HPLC法測定柴芍安神解郁顆粒中芍藥苷的含量*

★ 郭鳴李智勇李潔環(huán) 莫平莉 王洛臨 陳雪婷

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州 510405；2.廣東省第二中醫(yī)院(廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院) 廣州 510095; 3.廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室 廣州 510095)

柴芍安神解郁顆粒是我院經(jīng)多年臨床實踐研制而成的中藥復(fù)方制劑，由醋柴胡、白芍、石菖蒲、酸棗仁、法半夏、郁金等10味藥組成，具有疏肝理氣、化痰祛瘀、安神定志的功效。方中白芍，苦、酸，微寒，是該處方中的君藥。文獻報道，白芍具有廣泛的藥理作用[1-3]，如鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥;抗心肌缺血、抗凝、抑制血小板聚集、改善血液流變學(xué); 調(diào)節(jié)免疫力及抗高血糖等作用。另外，其水煎劑及醇提物還具有抗抑郁作用，芍藥苷是其主要活性成分之一[4-5]。本研究參考了白芍藥材及制劑中芍藥苷含量測定方法的相關(guān)研究[6-10]，通過本實驗研究建立HPLC法測定柴芍安神解郁顆粒中芍藥苷的含量，為該制劑的質(zhì)量控制提供方法依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 1200系列高效液相色譜儀(美國安捷倫公司)；XS205 型電子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

1.2 試藥 柴芍安神解郁顆粒樣品3 批(規(guī)格: 每袋裝8 g，批號:20170401、20170402、20170403，廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供)；芍藥苷(批號：110736 -201539，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈(色譜純，德國默克公司)；水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)，流動相∶乙腈-0.1%磷酸水溶液( 14 ∶86)， 流速: 1.0 mL/min，柱溫: 25 ℃，檢測波長: 230 nm，進樣量: 10 μL。理論板數(shù)按芍藥苷峰計算應(yīng)不低于2000，芍藥苷與其它組分分離度符合要求。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成120.96 μg/mL的對照品溶液(貯備液)。

2.2.2 供試品溶液 取本品內(nèi)容物，研細成粉末，取約0.5g，精密稱定，置100mL錐形瓶中，加入甲醇50mL，精密稱重，超聲(功率250 W，頻率40 kHz)處理30 min，取出，放冷，再稱定重量，加甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 精密稱取不含白芍的陰性樣品，按照供試品溶液的制備方法制備陰性對照溶液，即得。

2.3 專屬性試驗 取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μL注入液相色譜儀，記錄HPLC色譜圖，芍藥苷色譜峰的保留時間約為15.123min，陰性對照在芍藥苷色譜峰的位置處無干擾峰，且分離度達到要求，見圖1。

圖1 各測定溶液的HPLC譜圖

2.4 線性關(guān)系試驗 分別精密吸取1,2,4,6,8,10 mL芍藥苷對照品貯備液(120.96 μg/mL)至10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別進樣10μL，記錄色譜圖；得到峰面積(Y)與進樣量(X)的關(guān)系為Y=1.4294X-36.7473，r=0.9999，表明芍藥苷在0.12690～1.20960 μg 進樣量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗 取對照品溶液，按照2.1項下色譜條件，連續(xù)進樣6 次。計算峰面積RSD為0.95%，表明該方法精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批號樣品(20170401) ，按照2.1項下色譜條件，分別在0，2，4，8，12，18h 依次進樣，測定芍藥苷峰面積。結(jié)果峰面積RSD為1.44%(n=6) ，表明供試品溶液在18h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗 取同一批號樣品( 20170401) 6份，精密稱定，按供試品溶液的制備方法制備樣品溶液，測定峰面積。其RSD值為1.89%，表明該方法驗重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗 取供試品粉末約0.25 g ( 批號:20170401，芍藥苷含量為6.714mg/g) ，精密稱定，共6份，分別置于具塞錐形瓶中，精密一定量的對照品溶液，按供試品溶液制備法制備供試液，即得。進樣10μL，記錄峰面積，結(jié)果表明回收試驗結(jié)果良好。見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 樣品含量測定 取3批次樣品，按“2.2.2”項下方法制備供試液，依法進行測定，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 檢測波長的選擇 參考2015版《中國藥典》一部白芍項下芍藥苷的含量測定方法，選擇本實驗的檢測波長為230 nm[7]。

3.2 色譜分離條件的選擇 實驗中比較了兩個流動相組合條件下芍藥苷的出峰情況，

即乙腈-水(14∶86)和流動相乙腈-0.1%磷酸溶液(14∶86)，結(jié)果后者分離效果好，且色譜峰形良好。并考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃柱溫下測定芍藥苷成分的方法適應(yīng)性，結(jié)果芍藥苷色譜峰在20 ℃、25 ℃柱溫下的保留時間重現(xiàn)性基本一致，當(dāng)柱溫為30℃時色譜峰保留時間相應(yīng)地縮短，且色譜峰形較差，故選擇25 ℃為作為檢測柱溫。

3.3 提取方法的確定 本實驗考察了回流法及超聲提取法2種提取方法制備供試液，結(jié)果兩種方法制備的供試品色譜峰面積值無明顯差異，為方便操作，選用超聲提取法。實驗中還考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、稀乙醇等提取溶劑對提取效果的影響，結(jié)果采用甲醇提取得到的供試品溶液中芍藥苷含量測得值均高于其他方法，因此選擇甲醇為提取溶劑。還比較了超聲15min，30min及45min的提取效率，結(jié)果30 min 和45 min的提取效率明顯高于15 min，而30 min 和45 min之間無明顯差異，故確定超聲時間為30 min。

本實驗采用HPLC法測定該制劑中的芍藥苷的含量。經(jīng)方法學(xué)考察，該方法分離度良好，重復(fù)性好，準確度高，簡單易行，可用于柴芍安神解郁顆粒中芍藥苷的含量測定，為該制劑質(zhì)量標(biāo)準的制定提供了實驗依據(jù)。

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