除蟲菊莖腐病原菌的分離和鑒定

袁丁

除蟲菊莖腐病造成植株由莖基部開始向上變褐、腐爛，后期發(fā)展到花葉，整株枯死。本文采用柯赫氏法則，結(jié)合菌落、孢子形態(tài)等顯微特征及ITS序列比對分析，首次證明除蟲菊莖腐病主要由禾生鐮孢菌直接侵染引起，尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌亦可從傷口侵入致病。

除蟲菊是一種古老的天然殺蟲菊科植物。它含有高效殺蟲而對人畜無害的活性成分，如其中除蟲菊素廣泛用于生產(chǎn)殺蟲劑和蚊香。隨著規(guī)?；N植面積擴(kuò)大和連年種植，病害日益突出，如除蟲菊莖腐病危害嚴(yán)重，部分田塊幾近絕產(chǎn)，已成為除蟲菊產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。初期，植株莖基部褐色至黑色腐爛，后期，部分側(cè)枝甚至整株莖、葉、花全部黑褐色腐爛枯死。由于種植范圍不廣，除蟲菊病害還未得到廣泛關(guān)注，許多病原尚不清楚。本文從除蟲菊莖腐病發(fā)病部位分離和鑒定了病原，旨在為制訂該病防治策略提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1病原菌分離

除蟲菊莖腐病樣本來自云南省峨山縣雙江鎮(zhèn)福泉村。病原菌的分離采用常規(guī)組織分離法。從病株上剪下病健交界處，沖洗干凈，切取1～2mm×1～2mm的組織，用70%酒精消毒30秒，再用0.1%濃度的升汞溶液消毒1～5分鐘，然后用無菌水沖洗3次，每次1～2分鐘，最后移植于PDA培養(yǎng)基平板上，置于25℃恒溫條件下培養(yǎng)。待長出菌絲后，在菌落邊緣用無菌接種針挑取菌絲塊移至PDA培養(yǎng)基中，繼續(xù)放入25℃恒溫5d，再置于4℃冰箱內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2病原菌純化

使用稀釋法純化病原菌。將初步純化的病原菌轉(zhuǎn)移至CLA（康乃馨葉片煎汁培養(yǎng)基）和SNA（Spezieller N？hrstof-farmer Agar）培養(yǎng)基上，25℃、12小時光照黑暗交替培養(yǎng)，期間保持病原菌氧氣充足，5-15天后，顯微鏡下觀察其產(chǎn)孢情況。挑取已產(chǎn)孢的菌落，加入1-2mL滅菌水后，用滅菌牛角匙刮取孢子于滅菌水中，吸取孢子懸浮液分級稀釋，并各吸取1mL均勻涂在加入氯霉素的PDA培養(yǎng)基上，25℃培養(yǎng)48小時。挑取單菌落菌株培養(yǎng)。

1.3致病菌篩選

除蟲菊采用漂浮育苗法培養(yǎng)，發(fā)芽后移栽至沙土基質(zhì)中，按照柯赫氏法則，將純化后的真菌用牙簽接種法插入除蟲菊幼苗基部，或菌株培養(yǎng)物土壤接菌的方法接菌，將培養(yǎng)4天，長滿菌絲的較薄PDA培養(yǎng)基與滅菌基質(zhì)混勻，以無菌PDA培養(yǎng)基與基質(zhì)混勻做對照，覆蓋除蟲菊種子育苗，待幼苗長出后即可觀察發(fā)病情況。植株發(fā)病后，從植株發(fā)病部位重新分離病原菌，最終篩選出致病真菌。

1.4菌株形態(tài)鑒定

1.4.1菌落形態(tài)觀察

挑取純化后的菌絲，移至直徑10cm培養(yǎng)皿的PDA培養(yǎng)基中央，25℃、12小時熒光/12小時黑暗培養(yǎng)96小時后，測量菌落直徑，并利用色譜卡觀察比較培養(yǎng)基色澤，重復(fù)10皿。25℃下繼續(xù)培養(yǎng)15天，觀察是否有菌核產(chǎn)生。

1.4.2分生孢子形態(tài)特征觀察

將純化后的菌株轉(zhuǎn)移至CLA或SNA培養(yǎng)基上，25℃、12小時熒光/12小時黑暗培養(yǎng)4-15天后，挑取菌絲，用無菌水制片，觀察其產(chǎn)生的分生孢子類型，記錄30個大型和小型分生孢子的形態(tài)、大小、隔膜數(shù)、有無足細(xì)胞。為了觀察和計算菌絲及孢子，加酸性品紅于10%氫氧化銨溶液中制片，蓋玻片用兩層指甲油涂抹封邊。

1.5 rDNA ITS序列擴(kuò)增與測序

采用何月秋的CTAB法[5]提取鐮孢菌株的DNA，以真菌通用引物ITSI （5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC 31進(jìn)行rDNA ITS序列PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10 min；94℃變性1 min；55℃退火1min；72℃延伸2min；共25個循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后送深圳華大基因研究院純化測序。

1.6菌種的鑒定

將測序得到的DNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對的同時，用DNAman、EditSeq等軟件對DNA序列比對分析，并用MEGA等分析軟件，以Maximum Likelihood法（1000 repeti-tions）構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并結(jié)合形態(tài)特征，參照Booth形態(tài)學(xué)分類系統(tǒng)進(jìn)行種的鑒定。

2結(jié)果與分析

2.1除蟲菊莖腐病癥狀

除蟲菊莖腐病一般從莖基部、根部開始腐爛，幼苗可見莖基部葉片黑色或褐色腐爛，后期部分側(cè)枝甚至整株莖、葉、花全部黑褐色腐爛枯死，最終導(dǎo)致整株死亡，影響十分嚴(yán)重。

2.2致病鐮孢菌的形態(tài)鑒定

從供試病株中分離到4種鐮孢菌：禾生鐮孢菌、蓮生尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌致病，且以禾生鐮孢菌為主，它可通過菌培養(yǎng)物土壤接菌法直接致使除蟲菊發(fā)病，而其他3種鐮孢菌可通過傷口侵染。

2.2.1禾生鐮孢菌（F.cerealis）的形態(tài)（編號D41）在PDA平板上培養(yǎng)96h后，菌落平均直徑4.45cm，其邊緣稍不規(guī)則，菌絲白色絮狀，菌落中央呈橘黃色或棕黃色，外緣白色，后期菌落棕色。未見大型分生孢子，小型分生孢子棍棒狀，大多有兩個隔膜，大小為（7.7-15.3）μm×（2.3-3.5）μm。產(chǎn)孢細(xì)胞以芽生的方式產(chǎn)生分生孢子。

2.2.2蓮生尖孢鐮孢菌（F.oxyspomm f.sp.nelumbicola）（編號D47）在PDA平板上培養(yǎng)96h后，菌落平均直徑6.05cm。菌絲白色絮狀，由于大量分生孢子生成而呈粉質(zhì)。小型分生孢子卵形。腎型或橢圓形，通常沒有隔膜，極少數(shù)有1個隔膜，大小為（5-10）μm×（2-5）μm。大型分生孢子在CLA培養(yǎng)基上大量產(chǎn)生，在SNA培養(yǎng)基上也會生成。大型分生孢子鐮刀形，少許彎曲，多數(shù)為3隔，大小為（18.8-48.9）μm×（2.4-4.6）μm。

2.2.3禾谷鐮孢菌（F.graminearum）（編號D49）在PDA培養(yǎng)基上96h后，菌落平均直徑大于9cm。菌絲白色，菌落呈玫瑰紅色。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下未見小型分生孢子，大型分生孢子呈鐮刀形，有隔膜2-7個，頂端鈍圓，基部有明顯足細(xì)胞。大小為（2.8-6.2）μm×（38.7-64.3）μm。endprint

2.2.4厚垣鐮孢菌（F.chlamydospomm）（編號D50）在PDA平板上培養(yǎng)96h后，菌落平均直徑5.48cm。菌落邊緣整齊，菌絲白色稠密，菌落淺粉紅色，中央顏色較深，后期菌落顏色變?yōu)樽攸S色。未見小型分生孢子，大型分生孢子月牙形短粗壯，有隔膜2-3個，基部無足細(xì)胞，大小為（2.8-5.3）μm×（15.8-21.2）1xm。

2.3致病菌株ITS序列的測定與親緣關(guān)系樹的構(gòu)建

分離純化的菌株ITS序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比較的結(jié)果：分離的禾生鐮孢菌、蓮生尖孢鐮孢菌同源性為99%，禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌同源性為100%。依據(jù)ITS序列與已知菌序列構(gòu)建親緣關(guān)系樹狀圖可知：D41與禾生鐮孢菌親緣關(guān)系較近，為一類鐮孢菌，其與其他類型的鐮孢菌親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；D47、D49及D50分別于蓮生尖孢鐮孢菌、禾谷鐮孢菌、厚垣鐮孢菌親緣關(guān)系較近，分屬于相應(yīng)的鐮孢菌，其結(jié)果與同源比對結(jié)果相同。

3討論

除蟲菊在最初引入玉溪市范圍內(nèi)種植時，病害很少。隨著種植年限的增加，病害越來越重，其中以莖腐病導(dǎo)致產(chǎn)量損失尤其突出。本研究結(jié)合形態(tài)學(xué)和ITS序列比對分析，鑒定出了4種鐮孢菌與該病害有關(guān)，其中Fusaritma cerealis以培養(yǎng)物土壤接種，便可引起田間相同的癥狀，具有很強(qiáng)的侵染能力；Fusarium oxysporum f. sp.nelumbicola，F(xiàn).graminearum，F(xiàn).chlamydosporum只是在有傷口時才引起發(fā)病，侵染能力較弱。然而，在自然條件下，這后三者是否與前者復(fù)合侵染，且是否加重病害，還有待繼續(xù)研究。

禾生鐮孢菌多分離自小麥、大麥的根部和谷粒，也可在薊等植物上分離到，但其引起的病害報道較少，本文第一次報道其能侵染除蟲菊，引起莖腐病。蓮生尖孢鐮孢菌常被認(rèn)為存在于水中及沙質(zhì)土壤中，引起蓮藕腐敗病，未見到侵染除蟲菊的報道，這可能與除蟲菊種植范圍不廣，受關(guān)注的程度不夠有關(guān)。實(shí)際上除蟲菊亦在沙質(zhì)土壤上生長較好，它侵染除蟲菊引起莖腐病還是有可能的。禾谷鐮孢菌能侵染小麥引起赤霉病，侵染玉米引起穗腐病，是禾谷類常見的一類病原菌。厚垣鐮孢菌可引起瓜類、茄科、蘋果、香蕉、棉、豆科及花卉等植物病害，是常見的土傳病原真菌。這兩種鐮孢菌還未見到其侵染除蟲菊的報道。然而，鐮孢菌常存在?；停赐N鐮孢菌在不同植物上致病性存在很大差異，這些侵入除蟲菊的鐮孢菌是否為除蟲菊致病?；?，還有待進(jìn)一步試驗(yàn)證實(shí)。

真菌的ITS序列常作為分類的一種輔助手段，但正確分類還要與形態(tài)特征等性狀相結(jié)合。本研究的D47和D49兩菌株的形態(tài)特征相差很大，前者產(chǎn)生鐮刀形大孢子和卵圓形小孢子，菌落白色絮狀、粉質(zhì)，后者僅產(chǎn)生大型分生孢子，菌落呈玫瑰紅色，中央有黃色菌絲圈。兩者ITS序列分別與F.oxysporum f.sp.nelumbicola和F.graminearum同源性分別為99%和100%，但聚類分析時，D47與D49親緣關(guān)系比較相近，難以區(qū)分。本研究依據(jù)孢子形態(tài)、菌落特征，參考ITS序列信息，D47和D49分別被鑒定為F.oxysporumf.sp.nelumbicola和F.gramineamm。endprint