多指標正交法優(yōu)選建昌幫炆遠志炮制工藝*

★ 張金蓮張文然 劉明貴 陳杰 顏冬梅 范暉 劉艷菊

(1.湖北中醫(yī)藥大學 武漢 430065; 2.江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004; 3.江西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院 南昌 330006)

建昌幫不僅是中國南方地區(qū)的古藥幫之一，而且也是全國中藥炮制的主要流派之一，發(fā)祥于江西南城，因擅長中藥飲片加工而聞名。建昌幫具有“工具輔料獨特，工藝取法烹飪，講究形色氣味，毒性低療效高”的炮制風格，其精湛的制藥技術(shù)在贛閩地區(qū)廣為流傳[1]。炆法是建昌幫炮制十三法(炒、炙、煨、煅、蒸、煮、炆、熬、淬、霜、曲、芽、復制)中獨特的一種炮制方法[2]。遠志為臨床常用安神藥，常用治失眠、健忘等。生遠志因能“戟人咽喉”，故臨床常用其炮制品，歷代遠志的炮制方法主要有去心、甘草汁煮、蜜炙、酒蒸等[3]。建昌幫遠志的炮制方法是將甘草與遠志共同放入藥罐中加水炆制，遠志經(jīng)炆制后不僅可消除“戟人咽喉”的副作用，而且可增強其益智安神之功[4]。傳統(tǒng)遠志炆制法僅依靠老藥工的經(jīng)驗操作，憑性狀控制質(zhì)量，沒有實現(xiàn)質(zhì)量指標的量化，難以有效控制質(zhì)量。故本文以醇浸出物、細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ、3，6’-二芥子酰基蔗糖含量作為評價指標，采用正交試驗法對炆遠志的炮制工藝進行優(yōu)選，為規(guī)范建昌幫炆遠志炮制工藝提供技術(shù)參數(shù)。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 ULtimate 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SZ-93型自動雙重純水蒸餾器(上海雅榮生化儀器設(shè)備有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵(鞏義市予華儀器有限責任公司)；YFL-1112型二兩裝高速中藥粉碎機(浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司)；GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風干燥箱(上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；SQP型萬分級電子分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 炆遠志的制備 取遠志肉切制成1.5cm的遠志段。取定量的生甘草，切制成斜片。將300g遠志段和相應量的甘草拌勻，放入炆藥壇內(nèi)，加入相應量的清水，蓋好壇蓋，放置圍灶內(nèi)，壇底兩邊以磚架起，用足量的干糠堆滿壇四周，點火后炆制相應的時間，起壇倒出，揀去甘草段，曬至全干[1]。

2.2 細葉遠志皂苷含量測定

2.2.1 色譜條件[5]采用Platisil ODS(250 mm×4.6mm,5μm)色譜柱，以甲醇-0.05%磷酸溶液(70∶30)作為流動相，流速為1.0mL/min，檢測波長210nm，柱溫30℃，進樣量20μL。理論塔板數(shù)按細葉遠志皂苷峰計算不低于3000。色譜圖見圖1，含量結(jié)果見表1。

2.2.2 對照品溶液的制備 取適量細葉遠志皂苷對照品，精密稱定，加入甲醇制成1.6180mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取炆遠志粉末(過三號篩)約1g，精密稱定，置于100mL錐形瓶中，精密加入70%的甲醇50mL，稱定重量，超聲1h，冷卻后，再次稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密吸取續(xù)濾液25mL，蒸干，殘渣加入10%的氫氧化鈉溶液50mL，水浴回流2h，冷卻后，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值4～5，再用水飽和的正丁醇萃取3次(每次50mL)，合并正丁醇溶液，回收溶劑至干，殘渣加入甲醇適量使溶解，轉(zhuǎn)移至25mL容量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得。

1.細葉遠志皂苷

圖1 對照品(A)及樣品(炆遠志)(B)色譜圖

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密量取2.2.2項下的細葉遠志皂苷對照品溶液，稀釋配制濃度為0.0809，0.1618，0.2427，0.4045，0.5663，0.8090 mg/mL的標準溶液。分別進樣3次，各進樣20μL，按“2.2.1項”條件測定。以峰面積(Y)作為縱坐標，進樣量為橫坐標繪制標準曲線，得細葉遠志皂苷的回歸方程為：Y=89.285X+0.3269，r=0.9999，結(jié)果表明，細葉遠志皂苷進藥量與峰面積平均值的線性關(guān)系良好，線性范圍為1.618～16.18μg。

2.2.5 精密度試驗 按“2.2.3項”的方法，取炆遠志樣品制備1份供試品溶液，連續(xù)精密進樣6次，每次20μL，依法進行HPLC分析，測定峰面積，計算RSD值為1.54%。結(jié)果表明，精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 按照“2.2.3項”方法，取炆遠志樣品1g，制備供試品溶液。精密吸取上述密封、室溫保存的供試品溶液，分別于0, 2, 4, 8, 16, 24h進樣，每次20μL，依法進行HPLC分析，測定其峰面積，并計算細葉遠志皂苷的RSD值為1.80%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復性試驗 取炆遠志樣品粉末6份，每份各約1g，按“2.2.3項”方法制備供試品溶液，精密吸取各供試品溶液20μL，進行HPLC分析，測定按細葉遠志皂苷含量計算RSD值為1.93%，結(jié)果表明本方法重現(xiàn)性良好。

2.2.8 加樣回收試驗 取已知含量的炆遠志樣品粉末6份，每份各0.5g，精密加一定量的細葉遠志皂苷對照品，按“2.2.3項”方法制得供試品溶液，測定細葉遠志皂苷含量，計算回收率為99.19%，RSD值為0.99%。

2.3.1 色譜條件[5]采用Platisil ODS(250mm×4.6mm，5μm)色譜柱，以乙腈-0.05%磷酸溶液(19∶81)為流動相，流速為1.0 mL/min，檢測波長320nm，柱溫30℃，進樣量20μL。HPLC圖見圖2，含量結(jié)果見表1。理論塔板數(shù)按3，6’二芥子?；崽欠逵嬎悴坏陀?000，分離度大于1.5。

1.遠志酮Ⅲ ;2. 3，6’-二芥子酰基蔗糖

圖2 對照品(A)及炆遠志(B)色譜圖

2.3.3 供試品溶液的制備 取炆遠志粉末(過三號篩)約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇25mL，稱定重量，加熱回流1.5h，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。

2.3.4 線性關(guān)系考察 精密吸取2.3.2項下混合溶液0.5，1.0，1.5，2.5，3.5，5.0 mL，用甲醇定容于10 mL量瓶中，分別進樣3次，每次20μL，以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，得遠志酮Ⅲ的回歸方程Y=555.3X+0.413，R=0.9998；3，6’二芥子?；崽堑幕貧w方程Y=717.77X+2.1487 ，r=0.9999，且遠志酮Ⅲ進樣量在0.88～8.80μg、3，6’二芥子?；崽沁M樣濃度在1.08～10.80μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 按照“2.3.3”方法，取炆遠志1g，制備供試品溶液，密封、室溫保存，并分別于0，2，4，8，16，24h進樣，測定其峰面積，并計算遠志酮Ⅲ 、 3，6’二芥子酰基蔗糖的RSD值分別為2.12%、2.05%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復性試驗 取炆遠志粉末6份，每份各約1g，按“2.3.3”方法制備供試品溶液，按“2.3.1”測定含量，并計算遠志酮Ⅲ的RSD值為1.99%(n=6)，3，6’二芥子?；崽堑腞SD值為1.74%(n=6)，結(jié)果表明本方法重復性良好。

2.4 炆遠志的正交試驗及方差分析 根據(jù)炆遠志工藝流程，按照L9(34)的正交設(shè)計表進行試驗，得炆遠志飲片。按表1試驗安排，測定細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ 、 3，6’二芥子?；崽呛浚捎?015年版《中國藥典》第四部通則2201項下浸出物測定方法中醇溶性浸出物測定方法測定醇浸膏得率，并進行綜合加權(quán)評分。由于細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ、3，6’-二芥子?；崽鞘?015版《中國藥典》評價遠志質(zhì)量的指標，故在正交試驗結(jié)果的總體評價中，均給予權(quán)重系數(shù)0.3；醇浸膏得率為輔，給予權(quán)重系數(shù)0.1，以綜合值進行統(tǒng)計分析，綜合評分值M=(0.1a/36.48+0.3b/3.97+0.3c/0.51+0.3d/0.54)×100。實驗操作安排及結(jié)果見表1，方差分析見表2。

直觀分析表明，根據(jù)極差R的大小，可以判斷各因素對試驗結(jié)果的影響主次，由表1可以看出R2>R1> R3，所以因素對試驗指標影響的主次順序為B >A>C，即加水量影響最大，其次為加生甘草量和炆制時間。表2方差分析結(jié)果表明，B(加水量)對試驗結(jié)果存在顯著性影響(P<0.05)，A(加甘草量)、C(炆制時間)對試驗結(jié)果無顯著性影響(P>0.05)。同時比較F值大小可以得出因素對試驗結(jié)果影響的主次順序為B>A>C，與直觀分析結(jié)果相同。綜合以上分析，確定以A1B1C1為最適宜的提取工藝，即每炆制300g遠志加甘草量15g，3倍量水，炆制5h。

2.5 驗證實驗 為保證工藝的重復性和可行性，對優(yōu)選的方案A1B1C1進行驗證試驗，結(jié)果見表3。結(jié)果顯示，該工藝穩(wěn)定可行，重現(xiàn)性好。

3 討論

(1)炆遠志為江西建昌幫的特色炮制品種[6]，2015版《中國藥典》未收載，在2008版《江西中藥飲片炮制規(guī)范》雖有炆遠志的炮制品種，但沒有記載細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ、3,6’-二芥子?；崽堑暮繙y定方法及浸出物等質(zhì)量控制指標[3]。本文以采用HPLC法對炆遠志中細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ、3,6’-二芥子酰基蔗糖等遠志中重要的藥效成分進行了方法學考察及含量測定，在遠志酮Ⅲ、3，6’二芥子?；崽呛繙y定試驗中發(fā)現(xiàn)乙腈-0.05%磷酸溶液(18∶82)為流動相[5]時效果不及乙腈-0.05%磷酸溶液(19∶81)，故選用乙腈-0.05%磷酸溶液(19∶81)為流動相。

表1 炆遠志工藝正交試驗安排及結(jié)果分析表(n=3)

表2 方差分析

F0.05(2，2)=19。

表3 驗證試驗

(2)本試驗運用多指標綜合加權(quán)法，以醇浸物量，細葉遠志皂苷、遠志酮Ⅲ、3,6’-二芥子?；崽呛繛榭疾熘笜?，質(zhì)量控制指標選定注重與《中國藥典》2015版的一致性。最終確定的炮制工藝為炆制300g遠志加甘草15g，3倍量水，炆制5個h，經(jīng)3批驗證試驗，表明此工藝可行，為建昌幫傳統(tǒng)炮制技術(shù)炆法的規(guī)范化研究奠定了基礎(chǔ)，同時為地方炮制特色品種炆遠志的質(zhì)量控制提供參考。

(3)遠志化學成分主要包括皂苷類、酮類和糖酯類成分。其中細葉遠志皂苷是遠志總皂苷類堿水解的共同產(chǎn)物[7]，是遠志的主要活性成分之一，具有改善雌性小鼠抑郁的作用[8]；遠志酮Ⅲ具有抗抑郁及對CYP2E1酶有顯著抑制作用[9]，3，6’-二芥子?；崽蔷哂锌挂钟艋钚约霸鰪?-羥色胺和去甲腎上腺素的作用[13]，這三種成分為2015年版《中國藥典》中遠志含量測定的指標成分，以此為考察指標在一定的程度上可反映其內(nèi)在質(zhì)量，故本文采用以上三種成分及醇浸物為工藝的考察指標對炆遠志炮制工藝進行優(yōu)選，所優(yōu)選工藝的炆遠志與其他炮制品的差異，本課題組將進一步從藥效及指紋圖譜等方面進行研究。

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[2]張金蓮,曾昭君,潘旭蘭,等.礱糠在建昌幫中藥炮制中的應用[J].中草藥,2013,44(21):3 092-3 094.

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[4]江西省食品藥品監(jiān)督管理局.江西省中藥飲片炮制規(guī)范[S].上海:上?？茖W技術(shù)出版社,2008.

[5]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典·一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

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