磷酸西他列汀片的質(zhì)量控制

張金芬，周禹宏，李繼彬，邢正英，房志仲

（天津醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,天津市臨床藥物關(guān)鍵技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300070）

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）是一種以慢性高血糖為特征的代謝紊亂性疾病，可累及全身各個系統(tǒng)，誘發(fā)嚴(yán)重的并發(fā)癥，危害人體健康。其中，90%以上為 2 型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)[1-2]。研究表明，2型糖尿病的發(fā)病呈逐漸加重的流行趨勢[3]。傳統(tǒng)的治療2型糖尿病的藥物主要為雙胍類藥物二甲雙胍、磺脲類藥物格列本脲、TZD類藥物羅格列酮、格列奈類藥物瑞格列奈等，其副作用如體質(zhì)量減輕、低血糖、惡心嘔吐、水腫等限制了其在臨床上的使用[4]。故開發(fā)和研究新型抗糖尿病藥物對治療糖尿病具有重要意義。近年來，隨著人類對糖尿病發(fā)病機(jī)制的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一些具有降血糖作用的新靶點(diǎn)[5-6]，二肽基肽酶-4(DPP-4)即為其中1種，DPP-4可使具有血糖下調(diào)作用的胰升糖素樣肽-1（GLP-1）及糖依賴性胰島素釋放肽（GIP）裂解失活，隨之研發(fā)出的DPP-4抑制劑可通過選擇性地抑制DPP-4，減少二者在體內(nèi)的失活，延長內(nèi)源性的GLP-1及GIP的活性作用時間，促進(jìn)胰島B細(xì)胞分泌胰島素的同時降低胰高血糖素的濃度，通過雙途徑發(fā)揮降血糖的作用。磷酸西他列汀為首個治療2型糖尿病的DPP-4抑制劑[7]，近年來廣泛用于治療2型糖尿病[8]。已有研究表明，磷酸西他列汀治療2型糖尿病效果十分理想[9-10]。作為一種新型抗糖尿病藥物，磷酸西他列汀具有血糖依賴性，降糖作用適中，在增加胰島素分泌的同時不會發(fā)生低血糖，有效減輕饑餓感等優(yōu)勢，且無惡心嘔吐、水腫及增加體質(zhì)量等副作用[11-14]。本課題對自制的磷酸西他列汀片進(jìn)行了質(zhì)量控制方面的研究，摸索高效液相色譜法條件，建立自制制劑中主藥的質(zhì)量控制方法。同時參照歐洲藥典[15]，建立磷酸西他列汀片溶出度的有效測定方法。

1 材料與方法

1.1 試藥 供試品：磷酸西他列汀片（自制）；參比制劑：磷酸西他列汀片（捷諾維?杭州默沙東制藥有限公司，批號：L030511）；對照品：磷酸西他列汀（武漢遠(yuǎn)程共創(chuàng)科技有限公司，批號：20160808）；甲醇（天津康克德科技有限公司，色譜純）；其他試劑均為市售分析純；蒸餾水（自制）。

1.2 儀器 高效液相色譜儀（美國Spectra-Physics）；柱溫箱（Model100，天津市威儀科技發(fā)展有限公司）；Anastar色譜工作站（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；RCZ-8A智能溶出儀（北京宏昌信科技有限公司）；電子分析天平（天津博達(dá)宏力科技發(fā)展有限公司）；80-2B型臺式離心機(jī)（蘇州裕宸儀器有限公司）；TS-6A型超聲波清洗器（常州華冠儀器有限公司）；酸度計PHS-25（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；U-3310分光光度計（天美科技有限公司TECHCOMPLIMITED）。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 TIANHE?KromasilC18色譜柱（200 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.1%HClO4=45∶55；檢測波長 λ=205nm；流速為 0.8mL/min；柱溫為25℃；進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2 溶液制備 （1）對照品溶液的制備：精密稱取磷酸西他列汀對照品12.87 mg至50 mL量瓶中，加入流動相溶解并定容，搖勻即得儲備液；精密量取2 mL上述儲備液置于10 mL量瓶中，流動相稀釋并定容，搖勻即得磷酸西他列汀對照品溶液。（2）供試品溶液的制備：取3片自制樣品研磨均勻，精密稱取99.61 mg至50 mL量瓶中，流動相超聲溶解后定容，搖勻；2 000 r/min離心5 min，上清液采用微孔濾膜過濾，精密移取續(xù)濾液2 mL至10 mL量瓶中，流動相稀釋并定容，搖勻，即得供試品溶液。（3）陰性對照品溶液的制備：按照自制制劑處方制備不含磷酸西他列汀的空白制劑，按照上述供試品溶液的制備方法制成陰性對照品溶液。

1.3.3 專屬性試驗(yàn) 分別吸取“1.3.2”項(xiàng)下配制的對照品溶液及陰性對照品溶液各20 μL進(jìn)樣，按照“1.3.1項(xiàng)下”的色譜條件進(jìn)行測定并記錄色譜圖。

1.3.4 線性關(guān)系考察 精密稱取磷酸西他列汀對照品64 mg至100 mL量瓶中，適量流動相超聲溶解后稀釋至刻度，搖勻，即得0.64 mg/mL的磷酸西他列汀對照品儲備液；使用移液管精密量取上述對照品儲備液 0.1、0.7、0.9、1.0、1.1、1.3 和 1.5 mL 至 10 mL量瓶中，流動相稀釋至刻度，搖勻，即得6.4、44.8、57.6、64、70.4、83.2 和 96 μg/mL 的對照品溶液。取上述溶液20 μL，按照“1.3.1項(xiàng)下”的色譜條件進(jìn)行測定并記錄其色譜圖，對其峰面積進(jìn)行線性回歸。

1.3.5 精密度試驗(yàn) （1）重復(fù)性試驗(yàn)：按照“1.3.1項(xiàng)下”供試品溶液的制備方法對同一批樣品進(jìn)行處理得到樣品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按照“1.3.1項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)行測定，計算峰面積的RSD。（2）中間精密度：在不同的檢查日期，采用不同的分析儀器，不同的試驗(yàn)人員，按照“重復(fù)性試驗(yàn)”方法測定，計算峰面積的RSD。

1.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“1.3.2項(xiàng)下”配制的對照品溶液，分別于第 0、4、8、12、24 h 進(jìn)樣，按照“1.3.1 項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)行測定，計算峰面積的RSD。

1.3.7 準(zhǔn)確度試驗(yàn) （1）對照品儲備液的配制：精密稱取磷酸西他列汀對照品64 mg至100 mL量瓶中，適量流動相超聲溶解后定容，搖勻，靜置待用；（2）全輔料儲備液的配制：將輔料（5片量）按照處方比例混合均勻，取285 mg至100 mL量瓶中，流動相超聲溶解后定容，搖勻，離心，取上清液，靜置待用；（3）分別精密量取上述全輔料儲備液1.0 mL，再分別量取上述對照品儲備液0.8、1.0和1.2 mL置10 mL量瓶中，流動相稀釋至刻度，搖勻，即得80%、100%、120%的回收率待測溶液；按照“1.3.1項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)樣，每個濃度平行測定3次，記錄色譜圖，計算主藥的加入濃度與檢驗(yàn)濃度，并求出回收率。

1.3.8 含量測定 根據(jù)“1.3.2項(xiàng)下”供試品溶液的制備方法對自制的3批樣品進(jìn)行處理得到樣品溶液，進(jìn)樣，按照“1.3.1項(xiàng)下”色譜條件進(jìn)行測定，采用外標(biāo)一點(diǎn)法計算磷酸西他列汀濃度。

1.3.9 溶出度測定

1.3.9.1 溶出介質(zhì)的配制：蒸餾水煮沸脫氣；0.01mol/L HCl：取0.9 mL濃鹽酸至1 000 mL純水中，攪拌使混合均勻，即得；PBS4.5：精密稱取磷酸二氫鉀7.8g于適量純水中，超聲使其完全溶解后，加純水至1 000mL，攪拌使均勻，即得；PBS 6.8：分別精密稱取磷酸二氫鉀6.804 5 g、氫氧化鈉0.944 g于適量純水中，超聲使其完全溶解后，加純水至1 000 mL，攪拌使均勻，即得。

1.3.9.2 溶出度測定方法及線性關(guān)系考察：分別精密稱取磷酸西他列汀12.87 mg至4個100 mL量瓶中，純水、0.01 mol/L HCl、PBS 4.5、PBS 6.8 分別作溶劑，超聲使溶解完全，定容，搖勻，即得對照品儲備液；分別精密量取上述對照品儲備液0.5、0.7、0.9、1.0、1.1、1.3和1.5 mL至10 mL量瓶中，各溶劑稀釋并定容，搖勻，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度，對其吸光度進(jìn)行線性回歸。

1.3.9.3 對照品溶液的配制：分別精密量取“1.3.9.2”項(xiàng)下4種對照品儲備液各1 mL至10 mL量瓶中，各溶劑稀釋并定容，搖勻，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度。

1.3.9.4 參比制劑溶出度測定：取磷酸西他列汀片4片，分別記錄其片重，按照《中國藥典》四部附錄溶出度測定Ⅰ法，采用漿法，50 r/min，溫度：（37±0.5）℃，分別以純水、0.01 mol/L HCl、PBS 4.5、PBS 6.8 各 1 000 mL 為溶出介質(zhì)，于第 5、10、15、20、30、45和60 min取溶出液10 mL，過濾，取續(xù)濾液1 mL至10 mL量瓶中，溶出介質(zhì)稀釋并定容，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度值，同時補(bǔ)加等量恒溫介質(zhì)；按對照品溶液的濃度及吸光度值計算參比制劑各時間點(diǎn)的取樣濃度及累積溶出度，繪制累積溶出度曲線。

1.3.9.5自制制劑溶出度測定：取自制制劑4片，分別記錄其片重，按照《中國藥典》四部附錄溶出度測定Ⅰ法，采用漿法，50 r/min，溫度：（37±0.5）℃，分別以純水、0.01 mol/L HCl、PBS 4.5、PBS 6.8 各 1 000 mL為溶出介質(zhì)，于第 1、3、5、10、15 和 60 min 取溶出液10 mL，過濾，取續(xù)濾液2 mL至10 mL量瓶中，溶出介質(zhì)稀釋并定容，按照紫外分光光度法，于205 nm波長下測定其吸光度，平行測定3次，記錄其吸光度值，同時補(bǔ)加等量恒溫介質(zhì)；按對照品溶液的濃度及吸光度值計算自制制劑各時間點(diǎn)的取樣濃度及累積溶出度，繪制累積溶出度曲線，計算自制制劑與參比制劑的累積溶出度相似因子f(2)。

2 結(jié)果

2.1 專屬性試驗(yàn)色譜圖 見圖1。在“1.3.1項(xiàng)下”的色譜條件下，主藥色譜圖不受輔料影響，表明采用該色譜條件進(jìn)行含量測定時專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)Fig 1 Specific test

2.2 線性關(guān)系考察結(jié)果 以磷酸西他列汀的峰面積(A)對濃度(C)作線性回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為 A=22968.4427C-3504.03，r=0.999 8，表明磷酸西他列汀濃度在6.4~96 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 磷酸西他列汀重復(fù)性試驗(yàn)的RSD為0.94%（n=6）；中間精密度試驗(yàn)的RSD為0.77%（n=6），表明精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果 磷酸西他列汀穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD為0.60%，表明磷酸西他列汀在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5 回收率試驗(yàn)結(jié)果 如表1所示，自制磷酸西他列汀片中西他列汀的平均回收率為100.74%，RSD為0.46%，符合要求。

表1 磷酸西他列汀的回收率試驗(yàn)Tab 1 The recovery tests of sitagliptin phosphate

2.6 含量測定結(jié)果 3批樣品中磷酸西他列汀的含量測定結(jié)果見表2。

表2 磷酸西他列汀的含量測定結(jié)果Tab 2 Content determination of sitagliptin phosphate

2.7 溶出度試驗(yàn)結(jié)果

2.7.1 線性考察結(jié)果 分別以磷酸西他列汀的吸光度（Abs）對濃度（C）作線性回歸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到4個線性方程分別為：水，y=42.8286x+0.0340，r=0.9995；HCl，y=37.9714x+0.1086，r=0.999 6；PBS 4.5，y=41.9286x+0.0417，r=0.999 8；PBS 6.8，y=42.3429x+0.0450，r=0.999 9。表明磷酸西他列汀濃度在5~15 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，其濃度與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.7.2 累積溶出度曲線 繪制自制磷酸西他列汀片與參比制劑在4種溶出介質(zhì)中的溶出曲線，計算累積溶出度，結(jié)果見圖2~5。自制制劑與參比制劑的累積溶出度在4種溶出介質(zhì)中的相似因子f(2)分別為64、87、63、59，均大于 50。表明自制制劑與參比制劑具有相似的溶出行為，自制制劑溶出良好。

圖2 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在水中的溶出曲線Fig 2 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in H2O

圖3 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在0.01 mol/L HCl中的溶出曲線Fig 3 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in 0.01 mol/L HCl

圖3 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在PBS4.5中的溶出曲線Fig 3 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in PBS 4.5

圖4 自制磷酸西他列汀片與市售磷酸西他列汀片在PBS6.8中的溶出曲線Fig 4 The dissolution profile of sitagliptin phosphate tablets and control agents in PBS 6.8

3 討論

3.1 色譜條件的篩選 經(jīng)查閱歐洲藥典及美國藥典[16]得到磷酸西他列汀含量測定的色譜條件為：流動相乙腈-1.36 g/L磷酸二氫鉀-磷酸緩沖液（磷酸調(diào) pH 為 2.0）（15∶85），流速 1.0 mL/min，柱溫 30 ℃，檢測波長為205 nm。考慮到此流動相其鹽溶液部分pH為2.0過酸，可能會對色譜柱損害，故不予考慮。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[17]得磷酸西他列汀含量測定的色譜條件為：甲醇-0.1%高氯酸 (32∶68)，流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測波長268 nm。將磷酸西他列汀對照品在上述色譜條件下進(jìn)行進(jìn)樣分析，其主峰保留時間約30 min，保留時間過長，多次更改甲醇-0.1%高氯酸比例及流速調(diào)整主峰保留時間，考察柱溫對色譜峰的影響，同時將磷酸西他列汀對照品按照紫外分光光度法在200~350 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，確定其最大吸收波長。最終得到磷酸西他列汀含量測定的色譜條件為：流動相甲醇-0.1%高氯酸（45∶55），流速 0.8 mL/min，柱溫為 25 ℃，檢測波長為205 nm。

3.2 供試品溶液的制備方法 試驗(yàn)中我們調(diào)整甲醇-0.1%高氯酸比例制備供試品溶液，按照上述色譜條件于0、4、8、12和24 h進(jìn)樣，觀察其主峰峰面積變化，考察其穩(wěn)定性，發(fā)現(xiàn)磷酸西他列汀在甲醇-0.1%高氯酸任何比例的溶液中都較穩(wěn)定，其RSD值均小于2.0%，且進(jìn)樣分析時色譜峰峰形好。為方便實(shí)驗(yàn)操作，故采用流動相作為磷酸西他列汀稀釋液溶解藥品。

3.3 溶出方法的選擇 經(jīng)查閱歐洲藥典得磷酸西他列汀片的溶出方法為：轉(zhuǎn)速50 r/min，溶出介質(zhì)0.01 mol/L HCl(1 000 mL)，溶出時間30 min。查閱其他相關(guān)資料得磷酸西他列汀片的溶出方法為：轉(zhuǎn)籃法，轉(zhuǎn)速100 r/min，溶出介質(zhì)水(900 mL)，溶出時間30 min。為了更好地考察磷酸西他列汀在不同pH條件下的溶出行為，我們采用水、0.01 mol/L HCl、PBS4.5及PBS6.8作為4種溶出介質(zhì)；考慮到人體胃腸道的生理環(huán)境及蠕動速度，擬定轉(zhuǎn)速為50r/min。最終得到磷酸西他列汀片的溶出方法為：漿法，轉(zhuǎn)速 50 r/min，溶出介質(zhì)水、0.01 mol/L HCl、PBS4.5 及PBS6.8（1 000 mL），溶出時間 60 min。

3.4 溶出樣品溶液的配制 為使試驗(yàn)操作簡便易行，試驗(yàn)中我們采用紫外分光光度法進(jìn)行溶出樣品溶液的測定。由于采用紫外分光光度法測定樣品溶液的吸光度時，以樣品溶液的吸光度度數(shù)在0.3~0.7之間為宜，試驗(yàn)中我們通過嘗試確定將溶出樣品溶液的濃度稀釋5倍，使其吸光度度數(shù)在0.3~0.7之間。

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