茶樹內(nèi)生菌研究進(jìn)展

喬新榮

(信陽農(nóng)林學(xué)院 生物與制藥工程學(xué)院，河南 信陽464000)

植物內(nèi)生菌(Endophytes)是指部分生活史或全部生活史生活在健康植物組織細(xì)胞間隙，又不引起宿主植物明顯病害的微生物，包括內(nèi)生真菌、內(nèi)生細(xì)菌和內(nèi)生放線菌。自1898年Vogi從黑麥草種子內(nèi)分離出第一株內(nèi)生真菌以來，人們發(fā)現(xiàn)植物中存在大量的有價值的具有生理活性的內(nèi)生菌。近些年來，植物內(nèi)生菌作為一類新的天然藥物的微生物開發(fā)資源受到了廣泛的關(guān)注，并已成為國內(nèi)外研究的一個熱點(diǎn)。茶樹(Camellia sinensis)屬于藥用植物，茶葉的次生代謝物茶多酚、茶堿、有機(jī)酸、殺菌物質(zhì)等, 具有興奮解倦、消食去痰、解毒止渴、利尿明目、補(bǔ)充營養(yǎng)等功效。茶葉是一種天然保健飲品，被稱譽(yù)為21世紀(jì)的健康飲料，當(dāng)今全球有近半數(shù)人飲茶。因此開展茶樹內(nèi)生菌的研究，對防治茶樹病蟲害、提高茶葉的保健功能、開發(fā)新藥、降低藥物毒副作用等方面提供了一種新的手段。本文綜述了茶樹內(nèi)生菌的分離方法、分布特點(diǎn)、優(yōu)勢菌群以及生物學(xué)作用，為進(jìn)一步研究、開發(fā)茶樹內(nèi)生菌資源提供依據(jù)。

1　茶樹內(nèi)生菌的分離

1.1　茶樹內(nèi)生真菌的分離方法

茶樹內(nèi)生真菌分離的關(guān)鍵步驟是茶樹組織塊的表面消毒。研究表明，次氯酸鈉是最合適的表面消毒劑，并與酒精相結(jié)合,建立起一般性表面消毒的流程。張婉婷和張靈枝[1]優(yōu)化茶樹成熟葉片的分離條件為：先用75%乙醇浸泡1min，然后用3%的次氯酸鈉浸泡5min, 再用75%乙醇浸泡1min，最后用無菌水漂洗3次。而楊冠英[2]優(yōu)化葉的表面消毒方法為：首先75%的乙醇消毒 2min，5.2%的次氯酸鈉消毒 20s，最后用無菌水漂洗4次。茶葉表面消毒后，選用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)真菌，都達(dá)到了較好的分離效果。同時，楊冠英探索茶樹莖的表面消毒：75%乙醇 2min → 5.2%次氯酸鈉5min → 無菌水漂洗4次[2]。陳暉奇[3]消毒茶樹組織塊：70%乙醇60s → 3.5%次氯酸鈉4min → 70%乙醇30s → 無菌水沖冼3次，也能分離出茶樹內(nèi)生真菌。

1.2　茶樹內(nèi)生細(xì)菌的分離方法

茶樹內(nèi)生細(xì)菌的分離大多采用乙醇與升汞或乙醇與次氯酸配合進(jìn)行表面消毒，消毒后的組織塊研磨后，分離內(nèi)生細(xì)菌。例如洪永聰[4]取茶樹葉片1.0g，先用70%乙醇浸泡5min，再用0.2%升汞表面消毒2～3min，最后無菌水沖洗3次。晾干后的樣品無菌條件下加5mL無菌水研磨勻漿，靜止15min后，各取50μL涂平板，計算菌落數(shù)。而有些研究表明葉片用0.1%升汞表面消毒3～5 min[5]，或采用2%～3%的次氯酸浸泡處理10min[6]，用10%的次氯酸浸泡10min分離主根與側(cè)根中的內(nèi)生細(xì)菌也達(dá)到了比較好的效果[6]。

2　茶樹內(nèi)生菌的分布特點(diǎn)

2.1　茶樹內(nèi)生菌分布的多樣性

同其他植物一樣，茶樹內(nèi)生菌的分布具有多樣性和普遍性。陳暉奇[3]從994 個不同的茶樹組織塊中分離出 553個真菌菌株，且同一茶樹葉片中可分離到3～6種內(nèi)生真菌。游見明[8]從茶樹的根、莖、葉中分離得到 143 株內(nèi)生真菌，鑒定為 14 個屬。張宇玲等[9]從茶樹品種黃旦、鐵觀音中分別分離到18個、15個形態(tài)型的內(nèi)生真菌，其大多數(shù)為半知菌和子囊菌，少數(shù)為擔(dān)子菌。

2.2　季節(jié)影響內(nèi)生菌的分布

王明好[10]研究豫南地區(qū)茶園的茶樹內(nèi)生真菌表明，季節(jié)影響茶樹內(nèi)生真菌種類的分布，表現(xiàn)為夏、秋、冬、春季的內(nèi)生真菌種數(shù)依次呈遞增趨勢。李小容[11]對福建茶園的研究揭示5月份、10月份分離獲得的真菌種類較為豐富，二月分離的較少，這與王明好的研究結(jié)果不同，可能是由于不同的茶樹品種及不同的生境導(dǎo)致，具體原因需進(jìn)一步研究。另外，徐焰平[12]詳細(xì)研究了茶樹芒果球座菌(Guignardio mangiferae)在一年之中的分布規(guī)律，結(jié)果表明 2～4月及6月其分布較少，而5月、7～8月和12月是其分布的高峰期。

2.3　葉齡影響內(nèi)生菌的分布

謝麗華[13]研究結(jié)果表明葉片中內(nèi)生真菌的數(shù)量與葉齡呈正相關(guān)，進(jìn)一步分析揭示茶樹中內(nèi)生真菌的分離頻率與茶多酚含量呈負(fù)相關(guān)，而茶多酚的含量卻隨著葉片的成熟而下降，推測茶樹葉片的化學(xué)成份含量是影響內(nèi)生真菌分布的重要因素之一。陳暉奇[14]等的研究結(jié)果表明，幼葉主要分布內(nèi)生細(xì)菌，分離比例占65%，而成熟葉片中主要分布內(nèi)生真菌,分離比例占93.88%。在茶樹葉片成熟過程中，呈現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌漸減，而內(nèi)生真菌逐漸增多的較有規(guī)律的內(nèi)生菌種類演替。徐焰平[12]分離了不同季節(jié)茶樹扦插苗、實(shí)生苗、種子、落葉和葉片等組織中的芒果球座菌，結(jié)果表明新抽出的嫩葉芽中沒有芒果球座菌分布，隨著葉齡的增長成熟，其分離頻率逐步提高，在老葉中高達(dá)至73.5%。

2.4　茶樹品種影響內(nèi)生菌的分布

謝麗華[13]研究表明茶樹品種黃旦的內(nèi)生真菌分離頻率達(dá)100%，而福云六號只有7.5%。朱育菁[15]對采自福建寧德地區(qū)的大白毫和福云六號茶葉進(jìn)行內(nèi)生菌的分離，鑒定大白毫帶有紅桿菌屬、微桿菌屬、根瘤菌屬和貪噬菌屬的內(nèi)生細(xì)菌, 而福云六號僅含有根瘤菌屬和貪噬菌屬。徐焰平[12]的研究結(jié)果揭示茶樹品種是影響芒果球座菌分布的重要因素。同一環(huán)境兩茶樹品種之間優(yōu)勢真菌種類大致相同，但數(shù)量上存在差異[11]。這些研究結(jié)果表明茶樹品種不同或遺傳背景不同，其內(nèi)生菌的分布及種類存在明顯差異。

3　茶樹內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌群

不同地區(qū)的茶樹，內(nèi)生真菌優(yōu)勢菌群種類也不同。廣東茶區(qū)的優(yōu)勢內(nèi)生真菌分別是擬盤多毛孢屬(Pestalotiopsis sp.)、球座菌屬(Guignardia sp.)[11]。福建茶區(qū)的優(yōu)勢內(nèi)生真菌屬于球座菌屬、擬盤多毛孢屬、刺盤孢屬(Colletotrichum spp.)、炭疽菌屬(Colletotrichum sp.)和黑曲霉(Aspergillus niger)[3，13，16]。豫南茶區(qū)的優(yōu)勢內(nèi)生真菌鑒定為刺盤孢菌屬、大莖點(diǎn)霉屬(Macrophoma sp.)、擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis sp. )[10]。內(nèi)生真菌和茶樹長期共生，協(xié)同進(jìn)化，他們之間的互作關(guān)系受茶樹所含化學(xué)成分變化的影響。因此，不同茶區(qū)的內(nèi)生菌的優(yōu)勢菌群的差異暗示著茶樹的某些次生代謝產(chǎn)物的不同，深入探討優(yōu)勢菌群的作用機(jī)制將會為不同茶區(qū)茶葉的品質(zhì)差異及特色風(fēng)格提供理論依據(jù)，同時為開發(fā)茶樹內(nèi)生真菌資源提供一定的基礎(chǔ)。

4　茶樹內(nèi)生菌的生物學(xué)作用

4.1　影響茶樹的代謝產(chǎn)物積累

武漢琴[16]分離到1株促進(jìn)茶樹組培苗生長的內(nèi)生真菌，編號為CSN-18，屬于長枝木霉(Trichoderma longibrachtatum)。通過接菌和對照茶苗代謝產(chǎn)物含量的比較，發(fā)現(xiàn)CSN-18菌株影響宿主代謝產(chǎn)物茶多糖、兒茶素類及咖啡堿的含量。戴清良[17]研究表明內(nèi)生炭疽菌促進(jìn)了茶葉中多酚類物質(zhì)的積累，對茶葉的生化代謝產(chǎn)生了一定的影響，而且一些茶樹內(nèi)生真菌自身也能產(chǎn)生茶多酚，進(jìn)一步揭示了茶樹內(nèi)生真菌產(chǎn)生了與宿主相同的代謝產(chǎn)物。另外，曾如意[18]的研究結(jié)果則表明芒果球座菌增強(qiáng)了茶多酚的分解能力。

4.2　具有抑菌作用

戴清良[17]研究表明茶樹內(nèi)生球座菌和FHM菌的代謝產(chǎn)物對白色念珠菌(Candida albicans)都有抑制作用，且內(nèi)生真菌FHM代謝產(chǎn)物對炭疽菌、擬盤多毛孢菌、球座菌、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等也有明顯的抑制作用。陳丹[19]從茶樹內(nèi)生真菌芒果球座菌菌落表面分離到一株放線菌命名為BF-01，其為鏈霉菌屬卡伍爾鏈霉菌(Streptomyces cavourensis subsp)放線菌，具有廣譜抑菌性，且BF-01菌株的發(fā)酵液中含有兩種生物堿類雜環(huán)化合物，其具有很高的農(nóng)藥醫(yī)藥等應(yīng)用價值。將BF-01菌與內(nèi)生真菌芒果球座菌混合發(fā)酵培養(yǎng)建立復(fù)合菌系,以稻瘟菌為敏感指示菌,混合發(fā)酵液的抑菌效果比單培養(yǎng)顯著提高[20]。戴清良[19]的研究表明茶樹內(nèi)生真菌木霉和曲霉的混合發(fā)酵的代謝產(chǎn)物抑菌活性高，對茶花褐斑病菌的抑制率高達(dá)80.82%。謝麗華[13]從茶樹根部分離獲得的一株內(nèi)生青霉菌對茶葉的病原菌及黑曲霉有較強(qiáng)的抑制作用，其發(fā)酵液對其它7種病原菌也都有一定的抑制作用。洪永聰[14]從福建茶樹中分離到一株枯草芽孢桿菌菌株TL2，其具有較強(qiáng)的內(nèi)生定殖能力、拮抗能力強(qiáng)且拮抗譜廣，對茶輪斑病的抑制及氯氰菊醋的降解作用都強(qiáng)。曾如意[18]分離純化得到的一株炭角菌屬(Xylaria sp.)的真菌菌株(編號為Ic112517)進(jìn)行培養(yǎng)，它產(chǎn)生的多酚類和過氧化氫等化合物，對芒果球座菌有一定的抑制作用。李紹鋒和楊民和[21]分離了一株淡紫擬青霉內(nèi)生真菌，通過對峙培養(yǎng)和發(fā)酵液的抑菌試驗(yàn)研究表明，該菌株對7種茶樹內(nèi)生真菌和10種植物病原菌均有較強(qiáng)的抑菌作用，其發(fā)酵液對供試的16 種真菌具有不同程度的抑制作用。此外，黃曉琴[22]等從茶樹內(nèi)生菌中鑒定了一株解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)的菌株，將有利于冰核細(xì)菌生物防治的開展。朱育菁[15]從7份茶葉樣品中共分離到16株細(xì)菌、1株真菌，其中有11株內(nèi)生菌抑制了10種供試病原菌的生長, 其中放射根瘤菌Eb659菌株具有廣譜抗菌作用，具有作為開發(fā)生防菌防治植物病害的潛力。

4.3　產(chǎn)色素作用

微生物色素可作為天然色素, 可用于食品、醫(yī)藥、輕工業(yè)等領(lǐng)域。盧東升[23]等從健康茶樹的成熟葉片中分離的一株不產(chǎn)孢內(nèi)生真菌H8菌株, 該菌株為鐮刀菌屬( Fusarium )真菌, 其有性型為子囊菌，其菌絲可產(chǎn)生大量紅色色素, 所產(chǎn)色素性質(zhì)穩(wěn)定。

東莞城市發(fā)展迅速，城區(qū)不斷擴(kuò)大，各種基建都需要大量征地，商業(yè)、公益用地也需要拆遷，例如東莞市新城區(qū)的規(guī)劃、環(huán)省高速的建設(shè)、地鐵的修建、學(xué)校用地的拆遷等等。這些征地在開掛之后增值收益是巨大的。政府對于居民拆遷補(bǔ)償沒有落實(shí)到位，從國家立法來看，拆遷補(bǔ)償方面立法缺失，加劇了社會矛盾。這些居民用地與政府規(guī)劃用地的沖突也造成了很多社會問題，嚴(yán)重的甚至?xí)l(fā)生暴力事件，例如政府暴力拆遷、居民暴力拒拆，這也會拖緩城市現(xiàn)代化發(fā)展，造成了很多社會不安穩(wěn)因素。

5　結(jié)語

眾所周知，茶葉具有一定的藥理和保健作用，但茶葉化學(xué)成分復(fù)雜，有效成分含量低。開發(fā)茶樹內(nèi)生菌是提高茶樹活性成分含量和產(chǎn)量的有效手段之一。許多學(xué)者現(xiàn)已對茶樹內(nèi)生菌的分離方法、分布規(guī)律、不同地區(qū)優(yōu)勢菌種的鑒定、生物學(xué)作用等方面進(jìn)行了研究和探討，但還不夠深入，不夠系統(tǒng)化。如內(nèi)生真菌與茶樹活性成分生物合成之間關(guān)系的研究尚缺乏一定的深度；從細(xì)胞水平和分子水平探究內(nèi)生真菌的代謝調(diào)控機(jī)制還很少等。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，將綜合利用植物藥學(xué)、微生物學(xué)及分子生物學(xué)等領(lǐng)域的研究理論和方法，深入探討茶樹內(nèi)生菌次生代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為茶葉活性成分的生物學(xué)機(jī)制，并利用內(nèi)生菌易繁殖的特點(diǎn)，滿足市場對茶葉藥用活性成分的需求。