四逆散對(duì)心理應(yīng)激肝郁證模型大鼠ERK1/2-CREB信號(hào)通路的影響*

王瑞婷 ，王雅楠 ，，宋殿榮 ，孟文曼 ，郭 潔 ，姜 晶 ，張繼雯 ，許春月

心理應(yīng)激是指機(jī)體在某種環(huán)境刺激作用下由于客觀要求和應(yīng)對(duì)能力不平衡所產(chǎn)生的一種適應(yīng)環(huán)境的緊張反應(yīng)狀態(tài)[1]。刺激過強(qiáng)、時(shí)間過長(zhǎng)的不良應(yīng)激可導(dǎo)致神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。手術(shù)作為一種應(yīng)激源，可導(dǎo)致患者一系列不良應(yīng)激反應(yīng)發(fā)生。課題組前期對(duì)1 283例因婦科良性腫瘤擇期手術(shù)患者臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，婦科術(shù)前患者中不良心理應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生率為64.15%，其中62.21%為肝氣郁結(jié)證[2]，四逆散可調(diào)節(jié)術(shù)前不良心理應(yīng)激激素和神經(jīng)遞質(zhì)的紊亂[3]。為進(jìn)一步探討四逆散改善心理應(yīng)激肝郁證的作用及其機(jī)制，本研究采用慢性束縛制動(dòng)結(jié)合孤養(yǎng)的方法制備心理應(yīng)激肝郁證大鼠模型，通過觀察四逆散對(duì)大鼠血漿和腦脊液應(yīng)激相關(guān)激素、神經(jīng)遞質(zhì)及海馬和下丘腦部位細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）1/2-cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白（CREB）信號(hào)通路關(guān)鍵分子及c-fos mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)的影響，試圖闡明四逆散通過ERK1/2-CREB信號(hào)通路改善心理應(yīng)激肝郁證的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 健康雄性SD大鼠，級(jí)別SPF/VAF，體質(zhì)量（190～210）g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所提供，許可證號(hào)為SCX K（軍）2014-0001。

1.2 藥物 四逆散顆粒劑（柴胡、白芍、枳實(shí)、炙甘草各10 g，北京康仁堂藥業(yè)有限公司），艾司唑侖（1 mg/片，山東信誼制藥有限公司）。

1.3 主要試劑 半定量PCR試劑盒和山羊抗兔IgG（H＋L）二抗（Promega公司）。絲裂原活性蛋白激酶激酶 1/2（MEK1/2）、ERK1/2、CREB、c-fos 及內(nèi)參GAPDH的特異性引物（由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)與合成），兔抗鼠p-MEK1/2一抗（abcam公司），兔抗鼠p-ERK1/2一抗、兔抗鼠p-CREB一抗、兔抗鼠c-fos一抗、兔抗鼠GAPDH一抗（Millipore公司），促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH）、促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）和5-羥色胺（5-HT）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海藍(lán)基生物科技有限公司）。

1.4 主要儀器 高架十字迷宮及分析系統(tǒng)（SLY-ETS型），北京碩林苑科技有限公司；自制大鼠束縛筒；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀（GF-M3000型），山東高密彩虹分析儀器有限公司；PCR擴(kuò)增儀（PCRSystem9700），Gene Amp公司；水平電泳儀（cavoy）；垂直電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（DYCZ-24DN型）；BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)（YQ-602BR1104型），美國(guó)伯樂公司。

1.5 方法

1.5.1 心理應(yīng)激肝郁證模型的建立及分組 將120只大鼠正常飼養(yǎng)、自由飲食、適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型空白組、四逆散組、艾司唑侖組各30只。應(yīng)用慢性束縛制動(dòng)結(jié)合孤養(yǎng)的方法制備心理應(yīng)激肝郁證大鼠模型[4]：將大鼠依次放入自制的束縛筒內(nèi)（筒長(zhǎng)約20 cm，筒口內(nèi)徑最寬處5.5 cm，最窄處2.2 cm），通過移動(dòng)閘門而逐步縮小大鼠的活動(dòng)空間，調(diào)節(jié)到其不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度，每日束縛制動(dòng)1次，持續(xù)時(shí)間由第1天3 h，以后每次增加30 min，連續(xù)21 d。造模大鼠在束縛制動(dòng)期間禁食、禁水，其余時(shí)間放出，自由飲食。正常對(duì)照組不予任何干預(yù)，自由飲食，每籠5只。根據(jù)造模前后大鼠一般狀態(tài)、體質(zhì)量增長(zhǎng)情況、高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證心理應(yīng)激肝郁證模型成功。

1.5.2 給藥 大鼠給藥劑量按人與動(dòng)物體表面積折算[5]，給藥劑量=臨床常用量×動(dòng)物等效劑量系數(shù)（大鼠與人的等效劑量系數(shù)為0.018），灌胃容積10 mL/kg。四逆散組給予四逆散混懸液3.6 g/（kg·d）灌胃，艾司唑侖組給予艾司唑侖溶液0.36 mg/（kg·d）灌胃，模型空白組給予生理鹽水灌胃，均自造模結(jié)束后第3天開始灌胃，2 mL/次，每日1次，連續(xù)5 d，正常對(duì)照組不予任何干預(yù)。

1.5.3 取材 于末次給藥24 h后處死大鼠。取各組10只大鼠，股動(dòng)脈采血 3 mL，4℃，3 000 r/min，離心15 min，取血漿，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ「鹘M10只大鼠，枕骨大孔直接穿刺法取腦脊液100～200μL，-20℃保存?zhèn)溆谩Ｈ「鹘M10只大鼠，經(jīng)0.1 mol PBS心臟灌注后取全腦，迅速分離出海馬及下丘腦組織放入凍存管中，放入液氮中速凍后，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.4 ELISA法檢測(cè)血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE和5-HT的含量 采用ELISA法測(cè)定大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE和5-HT含量。

1.5.5 半定量PCR法檢測(cè)海馬和下丘腦MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fosmRNA的表達(dá) RNeasy Plus Mini試劑盒一步法分別提取各組大鼠海馬和下丘腦組織總RNA，采用紫外分光光度儀測(cè)總RNA的濃度、純度，采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的完整性，以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠掃描拍攝系統(tǒng)掃描后，運(yùn)用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定光密度值，目的基因與內(nèi)參條帶光密度值的比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。PCR反應(yīng)體系：GoTap Green Master Mix2X 12.5μL，上游引物 10μmol/L 2μL，下游引物10μmol/L 2μL，cDNA模板4μL，無核酸酶水補(bǔ)至終體積25μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性（94℃4min），變性（94℃45 s），退火（56℃45 s），延伸（72℃ 45 s），30個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 引物序列表Tab.1 Primer sequence table

1.5.6 Western blot法檢測(cè)海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 及 c-fos蛋白的表達(dá) 提取各組大鼠海馬和下丘腦組織總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。各取50μg蛋白，按照4∶1體積加入5×蛋白上樣緩沖液，煮沸5 min，蛋白變性后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后，根據(jù)蛋白分子大小進(jìn)行切膠，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及內(nèi)參 GAPDH蛋白分別用Western封閉液室溫封閉90 min后，分別加入一抗（兔抗鼠p-MEK1/2抗體、p-ERK1/2抗體、p-CREB抗體、GAPDH抗體按1∶1 000稀釋，兔抗鼠c-fos抗體按 1∶2 000稀釋），4℃孵育過夜，Western洗滌液洗膜5次，10 min/次。加入二抗（山羊抗兔IgG（H＋L）按 1∶5 000 稀釋），室溫水平搖床孵育 60 min，Western洗滌液洗膜5次，10 min/次。經(jīng)過ECL曝光顯色，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)攝像掃描后，運(yùn)用Image J圖像分析系統(tǒng)測(cè)定條帶灰度值，采用目的蛋白與內(nèi)參條帶灰度值的比值作為結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 運(yùn)用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心理應(yīng)激肝郁證模型的建立

2.1.1 大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況 與正常對(duì)照組比較，造模組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表 2。

表2 兩組大鼠體質(zhì)量增加量（與造模前體質(zhì)量的差值，x±s）Tab.2 Body weight of rats（the difference before modeling,x±s）g

2.1.2 大鼠一般狀態(tài)的變化 正常對(duì)照組和造模組大鼠造模前一般狀態(tài)均正常：精神狀態(tài)良好，反應(yīng)活躍，情緒狀態(tài)正常，皮毛光順潤(rùn)澤，飲食睡眠正常，糞便呈球形或橄欖球形，干稀適中。造模結(jié)束后，正常對(duì)照組一般狀態(tài)正常，造模組精神倦怠，反應(yīng)遲緩，情緒低落，皮毛枯槁，飲食減少，嗜睡，大便稀溏。

2.1.3 大鼠高架十字迷宮實(shí)驗(yàn) 正常對(duì)照組大鼠造模前后高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模組大鼠，與造模前比較，造模后進(jìn)入開放臂次數(shù)百分比（OE%）及時(shí)間百分比（OT%）均明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。造模后進(jìn)入閉合臂次數(shù)百分比（CE%）和閉合臂時(shí)間百分比（CT%）明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組大鼠造模前后高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果（x±s）Tab.3 Resultsof thedesign of theelevated crosslabyrinth experiment beforeand after modeling(x±s)%

2.2 各組大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE和5-HT的含量 與正常對(duì)照組比較，模型空白組血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE水平明顯升高，5-HT的水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型空白組比較，四逆散組和艾司唑侖組均能明顯降低血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE的水平，升高5-HT的水平，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4、表5。

2.3 各組大鼠海馬及下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fos mRNA的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型空白組大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREBmRNA 的表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。與模型空白組比較，四逆散組和艾司唑侖組大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB mRNA 的表達(dá)明顯增加（P＜0.05）。各組大鼠間海馬和下丘腦部位c-fosmRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 6、圖 1。

2.4 各組大鼠海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及c-fos蛋白的表達(dá) 與正常對(duì)照組比較，模型空白組大鼠海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達(dá)明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與模型空白組比較，四逆散組和艾司唑侖組大鼠海馬和下丘腦部位p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達(dá)明顯增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。各組大鼠間海馬和下丘腦部位c-fos蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 7、圖 2。

表4 各組大鼠血漿E、NE、CRH、ACTH和5-HT的含量(x±s)Tab.4 Levels of CRH,ACTH,E,NE and 5-HT in plasma(x±s)pg/mL

3 討論

肝郁證與現(xiàn)代心理應(yīng)激密切相關(guān)，均屬于情志致病的范疇，且都表現(xiàn)出神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)(NIM)功能的紊亂，疏肝方藥可通過調(diào)節(jié)心理應(yīng)激相關(guān)激素及神經(jīng)遞質(zhì)的水平改善肝郁證的作用[6-7]。肝主疏泄，能夠調(diào)節(jié)氣機(jī)、調(diào)暢情志、調(diào)和氣血，是臟腑組織器官的調(diào)節(jié)中心。四逆散首載于《傷寒論》，由柴胡、白芍、枳實(shí)、炙甘草組成，具有疏肝理脾、透邪解郁、調(diào)和胃氣的作用。課題組前期通過臨床研究發(fā)現(xiàn)四逆散能夠降低術(shù)前心理應(yīng)激肝郁證患者的 CRH、ACTH、COR、E、NE、白介素-2（IL-2）含量，升高多巴胺（DA）、5-HT的含量，明顯改善術(shù)前心理應(yīng)激肝郁證患者的心理和軀體癥狀[3]。

表5 各組大鼠腦脊液E、NE、CRH、ACTH和5-HT的含量(x±s)Tab.5 Levelsof E,NE,CRH,ACTH and 5-HT in cerebrospinal fluid(x±s)pg/mL

表6 各組大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fosmRNA的表達(dá)(x±s)Tab.6 Expression of MEK1/2,ERK1/2,CREB and c-fos mRNA in the hippocampusand hypothalamus(x±s)

圖1 各組大鼠海馬和下丘腦MEK1/2、ERK1/2、CREB及c-fosmRNA的表達(dá)Fig.1 Expression of MEK1/2,ERK1/2,CREB and c-fos mRNA in the hippocampus and hypothalamus

表7 各組大鼠海馬和下丘腦p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及c-fos蛋白的表達(dá)(x±s)Tab.7 Expression of p-MEK1/2,p-ERK1/2,p-CREB and c-fos protein in the hippocampusand hypothalamus(x±s)

圖2 各組大鼠海馬和下丘腦p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB及c-fos蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of p-MEK1/2,p-ERK1/2,p-CREB and c-fos protein in the hippocampusand hypothalamus

本研究采用慢性束縛制動(dòng)結(jié)合孤養(yǎng)的方法制備心理應(yīng)激肝郁證大鼠模型，研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激刺激可升高大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE水平，降低5-HT的水平。四逆散及艾司唑侖均能降低模型大鼠血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE的水平，升高5-HT的水平，改善模型大鼠肝郁狀態(tài)。

下丘腦為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的中心，海馬富含各種信使受體，其中糖皮質(zhì)激素受體（GR）與HPA軸功能亢進(jìn)釋放的大量糖皮質(zhì)激素結(jié)合，導(dǎo)致海馬GR減少，海馬神經(jīng)元損傷，對(duì)HPA軸的負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用減弱，使HPA軸處于持續(xù)亢進(jìn)狀態(tài)[8]。因此抑制海馬和下丘腦神經(jīng)元應(yīng)激性損傷，恢復(fù)海馬和下丘腦功能是調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌平衡，調(diào)節(jié)情志的方法之一。ERK是一種蛋白酶細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，C REB是一種調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)，CREB可通過ERK信號(hào)通路的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)激活，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)元細(xì)胞存活、增殖、凋亡、修復(fù)的過程[9]。細(xì)胞受到刺激后通過連續(xù)的磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)（Ras/Raf/MEK/ERK）激活ERK1/2，活化的ERK1/2放大信號(hào)并將信號(hào)從細(xì)胞膜傳導(dǎo)到細(xì)胞核中，使細(xì)胞核中的CREB蛋白磷酸化，p-CREB結(jié)合于DNA的特定部位并調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄。CREB可通過CREB蛋白與c-fos基因啟動(dòng)子區(qū)的cAMP反應(yīng)元件（CRE）位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)c-fos基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[10]，與腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BD NF）基因啟動(dòng)子區(qū)CRE位點(diǎn)結(jié)合，對(duì)BDNF基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[11]。大量研究表明ERK/CREB信號(hào)通路在心理應(yīng)激性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用，心理應(yīng)激狀態(tài)下，ERK/CREB信號(hào)通路受到抑制，ERK、CREB的磷酸化水平下調(diào)，而不同的抗抑郁治療可通過上調(diào)ERK、CREB磷酸化水平達(dá)到抗抑郁的作用[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)心理應(yīng)激大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB mRNA及p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達(dá)明顯降低，四逆散和艾司唑侖均能夠上調(diào)肝郁證大鼠海馬和下丘腦部位MEK1/2、ERK1/2、CREB mRNA及p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-CREB 蛋白的表達(dá)，從而改善模型大鼠肝郁狀態(tài)。

c-fos是參與細(xì)胞最早功能活動(dòng)的基因，在細(xì)胞受到外部刺激后最先表達(dá)，被作為神經(jīng)元活動(dòng)的標(biāo)志。在生理狀態(tài)下c-fos基因在細(xì)胞內(nèi)包括神經(jīng)元中呈較低水平表達(dá)，當(dāng)受到刺激時(shí)，可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中c-fos基因快速、急劇、靈敏的表達(dá)[14]。促皮質(zhì)激素釋放激素（CRF）是c-fos的下游靶基因，應(yīng)激發(fā)生時(shí)下丘腦首先被激活，下丘腦室旁核部位的c-fos作為第三信使調(diào)節(jié)CRF的表達(dá)，啟動(dòng)HPA軸，進(jìn)而影響與應(yīng)激有關(guān)的神經(jīng)內(nèi)分泌免疫活動(dòng)[15]。而c-fos基因的表達(dá)具有時(shí)效性，目前對(duì)慢性應(yīng)激刺激時(shí)c-fos表達(dá)的研究觀點(diǎn)不一，Matsuda等[16]研究顯示慢性應(yīng)激可以誘導(dǎo)c-fos持續(xù)表達(dá)。劉昊等[17]研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激結(jié)束后0.5h c-fos蛋白及mRNA的表達(dá)明顯升高，之后呈下降趨勢(shì)，4 h時(shí)恢復(fù)正常。宋倩[18]則研究發(fā)現(xiàn)，慢性應(yīng)激減少了小鼠海馬區(qū)、前腦皮層及下丘腦室旁核c-fos的表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，各組大鼠海馬和下丘腦部位c-fos的表達(dá)無明顯變化。

綜上所述，四逆散改善心理應(yīng)激肝郁證，可能與降低血漿和腦脊液CRH、ACTH、E、NE的水平，升高5-HT水平有關(guān)，其機(jī)制可能與上調(diào)ERK1/2-CREB信號(hào)通路的活動(dòng)有關(guān)，可能通過激活此信號(hào)通路磷酸化過程促進(jìn)神經(jīng)元應(yīng)激性損傷的修復(fù)而發(fā)揮抗肝郁作用。

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