鹿芪方對(duì)高血壓合并心力衰竭大鼠血壓、血管緊張素-醛固酮和心肌膠原纖維的影響*

劉 茜，周 華，瞿惠燕，戎靖楓，封 舟，王 詠

心力衰竭（CHF）是由于各種原因的初始心肌損傷引起心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，是心臟疾病的終末階段。近年來(lái)，其發(fā)病率和病死率逐步上升。中國(guó)對(duì)35～74歲城鄉(xiāng)居民共15 518人隨機(jī)抽樣調(diào)查的結(jié)果：CHF患病率為0.9%，按計(jì)算約有400萬(wàn)CHF患者，其中男性為0.7%，女性為1.0%[1]。2011年澳大利亞及新西蘭心臟病學(xué)會(huì)制定的指南中通過(guò)循證醫(yī)學(xué)證據(jù)顯示，高血壓是導(dǎo)致CHF最主要的病因之一[2]。

CHF伴隨的神經(jīng)內(nèi)分泌的激活導(dǎo)致血管緊張素Ⅰ（AngⅠ）、血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）、醛固酮（ALD）含量增多，心肌纖維化則加重心肌重構(gòu)。根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)顯示，鹿芪方可明顯改善CHF患者的心臟功能。本實(shí)驗(yàn)中，筆者通過(guò)觀察鹿芪方高、中、低劑量組對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄后CHF大鼠血壓、AngⅠ、AngⅡ、ALD、心肌膠原纖維的影響，研究其對(duì)CHF大鼠的作用機(jī)制，為中醫(yī)藥防治心力衰竭提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性SD大鼠54只，購(gòu)自上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 藥品和儀器 藥品：黃芪、黨參、紅花、葶藶子、桂枝、鹿角粉，按 30∶15∶9∶15∶9∶2 組方，將除鹿角粉以外所有的生藥共5.59 kg加10倍量水，浸泡30 min，煎煮45 min，過(guò)濾，收集濾液。藥渣繼續(xù)加8倍量水，煎煮30 min，過(guò)濾，收集濾液。濾液合并，濃縮至1∶1，作為常規(guī)水提藥液，加入鹿角粉，0.14 kg。以上中藥浸膏均由上海中醫(yī)藥大學(xué)原創(chuàng)科技提供。培哚普利（片劑），過(guò)100目篩后置于雙蒸水，制成37 mg/mL濃度的培哚普利混懸液，由施維雅制藥有限公司提供，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20034053。大鼠AngⅠ檢測(cè)試劑盒（南京建成科技有限公司），產(chǎn)品批號(hào)：H185。大鼠AngⅡ檢測(cè)試劑盒（南京建成科技有限公司），產(chǎn)品批號(hào)：H185。大鼠ALD檢測(cè)試劑盒（南京建成科技有限公司），產(chǎn)品批號(hào)：H188。電子天平（S artorius公司）；PowerLab8/30生物信號(hào)處理和分析系統(tǒng)（Adinstruments公司）；IKA-werkeTyp VX2E震蕩器（IKA公司）；Direct-Q3純水系統(tǒng)（Millipore公司）；Hettich D-78532型高速離心機(jī)（德國(guó)Hettich公司）；大鼠尾動(dòng)脈血壓儀BP-3006A型（上海軟隆公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；苦味酸天狼猩紅染液（曙光醫(yī)院肝病研究所）。

1.2 方法

1.2.1 高血壓CHF模型的建立 根據(jù)Doering等[3]報(bào)道的方法行腹主動(dòng)脈縮窄術(shù)：平均體質(zhì)量為220 g（200～230 g）的SD大鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉（1.5 mL/kg體質(zhì)量）麻醉，仰臥固定后，腹部常規(guī)處理,沿膈以下2 cm處切開皮膚和肌肉，打開腹腔找到腹主動(dòng)脈并分離，將外徑為0.7 mm的穿刺針?lè)庞诟怪鲃?dòng)脈旁，用4號(hào)絲線在左腎動(dòng)脈開口上方約5 mm處將腹主動(dòng)脈和穿刺針一起結(jié)扎，然后將穿刺針抽出，使結(jié)扎處動(dòng)脈處于部分結(jié)扎狀態(tài)，縮窄程度60%～70%。此種高血壓模型4周后收縮壓＞140 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa，下同）為造模成功[4-5]。假手術(shù)組不縮窄腹主動(dòng)脈，余操作同前。各組大鼠于造模成功后灌胃，10周后測(cè)量血壓并留取靜脈血，同時(shí)開胸留取心肌組織于-80℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 高血壓合并CHF大鼠分組及給藥方法 動(dòng)物喂養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)合成飼料，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d。造模成功后隨機(jī)分組如下：1）模型組。2）假手術(shù)組。3）雅施達(dá)組。4）鹿芪方高劑量組。5）鹿芪方中劑量組。6）鹿芪方低劑量組。每組大鼠各8只，體質(zhì)量340～390 g。1）模型組、假手術(shù)組：蒸餾水1.0 mL/（kg·d）灌胃；2）雅施達(dá)組：雅施達(dá)混懸液0.37 mg/（kg·d）灌胃；3）鹿芪方高劑量組：14.56 g/（kg·d）灌胃；4）鹿芪方中劑量組：7.28 g/（kg·d）灌胃；5）鹿芪方低劑量組：3.64 g/（kg·d）灌胃。

1.2.3 血壓測(cè)定 參考文獻(xiàn)[6-7]，予3%戊巴比妥鈉1.17 mL/kg腹腔麻醉大鼠，用大鼠尾巴固定裝置固定大鼠左前肢，通過(guò)應(yīng)用尾動(dòng)脈血壓儀（BP-2006A型）測(cè)定血壓和心率。每個(gè)動(dòng)物測(cè)5～7次，取其中3個(gè)較接近的血壓值平均后作為最終的測(cè)量數(shù)據(jù)。測(cè)壓時(shí)間固定為上午9：00—11:00。分別于造模前、造模4周后、10周后各測(cè)定1次。

1.2.4 血清AngⅠ、AngⅡ、ALD指標(biāo)測(cè)定 從頸總動(dòng)脈插管處留取血樣本，靜置2 h后以2 500 r/min離心20 min，收集血清。采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)血清 AngⅠ、AngⅡ、ALD濃度，操作步驟參照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。在波長(zhǎng)450 nm的酶標(biāo)儀上讀取各孔吸光度（OD值），通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中大鼠AngⅠ、AngⅡ、ALD濃度。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀察 將所取心臟組織置于10%甲醛溶液中固定，行石蠟包埋，切片、苦味酸天狼星紅染色，光鏡下觀察心臟組織膠原纖維。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，計(jì)量資料滿足正態(tài)性以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，計(jì)量資料呈偏態(tài)分布則以M（P25，P75）表示。組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

腹主動(dòng)脈縮窄造模術(shù)中共死亡6只大鼠，治療前模型組、假手術(shù)組、雅施達(dá)組、鹿芪方低劑量組、中劑量組、高劑量組各8只。模型組于造模后CHF死亡1只；雅施達(dá)組、鹿芪方中劑量組于治療中各死亡1只，鹿芪方低劑量組于治療中死亡2只。

2.1 鹿芪方對(duì)高血壓合并CHF大鼠血壓的影響 造模前，各組在收縮壓和舒張壓方面無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。說(shuō)明造模前各組基線一致。4周后，假手術(shù)組大鼠收縮壓和舒張壓與造模前相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。模型組、雅施達(dá)組和鹿芪方高、中、低劑量組大鼠收縮壓和舒張壓與造模前相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）。其中，假手術(shù)組大鼠在收縮壓和舒張壓方面與模型組、雅施達(dá)組和鹿芪方高、中、低劑量組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。見表1。

表1 造模前與造模4周后大鼠收縮壓、舒張壓的變化（x±s）Tab.1 Thechangesof systolic pressureand diastolic pressurein ratsbeforeand after modeling for 4 weeks（x±s）

高血壓后CHF組大鼠予鹿芪方高、中、低劑量干預(yù)8周，與模型組相比，鹿芪方各組及雅施達(dá)組均能有效降低CHF大鼠的收縮壓（P＜0.05）。在降低收縮壓方面，鹿芪方高劑量與中劑量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但優(yōu)于低劑量（P＜0.05），提示隨劑量增加，鹿芪方降低收縮壓的效能有所增強(qiáng)。在舒張壓方面，雅施達(dá)組與模型組相比能降低舒張壓（P＜0.05），鹿芪方各劑量組與模型組相比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但鹿芪方各劑量組優(yōu)于模型組。鹿芪方各劑量組與雅施達(dá)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表 2。

表2 治療后高血壓合并CHF大鼠血壓的變化（x±s）Tab.2 Thechangesof blood pressurein hypertensiverats with heart failureafter treatment（x±s）

2.2 鹿芪方對(duì)高血壓合并CHF大鼠AngⅠ、AngⅡ、ALD的影響 與模型組相比，鹿芪方高、中、低劑量組及雅施達(dá)組均能有效降低AngⅠ、AngⅡ及AL D（P＜0.05）。其中，在改善AngⅠ方面，鹿芪方各組之間、鹿芪方與雅施達(dá)組之間未顯示出差異（P＞0.05）。在改善AngⅡ方面，鹿芪方各組之間未顯示出差異（P＞0.05），各組療效均不及雅施達(dá)組（P＜0.05）。在改善ALD方面，鹿芪方高劑量組明顯優(yōu)于低劑量組（P＜0.01），與鹿芪方中劑量組無(wú)差異（P＞0.05），與雅施達(dá)組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

2.3 鹿芪方對(duì)高血壓合并CHF大鼠心肌膠原纖維的觀察 苦味酸-天狼星紅染色：鏡下觀察，膠原纖維呈紅色，其他部分呈淡黃色，假手術(shù)組大鼠心肌膠原纖維分布均勻、排列整齊、集合成束。模型組心肌膠原纖維明顯增多，分布不均，排列紊亂，粗大的膠原纖維互相交錯(cuò)成網(wǎng)狀。與假手術(shù)相比，鹿芪方高、中、低劑量、雅施達(dá)組均可見心肌膠原纖維數(shù)量增多，排列紊亂，但程度均較模型組減輕，其中鹿芪方高劑量組、雅施達(dá)組程度最輕。見圖1。

模型組：心肌膠原纖維明顯增多，分布不均，排列紊亂，粗大的膠原纖維互相交錯(cuò)成網(wǎng)狀。假手術(shù)組：心肌膠原纖維分布均勻、排列整齊、集合成束。雅施達(dá)組：心肌膠原纖維稍增多，排列略紊亂，膠原纖維集合成束。鹿芪方高劑量組：心肌膠原纖維稍增多，排列略紊亂，膠原纖維集合成束。鹿芪方中劑量組：心肌膠原纖維增多，排列較紊亂，膠原纖維少量互相交錯(cuò)成網(wǎng)狀。鹿芪方低劑量組：心肌膠原纖維增多，排列紊亂，部分膠原纖維互相交錯(cuò)成網(wǎng)狀。

3 討論

CHF涉及到中醫(yī)的心痹、心悸、飲證、喘證、水腫等病證范疇。在CHF晚期，主要表現(xiàn)為心腎陽(yáng)虛。有臨床及實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)[8-9]在治療CHF上應(yīng)強(qiáng)調(diào)心腎相交，心本乎腎，以溫腎求強(qiáng)心。所謂“治心之所以治腎，而治腎之所以治心”。心之陽(yáng)氣全賴腎陽(yáng)的資助。腎陽(yáng)虛可波及于心，引起心陽(yáng)虛。本病為本虛標(biāo)實(shí)，而本虛以氣虛、陽(yáng)虛為主。病位雖主要在心，但與腎的關(guān)系尤為密切[10]。本方來(lái)源于周華教授臨床治療慢性CHF經(jīng)驗(yàn)方鹿芪方，通過(guò)溫補(bǔ)腎陽(yáng)，溫腎益氣使心陽(yáng)得到溫煦；通過(guò)活血利水，使心血瘀阻得通，水液潴留得利。在鹿芪方中，鹿角味咸，性溫，乃血肉有情之品?！兑幏謩吩唬骸叭肽I經(jīng)，兼入心、肝二經(jīng)?！本哂醒a(bǔ)腎壯陽(yáng)、補(bǔ)益精血，使腎氣有根，上通于心，心氣亦足。上海曙光醫(yī)院長(zhǎng)久以來(lái)通過(guò)研究鹿角系列制劑的臨床及科研作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)，以鹿角為君藥的制劑能顯著改善患者及大鼠的心功能，增強(qiáng)心肌收縮力，使冠狀動(dòng)脈的血流得以改善；還能改善心肌重構(gòu)，調(diào)節(jié)心肌能量代謝，延緩CHF的進(jìn)程[11-12]。紅花與鹿角共奏溫通心脈，溫陽(yáng)活血之功。桂枝與黃芪、黨參合用，既助君藥溫陽(yáng)通脈，又具有強(qiáng)大的益氣功效。葶藶子能瀉肺降氣，祛痰平喘，利水消腫。

表3 治療后高血壓合并CHF大鼠AngⅠ、AngⅡ和ALD的變化M（P25，P75）Tab.3 The changesof AngⅠ，AngⅡ and aldosteronein hypertensive ratswith heart failure after treatment M（P25，P75）

圖1 苦味酸-天狼星紅染色Fig.1 Picrosiriusred staining

高血壓以體循環(huán)動(dòng)脈壓升高為主，長(zhǎng)期高血壓會(huì)導(dǎo)致左室壓力負(fù)荷增加，心肌肥厚和重塑，進(jìn)而出現(xiàn)CHF。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鹿芪方各組及雅施達(dá)組均能有效降低CHF大鼠的收縮壓，鹿芪方高劑量組與中劑量組均優(yōu)于低劑量組，提示隨劑量增加，鹿芪方降低收縮壓的療效有所提高。在降低舒張壓方面，鹿芪方各劑量組與模型組相比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但鹿芪方各劑量組均優(yōu)于模型組。

CHF是一個(gè)漸進(jìn)性疾病，其嚴(yán)重之處在于病理過(guò)程的不可逆性，而心室重構(gòu)是其重要機(jī)制。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）激活被認(rèn)為是CHF發(fā)生發(fā)展最核心的機(jī)制。血管緊張素包括AngⅠ和AngⅡ，AngⅡ分泌增加可促進(jìn)心肌纖維化，與心室重構(gòu)和心功能損傷密切相關(guān)[13]。王振濤等[14]對(duì)CHF模型大鼠的研究發(fā)現(xiàn)，降低AngⅡ活性可抑制其內(nèi)分泌和旁分泌，從而改善心功能。醛固酮（ALD）可引起水鈉潴留，促進(jìn)成纖維細(xì)胞合成膠原纖維，最終導(dǎo)致心室重構(gòu)[15]。因此，通過(guò)調(diào)控RAAS相關(guān)因子可有效干預(yù)心室重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)中，鹿芪方各劑量組和雅施達(dá)組大鼠AngⅠ、AngⅡ、ALD含量明顯低于模型組，可見鹿芪方在一定程度上能抑制RAAS系統(tǒng)，改善心室重構(gòu)，總體而言鹿芪方高劑量組療效較中、低劑量組顯著。

心肌纖維化在CHF后期的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，包括成纖維細(xì)胞的增多和細(xì)胞外基質(zhì)的增加。心臟膠原纖維是典型的心肌纖維化標(biāo)志物[16]。通過(guò)對(duì)大鼠心肌苦味酸-天狼星紅染色的觀察發(fā)現(xiàn)，鹿芪方各劑量組和雅施達(dá)組的膠原含量明顯低于模型組。鹿芪方高劑量組要優(yōu)于中、低劑量組。由此可見，鹿芪方能抑制膠原的增生，改善心肌纖維化，抑制心室重構(gòu)，從而延緩CHF的進(jìn)程。此療效呈劑量依賴性。

綜上所述，鹿芪方在降低血壓、改善CHF心肌受損方面有一定的療效，能抑制RAAS系統(tǒng)活性，延緩高血壓合并CHF大鼠的心肌重構(gòu)從而延緩CHF的進(jìn)程。因此，鹿芪方在CHF的進(jìn)展過(guò)程中能起到一定的防治作用，其前景廣闊。

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