蚓激酶的提取工藝改進(jìn)研究*

涂清波，蘇鵬亮，林 穎，陸冬鶯，王賽男，馬宇凡，徐 丹

蚓激酶又稱蚯蚓纖溶酶，1983年由Mihara等[1]首次從蚯蚓中提取分離出來。2010版藥典標(biāo)準(zhǔn)定義為：系人工養(yǎng)殖的赤子愛勝蚓中提取制備的一組蛋白水解酶。分子量20～40 KD、等電點3～5，在60℃以下非常穩(wěn)定，最適活性在pH7～9。兼有激酶和纖溶酶兩種作用，可直接水解纖維蛋白和凝血因子Ⅰ，選擇性激活血塊纖溶酶原，抑制血栓素等，為第三代溶栓藥，具有溶栓作用強、不良反應(yīng)小、患者易耐受、半衰期長等特點[2-5]。目前制備蚓激酶的方法主要是從新鮮蚯蚓中經(jīng)硫酸胺沉淀法粗分離和葡聚糖凝膠-離子交換層析法的純化得到蚓激酶，缺點是在生產(chǎn)上使用大量的硫酸胺，后處理除鹽非常困難，工業(yè)除鹽的主要方法為透析層析等，導(dǎo)致操作工藝復(fù)雜、周期延長、活性下降[6-9]。本文以蚓激酶活性為指標(biāo)對提取工藝進(jìn)行改進(jìn)。

1 材料

1.1 儀器 2-16型冷凍離心機（Sigma公司）；分部收集器（上海滬西分析儀器廠）；DS-1高速組織搗碎機（上海右一儀器有限公司）；冷凍干燥機（上海豫明儀器有限公司）；電子分析天平和pH計（梅特勒托利多儀器有限公司）。

1.2 藥材、對照品與試劑 赤子愛勝蚓（匯豐蚯蚓養(yǎng)殖基地）；Sephadex G-75和DEAE-Sepharose FF（上海安妍生物有限公司）；蚓激酶，凝血酶和牛血纖維蛋白原對照品（中檢所）；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 酶活測定

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 取蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品，加0.9%氯化鈉溶液制成濃度分別為1 mL中含10 000、8 000、6 000、4 000、2 000 單位的溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品適量，加0.9%氯化鈉溶液稀釋成標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的濃度。測定法：將已加熱的瓊脂糖溶液39 mL，纖維蛋白原溶液39 mL和凝血酶3 mL，混勻，倒入直徑14 cm的培養(yǎng)皿中，室溫放置1 h，打孔進(jìn)樣。每孔加樣品10μL，于37℃恒溫放置18 h。測量溶圈的面積。以蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品單位數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，蚓激酶標(biāo)準(zhǔn)品溶圈兩垂直直徑乘積的對數(shù)為縱坐標(biāo)，計算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。將供試品溶圈兩垂直直徑乘積的對數(shù)代入回歸方程Y=1.211X+1.566（R2=0.995），計算供試品效價單位數(shù)[10]。

2.1.3 蛋白含量 取本品約20 mg，精密稱定，照氮測定法，將結(jié)果乘以6.25，即為供試品中蛋白含量，并計算每1 mg供試品中的蛋白毫克數(shù)。比活力=每1 mg供試品中效價單位數(shù)/每1 mg供試品中蛋白的毫克數(shù)

2.2 提取方法的選擇 蚓激酶主要提取方法有[7-9]：生理鹽水提取法，蔗糖溶液提取法，乙醇提取法和緩沖液提取法。本實驗以酶活為指標(biāo)對此4種方法進(jìn)行考察。提取流程為：取20 g經(jīng)洗凈泥土和清水浸泡2 h的新鮮蚯蚓，勻漿，常溫下加2倍量不同提取溶劑（0.9%氯化鈉溶液，10%蔗糖溶液，75%乙醇溶液，pH 7.8磷酸緩沖溶液）勻漿20 min后，10000 r/min低溫離心，上層清液過透析袋（35 KD）透析，得到蚓激酶母液，檢測酶活。由表1可知，緩沖液提取法提取蚓激酶活性較佳。

表1 蚓激酶的提取Tab.1 Extraction of lumbrokinas μ/mg

2.3 粗分離方法的選擇 蚓激酶粗分離的主要方法有[9-10]：熱沉淀法，乙醇沉淀法，丙酮沉淀法和硫酸胺沉淀法。以酶活為指標(biāo)對此4種方法進(jìn)行考察。

2.3.1 熱沉淀法 將蚓激酶母液在60℃保溫1 h，離心，上清液冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.2 硫酸胺沉淀法 將蚓激酶母液加硫酸胺調(diào)至飽和度70%，放冰箱冷藏過夜，離心，沉淀物透析除鹽，冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.3 丙酮沉淀法 將蚓激酶母液加入一定量冷丙酮析出，放冰箱冷藏過夜，離心，沉淀物冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

2.3.4 乙醇沉淀法 將蚓激酶母液加入一定量冷乙醇析出，放冰箱冷藏過夜，離心，沉淀物冷凍干燥得到蚓激酶粗酶。

由表2可知，硫酸胺沉淀法，丙酮沉淀法和乙醇沉淀法粗分離效果較佳，但硫酸胺法需要透析除鹽，時間周期長；丙酮為低閃點溶劑，不適合工業(yè)化生產(chǎn)；乙醇為第3類溶劑且成本低易回收，故選用乙醇沉淀法。

2.4 乙醇沉淀法的改進(jìn) 乙醇沉淀法是根據(jù)乙醇使蚓激酶母液的介電常數(shù)降低，增加了兩個相反電荷基團之間的吸引力，促使酶析出，酶活主要影響因素為乙醇含量。

2.4.1 乙醇含量因素考察 按照乙醇沉淀法，考察乙醇含量為30%、45%、60%、75%、90%對酶活的影響。由表3可知，蚓激酶的活性隨乙醇含量增大而提高，說明乙醇含量越大蚓激酶析出越多。低乙醇含量時活性小于母液，說明低乙醇含量時雜蛋白析出較多。在45%～60%時上升坡度最大，75%～90%時趨于最大點，說明45%時析出雜蛋白最多，75%時析出蚓激酶最多。

表2 蚓激酶的粗分離Tab.2 Coarseseparation of lumbrokinas μ/mg

表3 乙醇沉淀法中乙醇含量的影響Tab.3 Effect of alcohol precipitation on wineaccuracy μ/mg

2.4.2 乙醇分級沉淀法 將乙醇投入蚓激酶母液中，控制乙醇含量為45%，冷藏過夜后離心，取上清液用乙醇繼續(xù)調(diào)節(jié)乙醇含量75%，冷藏過夜后離心，沉淀物冷凍干燥得到蚓激酶粗酶，酶活為7 438μ/mg，優(yōu)于改進(jìn)前乙醇沉淀法及其他3種分離方法。

2.5 粗酶純化方法的改進(jìn) 蚓激酶的純化工藝主要是先后經(jīng)葡聚糖凝膠層析和離子交換層析和親和層析等，層析柱用的最多的是Sephadex G-25，Sephadex G-75 和 DEAE-Cellucose-52，DEAESepharose FF。

2.5.1 純化方法的選擇 將粗酶用pH7.8磷酸緩沖液溶解，過葡聚糖凝膠柱（16 mm×960 mm），緩沖液淋洗，活性組分的洗脫液再過離子交換層析柱（16 mm×200 mm），先用0.1 mol/L的食鹽水淋洗，再用0.1～0.6 mol/L食鹽水進(jìn)行梯度洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得到蚓激酶。如表4所示，Sephadex G-75與DEAE-Sepharose FF層析方法的純化效果較好。

表4 粗酶的純化Tab.4 Purification of crude enzyme μ/mg

2.5.2 純化工藝的改進(jìn) 調(diào)換層析工序，將凝膠層析放到離子交換層析的后面進(jìn)行。流程為將粗酶用pH7.8磷酸緩沖液溶解，過DEAE-Sepharose FF（16 mm×200 mm），先用0.1 mol/L的食鹽水淋洗，再用0.1～0.6 mol/L食鹽水進(jìn)行梯度洗脫，活性組分的洗脫液再過 Sephadex G-75（16 mm×960 mm），用清水洗脫，收集洗脫液，冷凍干燥得到蚓激酶，酶活為 28 000μ/mg。

3 討論

以赤子愛勝蚓為原料，采用的緩沖液提取、乙醇分級沉淀、離子交換層析、葡聚糖凝膠層析、干燥等工序，制得蚓激酶比活為28 000μ/mg，優(yōu)于舊工藝。

乙醇分級沉淀法是根據(jù)不同濃度的乙醇具有析出不同蛋白質(zhì)的原理，從分離后蚓激酶的活性來看，進(jìn)一步說明了低濃度乙醇會析出大量雜質(zhì)，高濃度則析出蚓激酶。本文經(jīng)單因素實驗粗略選取了乙醇含量為45%作為析出雜質(zhì)最優(yōu)點和乙醇含量為75%作為析出蚓激酶最優(yōu)點，未考察交叉因素的影響，經(jīng)優(yōu)化實驗設(shè)計可進(jìn)一步得出最佳工藝。

蚓激酶的分子量為20～40 KD，Sephadex G-75和DEAE-Sepharose FF的分離范圍為3～80 KD，從結(jié)果上可以看出，純化Sephadex G-25和DEAECellucose-52對蚓激酶的純化。凝膠層析具有脫鹽純化的作用，將Sephadex G-75放到最后有利于酶的純化。

目前工業(yè)生產(chǎn)蚓激酶的方法主要參照權(quán)利專利CN102242099B，經(jīng)提取、超濾、硫酸胺沉淀、Sephadex G-25和DEAE-Cellucose-52分離制備，本法無需鹽析、超濾、透析等繁瑣而長周期工序，簡化了操作步驟，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

[1]Mihara H,Sumi H,Akazawa T,et al.Fibrinolytic enzyme extracted fromtheearthworm[J].Thromb Haemost,1983,50(2):258.

[2] 李菁華，趙 偉.蚯蚓纖溶酶的分離純化研究[J].中國生化藥物雜志,2005,26(5):288-291.

[3] Kotb E.Biotechnological potential of fibrinolytic enzymes in the dissolution of endogenous blood thrombi[J].Biotechnol Progr,2014,30(3):656-672.

[4] 黃 瑛.蚓激酶及其在心血管疾病中的研究進(jìn)展[J].中國醫(yī)藥指南,2012,10(2):64-65.

[5] 吳梧桐.酶類藥物學(xué)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2011:455-459.

[6] 馬廣智,王高鋒,梁學(xué)世,等.一種高活性蚓激酶的制備方法[P].中國專利：201110103216.7，2011,04，25

[7] 謝德芳.蚓激酶的分離純化、酶學(xué)性質(zhì)及體外模擬消化的研究[D].武漢:武漢輕工大學(xué),2013:2-8.

[8] 鄭 慧.蚓激酶提取分離工藝的研究[D].太原:山西醫(yī)科大學(xué),2014:4-26.

[9] 劉向輝,戈 峰.蚯蚓纖溶酶活性影響因子的研究[J].中國中藥雜志,2002,27(6):423-426.

[10]李 婷,楊 駿,張 彤.多指標(biāo)綜合評分法優(yōu)選地龍水提純化工藝[J].中國新藥雜志,2016(19):2255-2261.