白酒大曲微生物酶系研究進展

申孟林,張 超,王玉霞*,王 娟,蔡 馨,邢 蓮,楊 茂

(1.宜賓學(xué)院 生命科學(xué)與食品工程學(xué)院,四川 宜賓 644000；2.西華大學(xué) 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院,四川 成都 610039；3.宜賓學(xué)院 固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室,四川 宜賓 644000)

中國白酒是世界著名的六大蒸餾酒之一,是一種以谷物為原料、酒曲為糖化發(fā)酵劑、采用雙邊或固態(tài)糖化發(fā)酵生產(chǎn)的酯香濃郁的蒸餾酒［1］。我國絕大多數(shù)名優(yōu)白酒都是添加大曲進行發(fā)酵。大曲是以小麥、大麥、豌豆等為原料,經(jīng)過自然接種發(fā)酵、含有多種菌群和酶類的起酵劑［2］。大曲既是白酒釀造過程中的重要物質(zhì),也是白酒釀造中必不可少的糖化、發(fā)酵、酒化劑和生香劑［3］。大曲中豐富的微生物種群及功能酶系,在釀酒體系中自由流通,成為酒體質(zhì)量、產(chǎn)量的重要保證［4］。

目前,在白酒品質(zhì)與大曲質(zhì)量的關(guān)系、白酒大曲中酶系等方面的研究,使人們對白酒大曲有了更加深入而具體地認(rèn)識。對大曲中各種酶類開展廣泛地研究,有助于深化對大曲糖化力、發(fā)酵力和風(fēng)味生成相關(guān)酶系等方面的認(rèn)識。目前關(guān)于大曲的研究主要集中在特定酶活力測定［5-8］和各類微生物組成分析［9-10］等方面。大曲中微生物種群組成的多樣性,使得微生物來源的各類酶系也極為復(fù)雜。不同微生物來源的酶以及酶學(xué)特性不同,在白酒釀造過程中所起的作用也不盡相同。大曲發(fā)酵過程中,一種微生物能夠產(chǎn)生多類酶,而一類酶也可以來自不同類別的多種微生物菌群,這就使得大曲中酶的研究,極具挑戰(zhàn)性。對大曲中酶類研究較多的有糖化酶、液化酶、酸性蛋白酶、酯化酶等,并以此作為評價大曲發(fā)酵性能的重要指標(biāo)［11-12］。本文闡述大曲中主要微生物類群及酶類研究現(xiàn)狀,從而更加準(zhǔn)確的調(diào)控白酒風(fēng)味物質(zhì)及產(chǎn)品品質(zhì),在傳統(tǒng)工藝基礎(chǔ)上,以期為制作更加優(yōu)質(zhì)的大曲奠定理論基礎(chǔ),進而提高白酒釀造工藝水平。

1 大曲中微生物分類

大曲是通過自然接種來自原料、培曲環(huán)境中各種微生物而發(fā)酵制成的,因此大曲中含有極為豐富的微生物菌群,是多種微生物的混合體系,主要包含霉菌、細菌和酵母菌三大類,此外也包含少量放線菌,但其功能尚不明確［13］。

1.1 酵母菌

大曲中的酵母主要包含有釀酒酵母、產(chǎn)酯酵母、假絲酵母等。酵母菌在大曲酒發(fā)酵過程中發(fā)揮著兩個重要作用即酒化與酯化［14］,大曲中酵母屬酵母、漢遜酵母能產(chǎn)生具有較強活力的酒化酶,該酶可以使葡萄糖經(jīng)糖酵解途徑(embden meyerhof pathway,EMP)代謝轉(zhuǎn)化為白酒最重要的物質(zhì)基礎(chǔ)—乙醇［15］；產(chǎn)酯酵母主要包括假絲酵母和漢遜酵母,其具有較強的酯合成能力,酯類物質(zhì)可賦予酒類水果香,其機理已被相關(guān)學(xué)者所報道［16-17］。李紅等［18］從茅臺酒廠釀酒車間分離選育出一株高產(chǎn)酒精酵母,擁有較強的發(fā)酵力,適合應(yīng)用于淀粉質(zhì)原料的釀酒。陳美竹［19］通過對醬香型白酒高溫大曲和多輪次酒醅進行研究,其研究結(jié)果表明,醬香型白酒生產(chǎn)中的酵母擁有產(chǎn)酒、產(chǎn)香和產(chǎn)多元醇的多種能力。酵母菌在大曲酒釀造過程中既能保證發(fā)酵的原動力,也能提供豐富酯類及醇類物質(zhì),對酒體的完美與豐滿度起著重要作用。

1.2 霉菌

大曲中的霉菌主要有曲霉(黑曲霉、紅曲霉、黃曲霉、米曲霉)、根霉、毛霉、頭霉、青霉等。由于霉菌形態(tài)獨特,起初生長最常見的是白或灰白的顏色,隨著孢子進一步生長,會出現(xiàn)綠、黃、青、橙等各種顏色,進而形成“五色衣”,生產(chǎn)中常以此作為大曲質(zhì)量的感官評定的依據(jù)［4］。霉菌在大曲糖化力、液化力、酯化力等方面發(fā)揮重要作用,其在大曲中的種類、數(shù)量對大曲質(zhì)量起著決定性影響。

黑曲霉是一類重要的工業(yè)微生物,在酶制劑、異源蛋白、有機酸等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［20-21］。黑曲霉能產(chǎn)生α-淀粉酶、過氧化氫酶、纖維素酶、α-半乳糖苷酶、β-葡萄糖酶、糖化酶、葡萄糖氧化酶、β-葡萄糖苷酶、半纖維素酶、橙皮苷酶、脂肪酶、柚苷酶、果膠酶、單寧酶等［22］。武赟等［23］研究了具有較強的纖維素酶產(chǎn)生能力的黑曲霉,此纖維素酶可以較好地分解原料中大量的纖維素類基質(zhì),進而大幅度提高釀酒原料的利用率。紅曲霉具有產(chǎn)生多種功能酶的能力,不僅能代謝產(chǎn)生酯化酶,還能產(chǎn)生果膠酶、蛋白酶、纖維素酶、糖化酶等。周靖等［24］利用傳統(tǒng)微生物分離的方法,采用傳統(tǒng)微生物分離手段從醬香型大曲內(nèi)分離出了兩株鑒定為紅曲霉屬的菌株MZ-1和MZ-2,均具有良好的糖化酶及酯化酶活力。不同種類的紅曲霉菌株所產(chǎn)酶的類型及產(chǎn)量差別很大,因此在大曲酒釀造過程中具有極高的實用價值。

根霉產(chǎn)糖化酶、液化酶(淀粉酶)能力強,能將淀粉高效率地轉(zhuǎn)化為葡萄糖［25］。根霉屬中以米根霉為代表,具有高產(chǎn)糖化型淀粉酶的能力［26］。糖化型淀粉酶能破壞原料中淀粉的α-1,4和α-1,6糖苷鍵,從而將絕大多數(shù)淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)榭砂l(fā)酵性糖(如葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖等［27］)。除此之外,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),米根霉不僅能在發(fā)酵過程中產(chǎn)生大量芳香性成分(如乙酸乙酯、丙酸乙酯、正丙醇、3-甲基丁醇、乙醛等),米根霉細胞還具有代謝產(chǎn)生乳酸等獨特有機酸酶系的能力［28］。然而,在白酒釀造中,大量的有機酸的存在會影響發(fā)酵的進程,從而影響大曲酒品質(zhì),因此合理控制和利用發(fā)酵過程中米根霉生長就變得尤為重要。

1.3 細菌

大曲中的細菌種類較多,較為常見的有醋酸菌、乳酸菌、芽孢桿菌等。細菌產(chǎn)生的酶類主要有：液化酶、蛋白酶、糖化酶、纖維素酶、果膠酶、淀粉酶等。謝國排等［29］利用熱處理、高溫培養(yǎng)等方法,從金種子濃香型大曲中分離出6株產(chǎn)蛋白酶的嗜熱細菌,通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-massspectrometer,GC-MS)檢測其單菌種發(fā)酵液中香氣成分,發(fā)現(xiàn)這些菌株均有產(chǎn)芳香族化合物、酚類、酯類等白酒風(fēng)味物質(zhì)的能力。陳曉旭等［30］通過對濃香型大曲中的高液化力菌株進行篩選與鑒定,篩選出一株細菌,該菌株的液化力高達11.756 g/(g·h),該菌株有多種代謝產(chǎn)物：吡嗪類物質(zhì)、愈創(chuàng)木酚和苯甲醛等多種重要的大曲風(fēng)味物質(zhì)。王鑫昕等［31］經(jīng)試驗篩選得到的高產(chǎn)淀粉酶細菌C3-枯草芽孢桿菌,其淀粉酶活力為63.1 U/g,比原廠濃香型大曲提高了44.4%?？莶菅挎邨U菌在大曲中的功能較多,趙東等［32］分離自大曲中的產(chǎn)紅色素細菌,不但能產(chǎn)生堿性蛋白酶,還具有分泌淀粉酶的能力?？莶菅挎邨U菌還是大曲中芳香味物質(zhì)的主要來源。林群等［33］從大曲中分離得到一株能發(fā)酵高梁的枯草芽孢桿菌,經(jīng)GC-MS分析檢測得到了多種芳香族化合物。細菌是生香的主力軍,在風(fēng)味物質(zhì)形成與酒體風(fēng)格和質(zhì)量等方面起著不可或缺的重要作用。

2 大曲中酶系研究現(xiàn)狀

一切微生物的生命活動都離不開酶,大曲及釀酒培養(yǎng)各種微生物的目的在于利用微生物產(chǎn)生的酶系進行各類生化反應(yīng)。由于大曲中微生物的多樣性,在大曲培養(yǎng)成熟的過程中微生物可以產(chǎn)酶,并進一步降解發(fā)酵時的原料以促進利用［34-35］。大曲中的酶根據(jù)催化功能可分為糖化酶、液化酶、蛋白酶、酯化酶、纖維素酶、半纖維素酶、單寧酶、果膠酶等類別［4］。

2.1 糖化酶

糖化型淀粉酶俗稱糖化酶,主要作用于淀粉的非還原性末端,水解α-D-1,4-葡萄糖苷鍵。糖化酶主要是由根霉、黑曲霉、米曲霉及紅曲霉等產(chǎn)生［36-37］。糖化酶在白酒上的應(yīng)用非常廣泛,主要是用作糖化劑,具有提高出酒率、簡化操作的優(yōu)點［38］。魯珍等［39］從高溫醬香白酒大曲中分離了高產(chǎn)糖化酶菌株,其中蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)GX06產(chǎn)糖化酶能力最強,糖化酶活性可達917.03 U/g,應(yīng)用該特性可有效提高原料利用率。楊躍寰等［40］應(yīng)用傳統(tǒng)微生物分離的方法,篩選出具有高糖化酶活力菌株njsys-3與njsys-6,其酶活分別達到1 842 U/g、2 349 U/g。分子生物學(xué)鑒定結(jié)果表明,菌株nisys-3為棒曲霉、菌株njsys-6為黑曲霉；研究表明,當(dāng)菌株njsys-3種子液添加量達到6‰時,大曲糖化力提高26.9%；菌株njsys-6種子液添加量達到6‰時,糖化力趨于穩(wěn)定,提高34.1%左右,且能增加曲香。我國白酒采用傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝居多,固態(tài)體系中的雙邊發(fā)酵微生境條件非常復(fù)雜。在影響出酒率的眾多因素中,最為重要的是淀粉質(zhì)原料的利用情況。糖化作為白酒發(fā)酵的基礎(chǔ),使得糖化酶活力的高低成為影響出酒率的決定因素之一。

2.2 蛋白酶

蛋白酶是水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶的總稱。依據(jù)酶作用的pH不同,可將其大致分為酸性蛋白酶(pH2.5～6.0)、中性蛋白酶(pH7.0左右)和堿性蛋白酶(pH8.0～11.0)。蛋白酶的水解產(chǎn)物主要為氨基酸、多肽,不但為微生物的生長、繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì),也為其代謝產(chǎn)物提供結(jié)構(gòu)物質(zhì)［41］。蛋白酶主要是由細菌產(chǎn)生,張海龍［42］通過紫外誘變的方法對出發(fā)菌株米曲霉滬釀3.043原生質(zhì)體進行誘變,經(jīng)過初篩、復(fù)篩等,最終成功選育出一株高活性蛋白酶突變菌株米曲霉TZ-04。

在釀造白酒的過程中,添加適量的酸性蛋白酶,對原料中蛋白質(zhì)水解,一方面能有效地破壞原料顆粒質(zhì)間包膜結(jié)構(gòu),使醪液中可利用糖增加、原料率得到提高；另一方面還能增加醪液中可被酵母利用的有機氮源氨基酸含量,對酵母細胞的快速生長繁殖、酒精產(chǎn)量的提高起到促進作用。通過相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［41］,在釀制白酒過程中,適量添加蛋白酶能夠顯著地提高原料利用率和出酒率。以發(fā)酵法生產(chǎn)酒精時,選擇性地加入一些蛋白酶,可以減少向發(fā)酵池中補充麥芽汁的量,從而降低成本。蛋白酶在大曲的培育發(fā)酵及白酒的固態(tài)發(fā)酵過程中,不僅具有提供營養(yǎng)物質(zhì)供微生物代謝、提高原料利用率和出酒率的作用,還對白酒品質(zhì)、香氣結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。

蛋白酶除在白酒方面的應(yīng)用,在果酒、啤酒等方面也引起重視,成為研究的熱點。在果酒方面,對蛋白酶研究主要集中在葡萄酒方面。張傳軍［43］通過酶法提高白葡萄酒質(zhì)量穩(wěn)定性的研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)?shù)鞍酌噶?.6%,pH6.5,溫度45℃,反應(yīng)時間38 h時,白葡萄酒中的蛋白含量降低為0.31 g/L,氨基酸含量升高至6.7 mg/L,可有效減少白葡萄酒中非穩(wěn)定蛋白含量,從而提高葡萄酒品質(zhì)。

2.3 纖維素酶

纖維素酶是指能水解纖維素中β-1,4-葡萄糖苷鍵,將纖維素水解為葡萄糖的一組酶的總稱,它不是單一酶,而是擁有協(xié)同作用的多組分酶系,在白酒釀造原輔料中含有大量的纖維素類基質(zhì),通過纖維素酶的分解作用,可以將這類基質(zhì)轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖,提高原料中淀粉的利用率,從而提高出酒率。

纖維素酶主要由真菌和細菌產(chǎn)生,中性和堿性纖維素酶多由芽孢桿菌屬微生物產(chǎn)生。龔麗瓊等［44］從高溫大曲中篩選出產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌,經(jīng)測定其內(nèi)切纖維素酶活力和外切纖維素酶活力分別為556.64 U/mL、121.47 U/mL。酶的穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示,該菌株所產(chǎn)纖維素酶在溫度低于60℃、pH4～8時,具有良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,通過響應(yīng)面法優(yōu)化固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基,優(yōu)化后測定纖維素酶活提高至1643.27 U/mL。纖維素類物質(zhì)在白酒生產(chǎn)的原料和輔料中占主要地位,僅高粱一種原料中纖維素含量為2%～3%,而輔料糠殼中纖維素含量則更高。高粱、小麥等原料中大量的纖維素類基質(zhì)在纖維素酶的作用之下轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵性糖,并通過微生物的進一步發(fā)酵作用將其轉(zhuǎn)化為酒精,從而提高出酒率和原料的利用率［45］。研究表明［46］,大曲酒糟中添加適量纖維素酶后,在相同工藝條件下發(fā)酵2 d,每噸含10%淀粉的酒糟可產(chǎn)出60%vol白酒61 kg,是常規(guī)發(fā)酵20 d所產(chǎn)酒量(15 kg)的4倍左右,因此,纖維素酶在白酒發(fā)酵業(yè)中將會有巨大的應(yīng)用潛力。王傳榮等［47］以酒糟為原料,應(yīng)用纖維素酶、糖化酶和TH-AADY(耐高溫酒用活性干酵母)的復(fù)合作用,對濃香型大曲酒丟糟進行再發(fā)酵,不但顯著提高了出酒率,還大大降低了殘余淀粉含量,原料利用率得到了明顯提升?，F(xiàn)如今,纖維素酶的應(yīng)用仍然不廣泛,有以下幾點因素制約著纖維素酶的發(fā)展：對于纖維素酶在白酒釀造過程中相關(guān)添加量較少；纖維素酶整體的產(chǎn)量和活性都不高,若廣泛使用,會導(dǎo)致白酒的釀造成本增加；纖維素酶相關(guān)的檢測技術(shù)尚不成熟［53］。因此,纖維素酶的研究和發(fā)展將成為未來科研工作者一個主要的方向。

2.4 酯化酶

酯化酶不是酶學(xué)上的術(shù)語,在白酒生產(chǎn)中是脂肪酶、酯合成酶、酯分解酶的統(tǒng)稱。酯化酶在白酒生產(chǎn)過程中具有使醇與酸脫水縮合生成酯的催化作用。大曲中酯化酶在白酒釀造過程中發(fā)揮著巨大的作用,可以催化醇與多種酸的酯化,如乙醇與己酸、乙酸、乳酸、丁酸等反應(yīng),生成的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯等,進而形成白酒的主要香氣成分。王曉丹等［54］利用紅曲霉FBKL3.0018制成的酯化酶粗酶制劑,加入濃香型清酒發(fā)酵中,當(dāng)用曲量減少2%～5%,出酒率提高約2%；通過對微量成分含量進行分析,白酒質(zhì)量得到明顯提高。細菌、真菌、霉菌都具有產(chǎn)生酯化酶的能力,因此篩選高產(chǎn)酯化酶的菌株將其用到發(fā)酵中或者以復(fù)合酶菌劑用于白酒釀造過程,可以顯著提高出酒率和優(yōu)質(zhì)酒率。

酯化酶技術(shù)的應(yīng)用是中國白酒工業(yè)的一項重大創(chuàng)新成果,酯化酶制劑在白酒生產(chǎn)中被廣泛應(yīng)用,雖然酯化酶技術(shù)已經(jīng)日趨成熟,但仍存在以下幾個方面的問題：微生物選育方面應(yīng)篩選出適應(yīng)強較強、不易變異、產(chǎn)酯、產(chǎn)香風(fēng)格更為突出的菌株,進而形成香氣更加濃郁,風(fēng)格更加迥異的優(yōu)質(zhì)白酒,以滿足市場需求；酯化酶的純度及活性需要進一步提高,并且目前大部分酶制劑研究仍處于粗酶制劑階段,純度不高。從酶制劑的純度進行研究,形成產(chǎn)業(yè)化規(guī)模,從而滿足白酒市場需求,提高優(yōu)質(zhì)酒率［55］。

3 結(jié)論與展望

近年來,對白酒大曲的研究日益深入,對大曲整體的認(rèn)識也得到進一步加深,大曲中所含酶系的種類和數(shù)量繁多,其相互之間作用關(guān)系復(fù)雜。近年來,眾多研究機構(gòu)與學(xué)者基于大曲液化力、糖化力和出酒率的直接關(guān)系,對大曲的糖化型淀粉酶和液化性淀粉酶研究有了較大收獲,但在白酒發(fā)酵復(fù)雜多變的多菌多酶體系中,對白酒發(fā)酵酶和酶類系統(tǒng)的深入研究還比較少。大曲在白酒釀造過程中發(fā)揮的重要的作用,其實質(zhì)是大曲中豐富的微生物群體利用自身酶系,進行底物催化的一系列反應(yīng)。大曲發(fā)酵過程中,曲房內(nèi)環(huán)境條件以及曲塊內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的變化,決定了大曲中微生物競爭更迭的菌群和酶系。大曲內(nèi)豐富的微生物群及其功能酶系在釀酒的三系(菌系、酶系、物系)中流通,所包含的菌種豐度、協(xié)調(diào)性及在制曲過程中形成的風(fēng)味前驅(qū)物質(zhì),是酒體質(zhì)量和產(chǎn)量的重要保障。大曲中酶系之間相互作用影響著原料的利用率和出酒率,其重要作用最終體現(xiàn)在白酒的品質(zhì)和風(fēng)格。

本文概述了大曲微生物分類,以及大曲中主要酶系的功能及作用。通過研究大曲微生物分類以及產(chǎn)酶情況,揭示微生物之間相互活動的內(nèi)在規(guī)律,達到突出特殊風(fēng)味和提高特定產(chǎn)品風(fēng)格及質(zhì)量的目標(biāo)。通過對大曲酶系中酶的種類和數(shù)量進行優(yōu)化組合,以特定白酒風(fēng)味為導(dǎo)向的釀造工藝探索和創(chuàng)新,有望成為今后我國傳統(tǒng)工藝白酒生產(chǎn)研究的重點和努力方向。目前研究主要集中于微生物篩選及其酶活力研究,但對其實際應(yīng)用研究相對較少,有待于對應(yīng)用微生物學(xué)和工程學(xué)等學(xué)科中多種原理進行深入研究,進一步揭示我國白酒固態(tài)發(fā)酵的奧秘。

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