放線菌WS—24926產(chǎn)生的刀豆霉素分離純化及含量測(cè)定

張亞妮+王開梅+張志剛+王燕+楊自文+萬中義

摘要：從武漢地區(qū)土壤中分離到一株放線菌WS-24926，其發(fā)酵提取物具有較強(qiáng)的抑制真菌作用。以放線菌菌株WS-24926發(fā)酵提取物中的活性代謝產(chǎn)物為目的，應(yīng)用高效制備液相色譜經(jīng)過兩次分離純化，得到6個(gè)化合物。根據(jù)紫外吸收光譜、分子離子峰、物理性狀及活性情況等確定組分1、組分2、組分3、組分4、組分6與刀豆霉素B、G、C、A、E較為相似。對(duì)菌絲提取物中的刀豆霉素含量進(jìn)行測(cè)定，刀豆霉素B含量最高，為29.20 mg/L，刀豆霉素G含量為2.72 mg/L；刀豆霉素C的含量為0.92 mg/L；刀豆霉素A的含量為12.83 mg/L；刀豆霉素E的含量為18.67 mg/L?；衔?還未明確歸屬，含量較高，為28.51 mg/L。

關(guān)鍵詞：放線菌WS-24926；抗生素；分離純化；刀豆霉素

中圖分類號(hào)：TQ450.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4787-04

放線菌是最主要的抗生素產(chǎn)生菌，從微生物中分離的生理活性物質(zhì)有60%以上為放線菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物[1，2]。農(nóng)用抗生素是微生物產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，可用于防治農(nóng)業(yè)有害生物，是一類用途廣泛、產(chǎn)業(yè)化程度很高的生物農(nóng)藥[3]。本研究在武漢某地土樣中分離得到一株放線菌WS-24926，對(duì)WS-24926的發(fā)酵提取物進(jìn)行了化學(xué)成分的分析，研究放線菌WS-24926的發(fā)酵、提取、分離純化、初步結(jié)構(gòu)確定及其提取物中活性物質(zhì)的含量，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 抗生素產(chǎn)生菌 編號(hào)為WS-24926，在武漢某地的土樣中分離得到，由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.1.2 生測(cè)指示菌 番茄灰霉菌（Botrytis cinerea）、小麥穎枯病菌（Septoria nodorum）、小麥赤霉病菌（Fusarium graminearum）、水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）、水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）均為湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心保存。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 種子培養(yǎng)基 麥芽糖6.25 g，麥芽提取物6.25 g，酵母提取物1.00 g，磷酸二氫鉀1.25 g，硫酸鎂0.625 g，蛋白胨0.625 g，瓊脂粉15.00 g，去離子水1 000 mL。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖72.00 g，蛋白胨8.00 g，酵母提取物4.00 g，磷酸二氫鉀2.00 g，硫酸鎂1.00 g，鹽酸硫胺0.10 g，pH 6.0，去離子水1 000 mL。

1.2.3 生測(cè)培養(yǎng)基 采用PDA培養(yǎng)基，馬鈴薯（去皮）200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.0。

1.3 儀器與試劑

1.3.1 儀器 BUCHI ROTAVAPOR R-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士）；Waters 2695高效液相色譜儀（Waters 2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站MasslynxV4.0）；高效制備液相色譜儀（Waters 2525泵，帶2767自動(dòng)收集系統(tǒng)，Waters 2996二級(jí)管陣列檢測(cè)器，色譜工作站MasslynxV4.0）；液質(zhì)聯(lián)用儀：Waters 2695高效液相色譜系統(tǒng)，美國Micromass Quattro Micro？誖質(zhì)譜儀（電噴霧離子源ESI），Masslynx V4.1液質(zhì)聯(lián)用分析軟件。

1.3.2 試劑 甲醇（色譜純，德國CNW），乙腈（色譜純，德國CNW），去離子水（Millipore）。液質(zhì)聯(lián)用分析所用的高純氮?dú)赓徸晕錆h和遠(yuǎn)氣體有限公司，純度為99.5%。

標(biāo)準(zhǔn)品：刀豆霉素A（Concanamycin A）（純度95%）、B（純度95%）、C（純度95%）、D（純度95%）、E（純度95%）、F（純度95%）（自制）。

1.4 色譜條件

1.4.1 分析條件 色譜柱：美國SunFire Prep C18 OBD， 150 mm×2.0 mm（i.d），粒徑3.5 μm；進(jìn)樣體積3 μL；流動(dòng)相：A水，B乙腈；柱溫40 ℃；流速0.3 mL/min；PDA全波長(zhǎng)掃描。采用表1的方法進(jìn)行梯度洗脫。

1.4.2 制備條件 色譜柱：美國SunFire Prep C18，OBD 250 mm×19 mm（i.d），粒徑5 μm；柱溫為室溫；流動(dòng)相：A水，B乙腈（梯度洗脫條件見表1）；進(jìn)樣量2 000 μL；流速27 mL/min；PDA全波長(zhǎng)掃描。

1.4.3 質(zhì)譜檢測(cè)條件 電噴霧電離（ESI），毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為45 V，離子源溫度為100 ℃，脫溶劑氣溫度為300 ℃，脫溶劑氣體流速500 L/h，錐孔氣體流速為50 L/h。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 抗生素發(fā)酵 取低溫（-20 ℃以下）保藏的WS-24926甘油管1支，在嚴(yán)格無菌條件下用吸管取1 mL甘油-菌絲懸浮物轉(zhuǎn)入種子培養(yǎng)基中，在旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)上28 ℃、140 r/min培養(yǎng)4 d后轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10%（V/V），相同條件下培養(yǎng) 5 d后結(jié)束發(fā)酵。

1.5.2 發(fā)酵液處理 將WS-24926發(fā)酵液用稀鹽酸調(diào)pH至5.0，5 000 r/min離心10 min，將菌絲體和上清液分開。

1.5.3 活性物質(zhì)的提取 用乙酸乙酯分別提取WS-24926發(fā)酵液上清液和菌絲體3次，合并3次提取液。再分別將上清液提取液和菌絲提取液減壓濃縮至干，用適量體積色譜級(jí)甲醇溶解、離心，備用。

1.5.4 活性物質(zhì)的制備 取10 mL甲醇溶解的提取物樣品進(jìn)行活性物質(zhì)的制備。首先，采用分析液相探索出適合活性化合物分離的流動(dòng)相梯度。然后將此梯度直接放大到制備液相中，分離純化出活性物質(zhì)單組分，制備時(shí)所用色譜柱為美國SunFire Prep C18反相柱（5 μm，19 mm×250 mm），進(jìn)樣體積2 000 μL，柱溫為室溫，流速為27 mL/min。流動(dòng)相為乙腈、水，采用梯度洗脫，收集有活性的組分。endprint

1.5.5 WS-24926主要活性物質(zhì)的確定 將“1.5.4”分離純化到的單組分化合物干燥，溶于色譜級(jí)甲醇中，在“1.4.3”質(zhì)譜檢測(cè)條件下進(jìn)樣，根據(jù)樣品中化合物的正負(fù)離子峰、碎片離子、紫外吸收光譜鑒別樣品中主要活性化合物。

1.5.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 精密稱取刀豆霉素標(biāo)準(zhǔn)品10.53 mg于10 mL容量瓶中，用色譜級(jí)甲醇溶解、定容，配成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，后用色譜級(jí)甲醇稀釋成2-1、2-2、2-3、2-4、2-5 mg/mL系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。將系列濃度刀豆霉素（Concanamycins）標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別進(jìn)樣3 μL，在液相色譜儀上測(cè)定峰面積，用測(cè)得的峰面積與對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液的刀豆霉素濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.7 WS-24926發(fā)酵提取物樣品中活性物質(zhì)含量的測(cè)定 取1 mL“1.5.3”樣品在“1.4.1”色譜條件下進(jìn)樣3針，根據(jù)其平均峰面積，采用外標(biāo)法對(duì)樣品進(jìn)行定量分析，計(jì)算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 WS-24926發(fā)酵提取物的活性測(cè)定

結(jié)果（表2）表明，WS-24926發(fā)酵提取物對(duì)番茄灰霉菌、小麥穎枯病菌、小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌均具有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)水稻稻瘟病菌具有一定的抑制作用。

2.2 放線菌WS-24926產(chǎn)生的活性物質(zhì)的分離純化

檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，在22～27 min保留時(shí)間段集中了峰23.63、24.12、24.71、24.83、26.61、26.83這6個(gè)較大峰，這些峰的紫外最大吸收值均為245、285 nm；可能為類似物或者同系物，屬于中等偏弱極性化合物。峰24.71、24.83、26.61和26.83這4個(gè)組分的分離度較小，因此先采用梯度1條件收集到4個(gè)樣品組分。然后根據(jù)梯度1的保留時(shí)間段流動(dòng)相配比，設(shè)計(jì)出梯度2[4，5]，將梯度1條件下收集到的組分再進(jìn)一步分離純化，得到6個(gè)單一組分的化合物。

2.3 放線菌WS-24926發(fā)酵提取物中的各組分LC-MS歸屬

對(duì)6個(gè)化合物進(jìn)行LC-MS質(zhì)譜分析（表3），明確其中5個(gè)化合物的分子質(zhì)量分別為851.9（組分1）、660.6（組分2）、823.0（組分3）、866.0（組分4）、837.0（組分6）。組分5分子離子峰不明顯，還需要核磁進(jìn)一步明確。組分1的最大紫外吸收值為244、285 nm；組分2的最大紫外吸收值是228、284 nm；組分3、組分4的最大紫外吸收值均為243、284 nm；組分5的最大紫外吸收值均為236、284 nm；組分6的最大紫外吸收值為241、283 nm；6個(gè)組分在甲醇中均為白色晶體。對(duì)比這些化合物的分子質(zhì)量、紫外吸收光譜、物理性狀、來源及生物活性，查詢天然產(chǎn)物化合物詞典（DNP）和文獻(xiàn)[6]，可確定此5種化合物為刀豆霉素B（組分1）、G（組分2）、C（組分3）、A（組分4）、E（組分6）。表明刀豆霉素是由鏈霉菌屬（Streptomyces diastatochromogenes）產(chǎn)生的18元大環(huán)內(nèi)酯抗生素，已經(jīng)分離出A～G多種組分[7-9]。

2.4 刀豆霉素HPLC分析方法的確定

對(duì)色譜柱、流動(dòng)性組成、流動(dòng)相配比進(jìn)行對(duì)比篩選，確定分析條件。檢測(cè)波長(zhǎng)為243、285 nm。刀豆霉素的保留時(shí)間在22～27 min，峰形尖銳、對(duì)稱，無拖尾現(xiàn)象（圖2）。

2.5 HPLC分析方法的線性相關(guān)測(cè)定及發(fā)酵提取物中刀豆霉素的含量測(cè)定

在上述確定的色譜條件下進(jìn)行相同體積的進(jìn)樣，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，刀豆霉素的濃度在0.031 25～1.000 00 mg/mL，有較好的線性相關(guān)性，線性方程如表4所示。分別取1 mL甲醇溶解的菌絲及上清液的提取物樣品進(jìn)行活性物質(zhì)的含量測(cè)定，將活性組分的峰面積帶入方程中，采用外標(biāo)法計(jì)算活性物質(zhì)的含量，結(jié)果見表4。由表4可知，刀豆霉素主要分布在菌絲中，菌絲提取物總含量為92.85 mg/L，上清液提取物總含量?jī)H有2.66 mg/L。因上清液在提取過程中具有較大的體積，需要用較多的乙酸乙酯進(jìn)行提取，較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且相比菌絲提取物，上清液提取物中分布的刀豆霉素含量較低，所以上清液可以不再進(jìn)行提取。在菌絲提取物中，刀豆霉素B含量最高，為29.20 mg/L，刀豆霉素G含量為2.72 mg/L；刀豆霉素C的含量為0.92 mg/L；刀豆霉素A的含量為12.83 mg/L；刀豆霉素E的含量為18.67 mg/L?；衔?還未明確歸屬，但含量較高，為28.51 mg/L。

3 小結(jié)與討論

1）從WS-24926的發(fā)酵提取物中分離得到的6個(gè)組分，組分1、組分2、組分3、組分4、組分6與化合物刀豆霉素相似，具有較強(qiáng)抗真菌作用。刀豆霉素由鏈霉菌屬產(chǎn)生的18元大環(huán)內(nèi)酯抗生素，已經(jīng)分離出A～G多種組分。具有抗病毒、免疫制劑、細(xì)胞毒等活性，是V型ATP酶的特異性抑制劑，是生化研究的重要工具[10-13]，研究多集中于醫(yī)用價(jià)值上。由于該提取物具有較強(qiáng)的抗真菌活性，在農(nóng)業(yè)生物防治方面具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

2）建立的HPLC分析方法及分離純化方法，能較好地將WS-24926提取物中的活性組分刀豆霉素分離純化。同時(shí)，通過此方法可對(duì)WS-24926提取物中的6種刀豆霉素進(jìn)行含量測(cè)定。刀豆霉素主要分布在菌絲提取物中，刀豆霉素B含量最高，為29.20 mg/L；刀豆霉素G含量為2.72 mg/L；刀豆霉素C的含量為0.92 mg/L；刀豆霉素A的含量為12.83 mg/L；刀豆霉素E的含量為18.67 mg/L?；衔?還沒有明確歸屬，但含量較高，為28.51 mg/L。本方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、快速、成本低，可為其在農(nóng)業(yè)生物防治上的研究提供一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 張一賓.由植物中放線菌產(chǎn)生的植物生理活性物質(zhì)[J].世界農(nóng)藥，2003，25（1）：9-12.endprint

[2] 安德榮.生物制藥的原理及方法-抗菌素的制備[M].北京：中國科學(xué)文化出版社，2002.

[3] 朱昌雄，蔣細(xì)良，姬軍紅，等.我國生物農(nóng)藥的研究進(jìn)展及對(duì)未來發(fā)展建議[J].現(xiàn)代化工，2003，23（7）：1-4.

[4] 劉國詮，余兆樓.色譜柱技術(shù)[M].第二版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006.

[5] 張亞妮，萬中義，張志剛，等.真菌SF-21483產(chǎn)生的活性物質(zhì)分離純化及初步確認(rèn)[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，54（17）：2088-4191.

[6] 張致平，姚天爵.抗生素與微生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005.

[7] KINASHI H，SOMENO K，SAKAGUCHI K. Isolation and characterization of concanamycins A，B and C[J].Antibiotics，1984， 37：1333-1343.

[8] WESTLEY J W，LIU C M，SELLO L H，et al. The structure and absolute configuration of the 18-membered macrolide lactone antibiotic X-4357B（concanamycin A）[J].Antibiotics，1984， 37：1738-1740.

[9] WOO J T，SHINOHARA C，SAKAI K，et al. Isolation， characterization and biological activities of concanamycins as inhibitors of lysosomal acidification[J].Antibiotics，1992，45：1108-1116.

[10] MUROI M，SHIRAGAMI N，NAGAO K，et al. Folimycin （concanamycin A），a specific inhibitor of V-ATPase， blocks intracellular translocation of the glycoprotein of vesicular stomatitis virus before arrival to the Golgi apparatus[J].Cell Structure and Function，1993，18（3）：139-149.

[11] WOO J T，SHINOHARA C，SAKAI K，et al. Inhibition of the acidification of endosomes and lysosomes by the antibiotic concanamycin B in macrophage J774[J].View issue TOC，1992， 207（1）：383-389.

[12] MUROI M，TAKASU A，YAMASAKI M，et al. Folimycin （concanamycin A），an inhibitor of V-type H+-ATPase，blocks cell-surface expression of virus-envelope glycoproteins[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications，1993， 193（3）：999-1005.

[13] ITO K，KOBAYASHI T，MORIYAMA Y，et al. Concanamycin B inhibits the expression of newly-synthesized MHC class II molecules on the cell surface[J].Antibiotics，1995，48：488-494.endprint