shù)前外周血群體反應性抗體（panel reactive antibodies，PRA）檢測為陰性，5例患者為可疑陽性。但當他們利用Luminex-SAB方法檢測患者HLA抗原特異性記憶B細胞時發(fā)現(xiàn)，9例患者都顯示為陽性。該回顧性試驗表明，患者外周血HLA抗體含量可能受患者當時免疫狀態(tài)或免疫抑制劑等影響，含量變化較大，其濃度不能等同于患者此時相對應HLA抗原的免疫狀態(tài)。而HLA抗原特異性B細胞作為HLA抗體的上游細胞，能更為準確地預示患者針對于特定HLA位點發(fā)生排斥反應的風險。 進一步對等待移植患者血清HLA抗體和記憶性B細胞的檢測發(fā)現(xiàn)，30.8%（42/136）HLA抗體MFI＜1 500的患者，體內(nèi)均存有HLA抗原特異性記憶B細胞。

荷蘭萊頓大學醫(yī)學院輸血及免疫科對39例腎移植術(shù)前PRA陽性的患者進行分析［26］，研究發(fā)現(xiàn)，抗原特異性記憶B細胞的出現(xiàn)與患者所經(jīng)歷的免疫事件大小與次數(shù)相關(guān)。如只接受過輸血的患者，雖然體內(nèi)預存有HLA抗體，但只有較少幾率產(chǎn)生HLA抗原特異性記憶B細胞，而只經(jīng)歷過妊娠或移植的患者，產(chǎn)生HLA抗原特異性記憶B細胞的幾率也不高于60%，但當患者同時經(jīng)歷過輸血、妊娠及移植，則幾乎必然會產(chǎn)生HLA抗原特異性記憶B細胞。另外，相關(guān)的臨床研究表明，利用HLA抗體檢測試劑盒測量患者外周血PRA時，因為入侵物抗原與HLA抗原相近等原因，獲得的假陽性位點較多，不利于腎源選擇，但利用Luminex-SAB法檢測患者HLA抗原特異性記憶B細胞時，出現(xiàn)的HLA陽性位點較少，且HLA陽性位點均具有相同的致敏表位，利于供體腎源的選擇。以上臨床結(jié)果對我院腎移植?？频呐R床指導意義重大，每年在我院等待腎移植患者中，PRA陽性患者高達100人，這類患者往往等待腎源的時間較長，還有部分PRA高陽性患者因為等待不到合適的腎源而死亡。如果部分PRA陽性患者只單獨接受過輸血，其產(chǎn)生抗原特異性記憶B細胞幾率較少，術(shù)前可以只需接受血漿置換或免疫吸附將HLA抗體濃度降低到安全水平即可，不需過分考慮腎源的配對問題，大幅度降低患者等待腎源的時間。但以上結(jié)論獲得所依賴的病例數(shù)較少，且外周血PRA檢測陽性而記憶B細胞上清PRA檢測陰性的HLA位點是否會給移植帶來排斥反應的風險，還需要進一步的臨床試驗去驗證。

綜上所述，近幾年來國外多個腎移植實驗室已陸續(xù)開展HLA抗原特異性記憶B細胞相關(guān)的臨床試驗。現(xiàn)已表明，抗原特異性記憶B細胞在優(yōu)化腎源選擇，預示術(shù)后排斥風險上具有重要的臨床意義。但其研究和運用時間尚短，還需要更多的臨床病例信息明確術(shù)后患者產(chǎn)生AMR是否與其預存HLA抗原特異性記憶B細胞相關(guān)，明確記憶性B細胞是否在腎移植各階段含量是否穩(wěn)定，是否可以作為一個穩(wěn)定指標指導臨床診斷，明確輸血、妊娠、移植等免疫事件對HLA抗原特異性記憶B細胞產(chǎn)生的關(guān)系。最終為我們進一步運用抗原特異性記憶B細胞作為臨床指標提供理論依據(jù)。