大麗輪枝菌V991b及其變異體的培養(yǎng)性狀及致病力研究

黃薇+袁斌+金利容+劉友梅+萬(wàn)鵬

摘要：以大麗輪枝菌（Verticillium dahilae）V991b和V991w為研究對(duì)象，研究其在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀、溫度對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育的影響及其對(duì)棉苗的致病力。結(jié)果表明，兩種病原菌的生長(zhǎng)曲線基本呈線性關(guān)系。25 ℃下，V991b和V991w菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)16 d后菌落直徑之間差異不顯著，且在培養(yǎng)過(guò)程中二者之間的生長(zhǎng)速率差異不顯著。培養(yǎng)溫度會(huì)影響病原菌表型的變化，30 ℃下V991b中微菌核數(shù)量明顯減少，培養(yǎng)性狀逐步接近于V991w，而V991w形態(tài)上不發(fā)生變化，PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 d V991b和V991w菌落生長(zhǎng)直徑有顯著性差異。35 ℃下，V991b不生長(zhǎng)，V991w菌落呈膜狀，生長(zhǎng)形態(tài)類似酵母菌。V991w對(duì)高溫的耐受顯著強(qiáng)于V991b。溫度對(duì)V991b微菌核的產(chǎn)生有明顯影響，35 ℃以上的高溫與5 ℃以下的低溫都不利于微菌核的產(chǎn)生。查氏液體培養(yǎng)基搖菌后接種棉苗，接種25 d后，兩種病原菌的致病力差異顯著，分別為48.869和21.777。

關(guān)鍵詞：大麗輪枝菌（Verticillium dahilae）；培養(yǎng)性狀；致病力；變異體

中圖分類號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）24-4777-05

大麗輪枝菌（Verticillium dahilae Kleb.）是一種土傳性的病原菌，在世界范圍內(nèi)對(duì)多種大田作物、蔬菜、水果、紫荊和榆樹(shù)等園林植物都造成不同程度的危害，并且還在逐年擴(kuò)大[1]。大麗輪枝菌的變異程度高，微菌核的抗逆性強(qiáng)，存活時(shí)間長(zhǎng)，一旦定殖下來(lái)就很難清除。由于大麗輪枝菌的變異性強(qiáng)，在與寄主協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程中常發(fā)生生理分化，產(chǎn)生新的致病類型或生理小種，這種變異性為棉花抗病品種的選育和對(duì)黃萎病的防治都造成了極大的困難?？共∑贩N的缺乏、肥料的濫用導(dǎo)致土壤中微生物生態(tài)失衡、氣候環(huán)境的變化等多方面的影響，使它上升成了棉花上的一種主要病害，輕則導(dǎo)致棉花減產(chǎn)，嚴(yán)重情況下會(huì)導(dǎo)致大面積的棉田絕收[2，3]。對(duì)大麗輪枝菌的研究多集中在對(duì)于同一地區(qū)或者不同地區(qū)的致病型分化和致病力鑒定上，不同地區(qū)病原菌之間的致病力差異非常顯著，同一棉田中病原菌的致病力也有較大差別[4]，甚至同一病株上分離得到的病原菌致病力之間也存在較大差異[5]。因?yàn)椴≡谶z傳背景上有較大差異，各地分離得到的單株之間并無(wú)可比性。湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所棉病實(shí)驗(yàn)室在繼代過(guò)程中從大麗輪枝菌菌株V991中得到一株突變菌株V991w，對(duì)突變株經(jīng)過(guò)多次繼代培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)為菌絲型，氣生菌絲茂盛，且其性狀可穩(wěn)定遺傳。經(jīng)查氏培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)孢后接種，其致病力明顯弱于V991，經(jīng)過(guò)rDNA-ITS分子鑒定表明突變株和對(duì)照菌株的DNA序列完全相同，但在PDA培養(yǎng)基中二者的生物學(xué)特性及致病力完全不同。本研究希望在同一遺傳背景條件下，從菌株的基本生物學(xué)特性入手，以野生型V991b及其突變株V991w為研究對(duì)象，調(diào)查其生物學(xué)性狀和致病力，以期找到影響病原菌表型和可能與致病力相關(guān)的因子，為深入研究病原菌的致病機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 野生型V991b為菌核型菌株，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)；V991w為湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植保土肥研究所棉病實(shí)驗(yàn)室在PDA培養(yǎng)條件下從V991b菌落中分離得到的突變體，為菌絲型菌株，每2周繼代一次，用5 mm打孔器于菌落外緣生長(zhǎng)旺盛的區(qū)域打取菌餅，其性狀經(jīng)過(guò)多次繼代后可穩(wěn)定遺傳。將V991w保種到PDA斜面后置于4 ℃保種，再接種到25 ℃ PDA培養(yǎng)基中，仍表現(xiàn)為菌絲型菌株。

1.1.2 鑒別寄主及種植情況 鑒別寄主有冀棉11、豫棉2067、魯棉28，均為常規(guī)棉。冀棉11為感病品種，豫棉2067為耐病品種，魯棉28屬于抗病品種。采用無(wú)土基質(zhì)育苗，使室溫保持在22～28 ℃，棉花種子經(jīng)硫酸脫絨和雙氧水表面消毒后，置于平皿中以無(wú)菌水浸泡2～4 h。種子泡好后，分行播種，播種到浸潤(rùn)均勻的基質(zhì)中，保持濕度，保證溫室自然通風(fēng)，勤加管理。待棉苗長(zhǎng)到2～3片真葉時(shí)采用裸苗傷根法接種病原菌。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 供試培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其制作參照文獻(xiàn)[6]，去皮馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂 15 g，去離子水1 000 mL。將去皮的馬鈴薯切碎，加水煮沸30 min，用紗布濾去馬鈴薯，加水補(bǔ)足1 000 mL，加糖和瓊脂，加熱使瓊脂完全熔化，趁熱用紗布過(guò)濾，分裝至錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。

1.2.2 PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)及菌落形態(tài)的觀察 將V991b和V991w用打孔器取菌落外緣生長(zhǎng)旺盛的區(qū)域打取5 mm菌餅，分別接種于PDA平皿，25 ℃下黑暗靜置培養(yǎng)15 d后，用電子顯微鏡分別觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)和菌落特征。

1.2.3 PDA培養(yǎng)基上溫度對(duì)大麗輪枝菌微菌核產(chǎn)生的影響 在直徑為90 mm的培養(yǎng)皿中每皿倒入20 mL PDA培養(yǎng)基，接入20 μL濃度為106 CFU/mL的孢子懸浮液，倒置靜置。同一菌株重復(fù)3皿，分別置于5、25、30、35 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)，每天顯微鏡下觀察，記錄不同處理大麗輪枝菌微菌核產(chǎn)生的情況。

1.2.4 PDA培養(yǎng)基對(duì)大麗輪枝菌生長(zhǎng)速率的影響 選取純化培養(yǎng)后的大麗輪枝菌，接種到PDA培養(yǎng)基，同一菌株重復(fù)3皿，于25 ℃下倒置暗培養(yǎng)，每隔1 d以十字交叉法測(cè)定其菌落直徑，持續(xù)調(diào)查兩周。

1.2.5 病原菌致病力調(diào)查 將V991b和V991w接種到Czapek（查氏）培養(yǎng)液中，于25 ℃條件下，180 r/min搖菌7 d，獲得菌懸液，經(jīng)過(guò)雙層濾紙真空抽濾，配制成濃度為10^7CFU/mL的孢子懸液。采用浸根法接種棉苗。接種前將棉苗慢慢托起，不致大量傷根和傷苗。每個(gè)品種至少取60棵苗，將3個(gè)鑒別品種分開(kāi)標(biāo)記，保持根部基本整齊一致，然后置于同一菌系的菌懸液中，使根能夠充分接觸到菌液。裸苗浸根接種30 min，移栽到營(yíng)養(yǎng)缽中。每個(gè)營(yíng)養(yǎng)缽中4～5株棉苗，置于溫室中，室溫保持22～28 ℃，自然通風(fēng)，精心管理[4]。endprint

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用DPS單因素方差和Duncans新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)的多重比較分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PDA培養(yǎng)基上病原菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)及菌落形態(tài)

由圖1可知，從菌落形態(tài)上看，在PDA培養(yǎng)基上，V991b為菌核型菌落，正面有明顯可見(jiàn)的白色氣生菌絲遍布于菌落表面，菌落邊緣菌絲呈枝狀，背面菌落呈黑色，菌落輪紋不明顯。大約經(jīng)過(guò)6～7 d出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黑色素；V991b的產(chǎn)孢量高于V991w，氣生孢子產(chǎn)生多且量大，典型的輪枝狀結(jié)構(gòu)非常清晰，4、5個(gè)孢子叢生，且微菌核分散。從電子顯微鏡上來(lái)看，微菌核為多個(gè)厚壁的黑色細(xì)胞集結(jié)形成，糾結(jié)成一團(tuán)，在外緣有部分呈半透明狀的細(xì)胞。

由圖2可知，V991w在PDA培養(yǎng)基上表現(xiàn)為菌絲型菌落，正面有濃密的氣生菌絲，平鋪在菌落表面，背面呈白色，無(wú)輪紋。在PDA培養(yǎng)基上形成的菌落質(zhì)地致密，結(jié)構(gòu)緊湊；V991w的氣生孢子較少，稀疏分布，鏡檢結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌絲占大多數(shù)，氣生孢子相對(duì)來(lái)說(shuō)較少，同樣存在輪枝狀結(jié)構(gòu)，但數(shù)量少，沒(méi)有微菌核。

2.2 溫度對(duì)大麗輪枝菌微菌核產(chǎn)生的影響

將野生型V991b和突變株V991w接種到PDA培養(yǎng)基上，分別倒置于5～35 ℃的恒溫箱中暗培養(yǎng)15 d，其培養(yǎng)性狀及菌落直徑結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4、表1。結(jié)果表明，5 ℃條件下，V991w生長(zhǎng)速度極慢，V991b幾乎不生長(zhǎng)。說(shuō)明低溫明顯抑制V991b和V991w的生長(zhǎng)。25 ℃條件下，15 d后兩種病原菌菌落生長(zhǎng)直徑無(wú)明顯差異，且在生長(zhǎng)過(guò)程中V991b和V991w差異也不明顯（圖1）。30 ℃條件下，V991b只在平皿中央出現(xiàn)少量黑色素，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)黑色素所占比例減少，氣生菌絲多且濃密，培養(yǎng)性狀逐步接近V991w；而V991w形態(tài)上不發(fā)生變化，但生長(zhǎng)速度稍慢于V991b；V991w平均生長(zhǎng)速率為2.3 mm/d，而V991b的平均生長(zhǎng)速率為2.6 mm/d。培養(yǎng)15 d，V991b直徑達(dá)到4.0 cm，V991w直徑達(dá)到3.5 cm。35 ℃條件下，V991b不生長(zhǎng)，V991w氣生菌絲消失，菌落呈膜狀緊貼于培養(yǎng)基表面，表面為淡黃色，類似酵母菌的形態(tài)（圖3）。

由表1可知，15 ℃條件下，微菌核產(chǎn)生數(shù)量最多，且極顯著多于其他溫度，但25 ℃條件下產(chǎn)生微菌核的直徑最大，高溫會(huì)導(dǎo)致微菌核數(shù)量的下降（圖4）。溫度對(duì)野生型V991b微菌核的產(chǎn)生有明顯影響，35 ℃以上的高溫與5 ℃以下的低溫都不利于微菌核的產(chǎn)生，微菌核產(chǎn)生的最適溫度為15～25 ℃，此溫度區(qū)間微菌核的數(shù)量較其他溫度有明顯提升。

高于30 ℃條件下，V991b培養(yǎng)性狀逐步接近于V991w；而V991w形態(tài)上不發(fā)生變化，35 ℃條件下，菌核型菌株停止生長(zhǎng)，菌絲型菌株表型發(fā)生變化，長(zhǎng)期的高溫脅迫會(huì)導(dǎo)致病原菌的表型發(fā)生變異。溫度試驗(yàn)結(jié)果表明，菌絲型菌株V991w對(duì)高溫的耐受能力強(qiáng)于菌核型菌株V991b。

2.3 病原菌生長(zhǎng)速率的測(cè)定

從供試菌株的菌落邊緣取直徑約2～3 mm的菌絲塊，分別接種到PDA培養(yǎng)基的平皿中央，于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗培養(yǎng)，3次重復(fù)，15 d后測(cè)量菌落直徑。調(diào)查結(jié)果見(jiàn)圖5。25 ℃條件下，培養(yǎng)16 d，在PDA培養(yǎng)基上，V991b和V991w的菌落生長(zhǎng)直徑分別為5.833和6.167 cm；DPS的單因素方差和Duncans新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)的多重比較分析結(jié)果表明，PDA培養(yǎng)基中強(qiáng)弱菌株菌落的生長(zhǎng)速率差異不明顯，菌株直徑間的差異不顯著。

由圖6可知，30 ℃條件下，培養(yǎng)16 d，V991w平均生長(zhǎng)速率為2.27 mm/d，而V991b的平均生長(zhǎng)速率為2.60 mm/d，V991b和V991w的菌落生長(zhǎng)直徑分別為4.037和3.562 cm。DPS的單因素方差和Duncans新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)的多重比較分析結(jié)果表明，接菌后16 d，PDA培養(yǎng)基中強(qiáng)弱菌株菌落的生長(zhǎng)速率間差異明顯，而菌株直徑間差異顯著。

2.4 病原菌致病力的測(cè)定

經(jīng)查氏培養(yǎng)基搖菌后調(diào)查結(jié)果如表2所示，接種5～7 d棉苗開(kāi)始顯現(xiàn)病癥，接種后7 d，V991b和V991w的平均病情指數(shù)分別為5.151和7.121。隨著接種時(shí)間的推移，棉苗的病情指數(shù)逐漸上升。接種后15 d，V991b和V991w的病情指數(shù)出現(xiàn)明顯的差異，V991b的病情指數(shù)為25.109，V991w的病情指數(shù)為13.771，V991b的病情指數(shù)幾乎達(dá)到V991w的兩倍。接種后25 d，V991b的平均病情指數(shù)為48.869，V991w的平均病情指數(shù)為21.777。15 d后的病情調(diào)查表明，菌核型菌株（V991b-CA）的致病力明顯強(qiáng)于菌絲型菌株（V991w-CA）的致病力。

3 小結(jié)與討論

3.1 溫度和培養(yǎng)條件會(huì)影響病原菌的表型

白應(yīng)文等[7]發(fā)現(xiàn)受試菌株在不同溫度下產(chǎn)生微菌核的數(shù)量及直徑間存在顯著差異，20 ℃時(shí)產(chǎn)生的微菌核數(shù)量最多且個(gè)體最大。將多個(gè)菌株置于（20±1） ℃，菌株的病情指數(shù)與其產(chǎn)生微菌核的數(shù)量及直徑間均無(wú)相關(guān)性。在本試驗(yàn)中微菌核在10～30 ℃條件下均能出現(xiàn)，過(guò)高溫度（30 ℃）或過(guò)低溫度（10 ℃）會(huì)明顯減少微菌核的數(shù)量，長(zhǎng)時(shí)間處于30 ℃以上的培養(yǎng)條件下，微菌核會(huì)減少甚至消失。微菌核產(chǎn)生的最大直徑與其他研究人員不同，可能是與菌株的個(gè)體差異性有關(guān)，相同地區(qū)的黃萎病菌菌株之間微菌核的大小也存在較大差異，如XJ592和XJ511菌株的微菌核大小分別為62.09和51.37 μm[7]。大麗輪枝菌的微菌核作為一種抗逆性結(jié)構(gòu)，用來(lái)抵御不良環(huán)境對(duì)病原菌產(chǎn)生的影響[8]，豐富的營(yíng)養(yǎng)條件可能不利于微菌核的產(chǎn)生，導(dǎo)致大麗輪枝菌發(fā)生退化或突變。大麗輪枝菌在進(jìn)行室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)非常容易發(fā)生角變，也可能與真菌的培養(yǎng)條件有關(guān)系[9，10]。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，經(jīng)PDA培養(yǎng)基上多次繼代后，V991b菌株會(huì)出現(xiàn)退化現(xiàn)象，菌落表面氣生菌絲少，微菌核數(shù)量明顯減少，會(huì)變成僅有少量微菌核的中間型菌落，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)仍會(huì)轉(zhuǎn)化為菌核型菌株。endprint

白應(yīng)文等[7]通過(guò)比較培養(yǎng)基發(fā)現(xiàn)，將BM培養(yǎng)基中葡萄糖用量減半，并在培養(yǎng)基表面覆蓋玻璃紙，可使大麗輪枝菌的微菌核產(chǎn)量提高3.7倍，表明在營(yíng)養(yǎng)優(yōu)越的條件下，作為抗逆性結(jié)構(gòu)的微菌核產(chǎn)量可能會(huì)下降，與本試驗(yàn)的觀察是一致的。

3.2 產(chǎn)生致病力變化的可能原因

對(duì)于以機(jī)械力侵染寄主組織的病原菌來(lái)說(shuō)，如稻瘟菌、炭疽病菌等，附著孢中產(chǎn)生沉積的黑色素是病菌具有致病性和侵入寄主的前提，黑色素化的附著孢外壁能使病原菌積累足夠的膨壓穿透寄主表皮[11]。黑色素還可以有效清除活性氧自由基，保護(hù)生物體DNA免受輻射傷害。黑色素對(duì)菌絲的生長(zhǎng)和繁殖不起作用，但可以加強(qiáng)真菌在不良環(huán)境條件下的生存和競(jìng)爭(zhēng)能力，保護(hù)微生物免受紫外線和溶菌酶等的作用[12]。Lee等[13]研究發(fā)現(xiàn)黑色素可以加固細(xì)胞壁，提高分生孢子和菌絲對(duì)寄主免疫系統(tǒng)的抵抗力，增強(qiáng)病原菌的侵染能力。但在大麗輪枝菌中，黑色素與致病力之間無(wú)相關(guān)性，白色菌絲型菌株也有致病力強(qiáng)的菌株[14]。

在室內(nèi)25 ℃培養(yǎng)條件下，突變株V991w和野生型V991b的生長(zhǎng)速率并沒(méi)有明顯差異，經(jīng)查氏液培養(yǎng)接種棉苗后，致病力有顯著變化，培養(yǎng)25 d時(shí)V991b平均病情指數(shù)為48.869，V991w平均病情指數(shù)為21.777。有研究認(rèn)為微菌核的黑色細(xì)胞是病原菌度過(guò)逆性脅迫的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，而半透明細(xì)胞可在適宜條件下進(jìn)行菌絲萌發(fā)[15]。培養(yǎng)基條件會(huì)影響大麗輪枝菌的表型和微菌核數(shù)量，但對(duì)野生型V991b和突變株V991w的顯微結(jié)構(gòu)有無(wú)影響尚未知曉。當(dāng)菌株長(zhǎng)期處于營(yíng)養(yǎng)豐富條件時(shí)，微菌核中的黑色細(xì)胞數(shù)量逐漸減少，產(chǎn)生退化，與菌絲萌發(fā)生長(zhǎng)相關(guān)的半透明細(xì)胞糾結(jié)成團(tuán)，形成主要結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致突變株的表型和致病力發(fā)生改變；或者是受豐富培養(yǎng)基誘導(dǎo)，致使病原菌基因組序列上的某些基因表達(dá)量發(fā)生變化，導(dǎo)致菌株的表型和致病力發(fā)生變化。菌株致病力的變化是由病原菌在寄主植物內(nèi)的數(shù)量差異導(dǎo)致的，還是由于病原菌對(duì)植物的侵染力改變導(dǎo)致的，還需試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

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