甲基苯丙胺濫用與司來吉蘭服用的區(qū)分：尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺的手性分析

（司法鑒定科學研究院 上海市法醫(yī)學重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術服務平臺，上海 200063）

甲基苯丙胺及其代謝物苯丙胺是強中樞神經興奮劑，在全球范圍內濫用日益嚴重。甲基苯丙胺和苯丙胺均含有一個手性中心，他們的異構體存在不同的藥理活性和藥代動力學特征，S（+）-甲基苯丙胺的中樞神經興奮作用比R構型強5倍[1]。甲基苯丙胺主要經尿排泄，尿中甲基苯丙胺和代謝物苯丙胺含量高，并以游離形式存在。尿液是鑒定甲基苯丙胺濫用的首選檢材[2]。濫用毒品后，對尿液的檢測可以快速地對結果進行判定。目前的實驗室大多應用免疫方法進行初步篩選，呈陽性結果的再應用氣相色譜-質譜（GCMS）或液相色譜-串聯(lián)質譜（LC-MS/MS）方法確認，但這些方法并未對甲基苯丙胺和苯丙胺異構體進行手性拆分。

一些臨床藥物含有或者在體內代謝成甲基苯丙胺或苯丙胺[3]，如用于帕金森病治療的處方藥司來吉蘭（selegiline）。司來吉蘭口服后吸收迅速，體內代謝途徑如圖1所示，代謝物包括R（-）-甲基苯丙胺、R（-）-苯丙胺、去甲司來吉蘭[4]。目前在吸毒、毒駕鑒定實踐中，常有尿檢陽性的嫌疑人聲稱服用了司來吉蘭。尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺來源的區(qū)分問題，給法醫(yī)毒物鑒定提出了新的挑戰(zhàn)。有必要對甲基苯丙胺和苯丙胺進行手性拆分，以區(qū)分甲基苯丙胺濫用與司來吉蘭服用[3，5]。

圖1 司來吉蘭體內代謝途徑

尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺異構體的手性分析可采用GC-MS法[5-7]，但是樣品前處理通常需要液液提取或固相萃取后進行衍生化反應，費時繁瑣且靈敏度低。本實驗室擬通過尿液稀釋法結合CHIROBIOTICTMV2手性液相色譜柱建立S（+）-甲基苯丙胺、R（-）-甲基苯丙胺、S（+）-苯丙胺、R（-）-苯丙胺、司來吉蘭及其代謝物去甲司來吉蘭的LC-MS/MS測定方法[8]，并應用于司來吉蘭服藥實驗和實際涉毒案例，闡述尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺手性分析的必要性和可行性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

QTRAP?6500三重四極桿線性離子阱復合質譜系統(tǒng)（美國AB SCIEX公司），1100高效液相色譜儀（美國 Agilent公司）。

外消旋甲基苯丙胺（1mg/mL，甲醇）、外消旋苯丙胺（1 mg/mL，甲醇）、S（+）-甲基苯丙胺（1 mg/mL，甲醇）、R（-）-甲基苯丙胺（1 mg/mL，甲醇）、S（+）-苯丙胺（1mg/mL，甲醇）、R（-）-苯丙胺（1mg/mL，甲醇）、去甲司來吉蘭（1mg/mL，甲醇）均購自美國Cerilliant公司；司來吉蘭購自英國Abcam公司；內標4-苯基丁胺購自中國藥品生物制品檢定所；甲醇（HPLC級）購自美國Sigma-Aldrich公司；冰醋酸、氨水（25%，色譜純）購自阿拉丁試劑（上海）有限公司；超純水為實驗室Milli-Q超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）自制；其他化學試劑及藥品均為分析純。

1.2 儀器條件

色譜條件：色譜柱為SUPELCO Astec CHIROBIOTICTMV2手性液相色譜柱（2.1mm×250mm，5μm），流動相為 V（甲醇）∶V（冰醋酸）∶V（氨水）=1 000∶1∶0.2，流速為0.25 mL/min，進樣量為20 μL，進樣器溫度為25℃，柱溫為25℃。

質譜條件：電噴霧離子源，采用正離子模式（ESI+），碰撞氣 7 psi，氣簾氣30 psi，離子噴射電壓 5 500 V，離子源氣135 psi，離子源氣 235 psi，離子源溫度為500℃，掃描方式為多反應監(jiān)測。檢測離子及其他相關參數(shù)見表1。

表1 7種化合物的保留時間及質譜條件

1.3 樣品前處理

取尿液100μL，置于10mL玻璃管中，加入內標4-苯基丁胺溶液（0.02 μg/mL） 10 μL，加入 200 μL pH=9.2硼砂緩沖液，再加入1.5 mL乙醚，渦旋混合1min，以867×g離心 3min，取上清液，在 60℃水浴中揮干。殘余物中加入200μL甲醇復溶，取5μL進樣分析。

經方法驗證[8]，S（+）-甲基苯丙胺、R（-）-甲基苯丙胺、S（+）-苯丙胺、R（-）-苯丙胺、司來吉蘭、去甲司來吉蘭 6 個目標物在 0.001～0.05μg/mL 和 0.05～50 μg/mL兩個范圍內線性關系良好，所有標準曲線的決定系數(shù)（R2）均大于 0.995，最低檢出限（limit of detection，LOD）、最低定量限（limit of quantitation，LOQ）分別為0.0005μg/mL和0.001μg/mL。超過標準曲線最高定量限的實際陽性尿液可用甲醇稀釋后測定。

1.4 樣品收集

1.4.1 司來吉蘭服藥實驗尿樣

1名健康志愿者，無毒品濫用及精神活性物質用藥史，口服1片司來吉蘭藥片（5mg/片）。在服藥前和服藥后0.5、1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、11、13、15、22、23、28、36、40、48、55、72、80、96、120、144、168、192 h 留取尿液，分析前冷凍保存。本實驗已通過司法鑒定科學研究院倫理委員會的倫理審查。

1.4.2 疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿樣

2017年7月一起交通事故中，某司機駕駛吉普車與一輛面包車相撞，造成面包車內2人死亡、2人受傷。吉普車司機留取的尿液經當?shù)貙嶒炇覚z測呈甲基苯丙胺陽性結果，但司機稱自己曾服用司來吉蘭。為明確其尿液中甲基苯丙胺的來源，故將尿液送至本實驗室。

2 結果與討論

2.1 司來吉蘭服藥實驗尿樣分析

尿液中司來吉蘭及其代謝物去甲司來吉蘭代謝快，以代謝物 R（-）-甲基苯丙胺和 R（-）-苯丙胺為主，藥時曲線見圖2。司來吉蘭服藥后3h收集的尿樣按1.3節(jié)方法處理后進行手性分析，結果見圖3。

服藥后1.5h尿液中可檢出司來吉蘭，3h時質量濃度最高，為1.00μg/mL，7h后無法檢出司來吉蘭原藥。代謝物去甲司來吉蘭在服藥后1h即出現(xiàn)，2h時質量濃度最高，為0.60μg/mL，55h后無法檢出。而服藥后 1.5 h R（-）-甲基苯丙胺和 R（-）-苯丙胺開始出現(xiàn)，7h時濃度最高，質量濃度分別為0.86μg/mL和0.18μg/mL，然后緩慢下降。R（-）-苯丙胺和 R（-）-甲基苯丙胺的檢測時限分別為80h和168h。R（-）-甲基苯丙胺濃度均高于 R（-）-苯丙胺，R（-）-苯丙胺與R（-）-甲基苯丙胺比值范圍為 0.13～0.46。

圖2 服藥后尿液中司來吉蘭及其代謝物的藥時曲線

圖3 服用司來吉蘭后3h尿液中司來吉蘭及其代謝物的LC-MS/MS圖

本服藥實驗結果與文獻[9]報道一致，司來吉蘭在體內代謝和消除快，大約服用劑量的40%在48 h內以代謝物形式排泄入尿。而代謝物R（-）-甲基苯丙胺和R（-）-苯丙胺在尿液中含量高，檢測時限長，是區(qū)分甲基苯丙胺濫用與司來吉蘭服用的主要標志物。

代謝物去甲司來吉蘭排泄入尿少、含量低，在以往的文獻[10]中認為其難以作為服用司來吉蘭的標志物。這些研究是在20世紀90年代，當時主要采用GCMS法，最低檢出限在0.1 μg/mL，故低濃度的去甲司來吉蘭無法檢出。但目前采用LC-MS/MS法靈敏度可提高200倍，本研究中服用5mg司來吉蘭，去甲司來吉蘭的檢出時限約在55h。尤其自2010年開始出現(xiàn)含R構型的混合毒品以來，含R構型的毒品數(shù)量以及R構型所占的比例逐年上升[11]。因此，將去甲司來吉蘭納入檢測目標物可提供更多的信息以幫助解釋尿液中 S（+）-甲基苯丙胺、R（-）-甲基苯丙胺、S（+）-苯丙胺和R（-）-苯丙胺共存時的復雜案件。

2.2 吸毒者尿樣分析

前期研究[8]將收集到的86例甲基苯丙胺陽性尿樣進行手性分析測定。86個樣品中，72個（83.7%）僅檢測到 S（+）-甲基苯丙胺和 S（+）-苯丙胺，質量濃度范圍分別為 0.33～89.73 μg/mL 和 0.11～14.03 μg/mL，中位值分別為 7.01 和 1.18 μg/mL。 S（+）-苯丙胺與S（+）-甲基苯丙胺質量濃度比值范圍為 0.04～1.27，平均值為0.25，中位值為0.16。另外14個樣品中同時檢出 S（+）-甲基苯丙胺和 R（-）-甲基苯丙胺，但是仍以S構型為主，其中S（+）-甲基苯丙胺的質量濃度范圍為 0.33～69.87 μg/mL，R（-）-甲基苯丙胺的質量濃度范圍為0.05～13.76μg/mL，且在5個樣品中檢測到R（-）-甲基苯丙胺的質量濃度低于0.05μg/mL。14個樣品中，R構型與S構型甲基苯丙胺質量濃度的比值范圍為 0.00～3.45，S（+）-苯丙胺的質量濃度范圍為0.15～14.94 μg/mL，僅在 4 個樣品中檢測到 R（-）-苯丙胺，除2個質量濃度低于0.05μg/mL外，另2個質量濃度分別為0.06和0.29 μg/mL，苯丙胺的R構型與S構型質量濃度的比值分別為0.03和0.57。86例陽性尿樣中未發(fā)現(xiàn)僅存在R（-）-甲基苯丙胺和R（-）-苯丙胺的現(xiàn)象，其中甲基苯丙胺的質量濃度均高于苯丙胺，表明濫用者服用的是甲基苯丙胺，而苯丙胺是甲基苯丙胺在人體內的代謝物。其中72個樣品中僅檢測出甲基苯丙胺和苯丙胺的S構型，表明S（+）-甲基苯丙胺是最常見的被吸毒者濫用的構型。

S（+）-甲基苯丙胺的生理學和行為學作用均比R（-）-甲基苯丙胺強，已有數(shù)據(jù)表明目前毒品主要為該構型。有報道[12]表明，查獲的“冰毒”以及在黑市中非法走私的“冰毒”主要為S（+）-甲基苯丙胺。本課題組曾調查了上海、江蘇和浙江三地142份“冰毒”和“麻古”，發(fā)現(xiàn)87.3%的甲基苯丙胺為S構型[11]。張建新等[13]調查了北京、天津、石家莊和成都地區(qū)的114份“冰毒”，發(fā)現(xiàn)S（+）-甲基苯丙胺占90.1%。尿液的檢測結果和甲基苯丙胺對映異構體的流行性一致，表明通過對吸毒者尿液的檢測，可以間接反映甲基苯丙胺濫用的流行性，并在對甲基苯丙胺前體化合物管制的法律制定方面提出參考信息。

2.3 疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿樣分析

疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿樣按1.3節(jié)方法處理后進行手性分析，結果見圖4。尿液中僅檢出S（+）-甲基苯丙胺和 S（+）-苯丙胺，質量濃度分別為10.08 μg/mL 和 1.73 μg/mL；未檢出 R（-）-甲基苯丙胺和 R（-）-苯丙胺。 S（+）-苯丙胺與 S（+）-甲基苯丙胺質量濃度比值為0.17，S（+）-甲基苯丙胺的質量濃度遠高于 S（+）-苯丙胺，表明該嫌疑人服用的是 S（+）-甲基苯丙胺。本分析結果表明，該案當事人尿液中甲基苯丙胺和苯丙胺陽性結果源于吸食S（+）-甲基苯丙胺毒品，而非源于司來吉蘭。

圖4 實際案件尿液中S（+）-甲基苯丙胺和S（+）-苯丙胺的 LC-MS/MS 圖

綜上所述，本研究利用LC-MS/MS手性分析甲基苯丙胺和苯丙胺異構體，研究司來吉蘭及其代謝物去甲司來吉蘭、R（-）-甲基苯丙胺、R（-）-苯丙胺在尿液中的含量變化，具有簡便快速、準確靈敏、取材量少等特點，可以應用于法醫(yī)毒物鑒定的常規(guī)檢測。服用5 mg司來吉蘭后，尿液中可檢出司來吉蘭、去甲司來吉蘭和質量濃度相對較高的R（-）-甲基苯丙胺、R（-）-苯丙胺。疑服用司來吉蘭的涉毒案例尿液中僅檢出 S（+）-甲基苯丙胺和 S（+）-苯丙胺，表明其為濫用毒品甲基苯丙胺而非服用司來吉蘭。甲基苯丙胺和苯丙胺的手性分析以及司來吉蘭、去甲司來吉蘭的檢測可用于區(qū)分甲基苯丙胺濫用與司來吉蘭服用。

[1]徐媛媛，莊華.論甲基苯丙胺的構型及其管制[J].中國藥物濫用防治雜志，2010，16（1）：22-25.

[2]沈敏，向平.濫用物質分析與應用[M].北京：科學出版社，2016.

[3]MUSSHOFF F.Illegal or legitimate use?Precursor compounds to amphetamine and methamphetamine[J].Drug Metab Rev，2000，32（1）：15-44.

[4]SIU E C，TYNDALE R F.Selegiline is a mechanism-based inactivator of CYP2A6 inhibiting nicotine metabolism in humans and mice[J].J Pharmacol Exp Ther，2008，324（3）：992-999.

[5]張建新，張大明，韓旭光，等.從尿液中甲基苯丙胺對映體特征推斷前體化學品[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2009（4）：718-720.

[6]RASMUSSEN L B，OLSEN K H，JOHANSEN S S.Chiral separation and quantification of R/S-amphetamine，R/S-methamphetamine，R/S-MDA，R/S-MDMA，and R/S-MDEA in whole blood by GC-EI-MS[J].J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，842（2）：136-141.

[7]沈敏，沈保華，吳侔天，等.人尿中D/L甲基苯丙胺和D/L苯丙胺的光學對映體分析及代謝研究[J].藥物分析雜志，1998（1）：21-25.

[8]WANG T，SHEN B，SHI Y，et al.Chiral separation and determination of R/S-methamphetamine and its metabolite R/S-amphetamine in urine using LCMS/MS[J].Forensic Sci Int，2015，246：72-78.

[9]HASEGAWA M，MATSUBARA K，F(xiàn)UKUSHIMA S，et al.Stereoselective analyses of selegiline metabolites：possible urinary markers for selegiline therapy[J].Forensic Sci Int，1999，101（2）：95-106.

[10]MAURER H H，KRAEMER T.Toxicological detection of selegiline and its metabolites in urine using fluorescence polarization immunoassay（FPIA）and gas chromatography-mass spectrometry （GC-MS） and differentiation by enantioselective GC-MS of the intake of selegiline from abuse of methamphetamine or amphetamine[J].Arch Toxicol，1992，66（9）：675-678.

[11]WANG T，YU Z，SHI Y，et al.Enantiomer profiling of methamphetamine in white crystal and tablet forms （Ma old） using LC-MS-MS[J].J Anal Toxicol，2015，39（7）：551-556.

[12]LEE J S，YANG W K，HAN E Y，et al.Monitoring precursor chemicals of methamphetamine through enantiomer profiling[J].Forensic Sci Int，2007，173（1）：68-72.

[13]張建新，張大明，張文芳，等.從甲基苯丙胺的對映體特征推斷前體化學品[J].衛(wèi)生研究，2009，38（4）：426-428.