澤瀉湯對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化脂質(zhì)沉積及其IL—1β表達(dá)的影響

林高城　陳云歡　+楊莉惠　魏偉　+鄒愉龍　陳雨

【摘要】 目的：觀察澤瀉湯對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化脂質(zhì)沉積及IL-1β表達(dá)的影響。方法：采用 Ox-LDL（ 50 mg/L）處理大鼠腹腔巨噬細(xì)胞24 h，采用20%澤瀉湯血清干預(yù)后，油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況；酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測(cè)定各組細(xì)IL-1β表達(dá)情況。結(jié)果：成功建立巨噬細(xì)胞泡沫化模型；相比于空白組的巨噬細(xì)胞，模型組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積增加明顯，實(shí)驗(yàn)組巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積顯著減少，IL-1β呈低水平表達(dá)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。結(jié)論：Ox-LDL（50 mg/L） 處理巨噬細(xì)胞可以成功建立巨噬細(xì)胞泡沫化模型。澤瀉湯能改善巨噬細(xì)胞泡沫化過程的脂質(zhì)沉積，其作用機(jī)制可能是通過下調(diào)IL-1β的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。

【關(guān)鍵詞】 澤瀉湯； 泡沫細(xì)胞； IL-1β

Effect of Alisma Decoction on Lipid Deposition and Expression of IL-1β on Macrophagic Foam Cell Formation/LIN Gaocheng，CHEN Yunhuan，YANG Lihui，et al.//Medical Innovation of China，2017，14（35）：025-028

【Abstract】 Objective：To observe the effect of Alisma Decoction on lipid deposition and the expression of IL-1βon macrophagic foam cell formation.Method：Macrophagic foam cell formation was established after induction with oxidized low density liprotein（ox-LDL，50 mg/L） for 24 h and then the cells were intervened with 20% Alisma Decoction-containing serum.Oil red O staining to detect the lipid deposition in cells.Enzyme linked immunosorbent assay（ELISA） was used to determine the expression of IL-1β the cells of each group.Result：Ox-LDL（50 mg/L） treated macrophages successfully to establish macrophage foam model.Compared with the control group of macrophages，macrophage lipid deposition in the model group increased.The lipid deposition of macrophages in the experiment group decreased obviously.IL-1β was low expressed in the experiment group and the blank group.The level of IL-1β expression in the experiment group was significantly lower than that of the model group（P<0.01）.Conclusion：Ox-LDL（50 mg/L） treated macrophages successfully established a macrophage foam model.Alisma decoction can improve the lipid deposition in the process of macrophage foaming，this may be achieved by down regulation of IL-1β expression.

【Key words】 Alisma Decoction； Foam cell； IL-1β

First-authors address：Rehabilitation Hospital Affiliated of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou 350000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.35.007

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是嚴(yán)重危害人類健康的常見病、多發(fā)病，是腦卒中和心肌梗死等疾病發(fā)病的共同基礎(chǔ)。隨著人們生活方式以及飲食習(xí)慣的改變，其發(fā)病呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)。醫(yī)學(xué)家張仲景創(chuàng)立澤瀉湯，首載于《金匱要略·痰飲咳嗽病脈證并治》，全方僅由澤瀉和白術(shù)這兩味藥物，據(jù)現(xiàn)代基礎(chǔ)試驗(yàn)研究表明本方具有改善脂肪代謝、利尿、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用[1-3]。此次研究通過巨噬細(xì)胞泡沫化模型的建立，觀察澤瀉湯對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化脂質(zhì)沉積的影響，探討其與IL-1β的相關(guān)性，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料 Ox-LDL購自廣州奕源生物公司，胎牛血清購自FAA有限公司，油紅O購自Sigma公司，蘇木素購自北京中杉金橋公司，RPMI1640培養(yǎng)基購自廣州碩恒生物科技有限公司，ELISA檢測(cè)試劑盒購自武漢默沙克生物????科技有限公司。SD 大鼠（雄性）40 只，購自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（許可證號(hào)：SCXK（閩）2012-0001），細(xì)胞培養(yǎng)箱（武漢普諾賽生命科技有限公司），倒置顯微鏡（北京瑞億斯科技有限公司）等。endprint

1.2 制備澤瀉湯 據(jù)《金匱要略》原方劑量比例配置澤瀉湯，由澤瀉、白術(shù)組成澤瀉湯，福建省康復(fù)醫(yī)院藥劑科提供藥品，以上中藥均符合《中華人民共和國藥典》2005年版有關(guān)規(guī)定。制備相當(dāng)于生藥材2.64 g/mL的藥液：第一次煎藥添加水量與藥量的比為6∶1，浸泡1 h后再煎20 min；第二次煎藥添加水量與藥量的比為4∶1，煎0.5 h后兩次藥液混合，再濃煎蒸餾，制備完畢后4 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 SD大鼠腹腔巨噬細(xì)胞提取及細(xì)胞培養(yǎng) 先向SD大鼠腹腔內(nèi)注射10 mL RPMI1640培養(yǎng)液，72 h后以頸椎脫臼法處死。然后腹腔內(nèi)注射RPMI1640培養(yǎng)液10 mL，75%酒精浸泡5 min，嚴(yán)格無菌操作條件收集腹腔內(nèi)液，1500 r/min離心5 min后收集細(xì)胞，用含10%胎牛血清的無酚紅RPMI1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞數(shù)至5×106 mL/L，將細(xì)胞接種到覆有蓋玻片的6孔板和25 cm2培養(yǎng)瓶中，置5% 二氧化碳、37 ℃孵箱培養(yǎng)6 h，經(jīng)顯微鏡觀察細(xì)胞貼壁后棄去上清液，PBS沖洗液洗去未貼壁細(xì)胞。

1.4 澤瀉湯含藥血清的制備 清潔級(jí)雄性SD 大鼠40 只，體重200～210 g。飼養(yǎng)4 d后，清潔級(jí)雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白血清組（注射相同量的生理鹽水）和澤瀉湯含藥血清組，隨機(jī)分配各組20只。按大鼠重量100 g給予1 mL灌胃給藥，每天灌藥2次，連續(xù)灌藥7 d，第8天灌藥2 h后腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血，于4℃ 3000 r/min離心10 min分離血清。全部離心后合并血清，56 ℃滅活30 min，微孔濾膜過濾除菌，于-20 ℃保存待用。制備完畢后的血清均在4周內(nèi)使用。

1.5 細(xì)胞干預(yù)方法以及分組 模型組：大鼠腹腔巨噬細(xì)胞+Ox-LDL （泡沫細(xì)胞，50 mg/L），培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞備用；空白組：大鼠腹腔巨噬細(xì)胞+20%正常大鼠血清，培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞備用； 實(shí)驗(yàn)組：在大鼠腹腔巨噬細(xì)胞+Ox-LDL （泡沫細(xì)胞，50 mg/L）孵育24 h后，加入含有20%澤瀉湯含藥血清的RPMI1640培養(yǎng)基孵育細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后提取細(xì)胞備用，以上每組實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.6 油紅O及蘇木素染色 先取出干預(yù)后細(xì)胞（6孔板），然后PBS 洗滌細(xì)胞標(biāo)本1次，之后用4%多聚甲醛固定15 min，緊接油紅O染色細(xì)胞10 min，蘇木素染色細(xì)胞5 min，最后10 mL/L HCl分色及返藍(lán)，水性封片劑封片備用。普通顯微鏡下觀察，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色。

1.7 ELISA檢測(cè)各組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞IL-1β的表達(dá) 收集各組細(xì)胞的上清液，采用雙抗體一步夾心法ELISA法。往預(yù)先包被IL-1β抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，最后加終止液硫酸。用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 含有澤瀉湯血清干預(yù)后對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成率的影響 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞與Ox-LDL共同培養(yǎng)48 h后，然后用PBS洗滌孵育后的細(xì)胞2次，試驗(yàn)中先后采用油紅O與蘇木素染色，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)存在大量紅色的脂滴，蘇木素染色后細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞偽足在模型組明顯增加，以上特征均提示巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞成功建立，使用20%澤瀉湯含藥血清干預(yù)后的細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顏色較前明顯變淡，充分提示脂質(zhì)沉積減輕，見圖1。

2.2 澤瀉湯含藥血清對(duì)巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞IL-1β濃度的影響 模型組IL-1β濃度為（12.5±0.48）ng/L，空白組為（7.52±0.52）ng/L，實(shí)驗(yàn)組為（9.61±0.42）ng/L，模型組與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），實(shí)驗(yàn)組與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

3 討論

隨著人們生活水平的提高及飲食習(xí)慣的改變，AS為病理基礎(chǔ)的心腦血管疾病發(fā)生率呈逐年上升趨勢(shì)，并成為致死的重要原因。尋找AS的發(fā)病機(jī)制，并以此為作用點(diǎn)延緩或逆轉(zhuǎn)AS發(fā)生及發(fā)展，是降低腦中風(fēng)、心肌梗死等心腦血管疾病的關(guān)鍵因素。AS是一個(gè)復(fù)雜而漫長的過程，脂質(zhì)氧化和炎性反應(yīng)在其形成與發(fā)展中起著關(guān)鍵性作用[4-6]，它的發(fā)展起源于內(nèi)皮細(xì)胞的功能失調(diào)導(dǎo)致炎癥細(xì)胞的激活，使單核細(xì)胞粘附并聚集在血管內(nèi)膜下形成巨噬細(xì)胞。

巨噬細(xì)胞在AS形成中起重要作用，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)后分化成為泡沫細(xì)胞[7]，這是AS形成過程中重要的病理基礎(chǔ)。Ox-LDL與巨噬細(xì)胞匯集后，巨噬細(xì)胞膜上有關(guān)蛋白被進(jìn)一步激活，通過清道夫受體攝取Ox-LDL，巨噬細(xì)胞最終形成泡沫細(xì)胞，并分泌各種介質(zhì)，如IL-1β和大量基質(zhì)蛋白酶等，促進(jìn)AS的形成。

東漢時(shí)期張仲景在《金匱要略》中首創(chuàng)澤瀉湯，現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明，澤瀉湯具有降脂、利水、抗動(dòng)脈粥樣硬化等藥理作用，在心腦血管疾病中應(yīng)用甚廣。劉金元等[8]通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)澤瀉湯對(duì)大鼠血脂代謝及血液流變學(xué)指標(biāo)有調(diào)節(jié)作用，對(duì)AS具有逆轉(zhuǎn)作用，其可降低動(dòng)脈粥樣斑塊內(nèi)脂質(zhì)體。王玉仙等[9]應(yīng)用澤瀉湯治療脂肪代謝異常，發(fā)現(xiàn)該方可改善脂肪代謝異常所致臨床癥狀，而且能抑制脂類物質(zhì)吸收，明顯降低膽固醇水平；但是其作用機(jī)制是否與IL-β有關(guān)，目前尚未見研究報(bào)道。

IL-1β通過與配體的結(jié)合介導(dǎo)單核細(xì)胞在血管內(nèi)皮表面粘附聚集，在AS過程中發(fā)揮重要作用[10]。Olofsson等[11]采用RT-PCR對(duì)人腎動(dòng)脈IL-1β的mRNA水平進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示動(dòng)脈粥樣斑塊處IL-1β的mRNA水平顯著高于健康人群。Lindholm等[12]以脂蛋白處理后的巨噬細(xì)胞作為研究對(duì)象，含IL-1β的培養(yǎng)基培養(yǎng)上述細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)IL-1β可明顯減少上述巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)代謝，而且增加內(nèi)源性泡沫細(xì)胞的形成。目前研究認(rèn)為IL-1β可通過多種途徑參與AS進(jìn)程[13-18]，IL-1β可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種粘附分子及趨化因子，使血管通透性增加以及產(chǎn)生有細(xì)胞毒性的脂質(zhì)過氧化物；可刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，提高凝血酶原活性，促進(jìn)中性粒細(xì)胞對(duì)血管壁的粘附及平滑肌細(xì)胞增生，外周血單核細(xì)胞遷入內(nèi)皮下間隙被激活并分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而攝取脂質(zhì)形成泡沫細(xì)胞，從而促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展。endprint

在本研究中通過油紅O染色的方法觀察巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積情況，成功建立巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞模型，并發(fā)現(xiàn)澤瀉湯含藥血清干預(yù)后的細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴顏色較淡，脂質(zhì)沉積減輕，提示澤瀉湯具有改善脂質(zhì)代謝作用，而改善脂質(zhì)代謝在抗AS過程中起到基石作用。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組泡沫細(xì)胞的IL-1β呈高水平表達(dá)，加入澤瀉湯含藥血清后能夠明顯降低IL-1β的表達(dá)水平， 提示澤瀉湯對(duì)泡沫化的巨噬細(xì)胞分泌的IL-1β有抑制作用，而IL-1β在AS進(jìn)程中起到重大推動(dòng)作用[19-20]。因此筆者推測(cè)澤瀉湯可能通過抑制IL-1β表達(dá)以改善巨噬細(xì)胞泡沫化進(jìn)程中脂質(zhì)沉積。并進(jìn)一步抑制AS的發(fā)生與發(fā)展，該試驗(yàn)研究結(jié)果進(jìn)一步證明澤瀉湯抗AS的藥理作用，為以后研究澤瀉湯提供了新的思路和理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2017-08-16） （本文編輯：程旭然）endprint