模式動(dòng)物斑馬魚(yú)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究中的應(yīng)用

黃春念，張晶晶

(廣東醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 湛江　524001)

斑馬魚(yú)，原產(chǎn)于印度、孟加拉國(guó)等地，屬于輻鰭亞綱鯉行目鯉科短擔(dān)尼魚(yú)屬，近年來(lái)已成為在發(fā)育生物學(xué)與疾病模型研究中應(yīng)用最廣泛的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一。野生斑馬魚(yú)的全基因組與人類(lèi)基因組的相似度高達(dá)87%，使得兩者在大部分發(fā)育信號(hào)通路上也是保守的[1]。一方面，作為脊椎動(dòng)物，斑馬魚(yú)的心血管、視覺(jué)、神經(jīng)、消化和血液系統(tǒng)都與人類(lèi)有著相似的發(fā)育機(jī)制和特點(diǎn)，使得其能作為模式動(dòng)物應(yīng)用于人類(lèi)很多系統(tǒng)的發(fā)育及其相關(guān)疾病的研究；另外一方面，如Tol2轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因捕獲突變和轉(zhuǎn)基因技術(shù)、嗎啉基反義寡核苷酸(morpholino, MO)介導(dǎo)的基因下調(diào)技術(shù)和CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)等多種遺傳操作方法及高分辨率活體成像技術(shù)的發(fā)展，極大地推動(dòng)了斑馬魚(yú)在疾病研究中的應(yīng)用，使得其能更好地在體研究各種疾病病理進(jìn)程中的分子基礎(chǔ)和潛在的遺傳相互作用[2]。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system, CNS)疾病是老年人高發(fā)病率和高死亡率的主要原因之一，由于CNS的再生能力有限，神經(jīng)退行性變疾病或神經(jīng)損傷后的修復(fù)常常以失敗告終。斑馬魚(yú)CNS在胚胎發(fā)育4～10 d左右就已發(fā)育成熟，其胚胎透明的特點(diǎn)便于CNS的觀察，這使得斑馬魚(yú)成為理想的研究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的模式動(dòng)物。

1　斑馬魚(yú)在腦血管類(lèi)疾病中的研究

1.1　煙霧病

煙霧病(Moyamoya disease, MMD)是一種以頸內(nèi)動(dòng)脈末端進(jìn)行性狹窄和大腦底部異常血管網(wǎng)形成為特征的腦血管疾病[3]。近年來(lái)，全基因組關(guān)聯(lián)研究確定了環(huán)指蛋白213(RNF213)基因是東亞人群MMD的易感基因[4-5]。Kanoke[6], Kobayashi[7]和Sonobe[8]等利用Rnf213基因敲除小鼠或小鼠Rnf213R4 828K突變體來(lái)研究Rnf213基因在體內(nèi)的生理功能。但是，所有的Rnf213突變體都沒(méi)有表現(xiàn)出與MMD相似的腦血管表型。

Sheng等[9]研究團(tuán)隊(duì)采用轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(shù)敲除了斑馬魚(yú)體內(nèi)MMD的易感基因rnf213，構(gòu)建了rnf213基因敲除的斑馬魚(yú)模型。這個(gè)模型可用來(lái)研究Rnf213蛋白在胚胎發(fā)育過(guò)程中血管特別是腦血管形成和血液循環(huán)的作用。研究發(fā)現(xiàn)，72 hpfrnf213基因敲除斑馬魚(yú)模型中顱內(nèi)主干血管有不規(guī)則狹窄及顱內(nèi)外異常芽生血管形成，符合MMD腦血管的臨床癥狀。rnf213基因敲除的斑馬魚(yú)MMD疾病模型的構(gòu)建，為研究MDD的發(fā)病機(jī)制和治療提供了基礎(chǔ)。

1.2　腦卒中

腦卒中(stroke)分為缺血性和出血性腦卒中，最為常見(jiàn)的是缺血性腦卒中，占卒中患者的70%～80%。雖然大腦的重量是體重的2%，但有15%～20%的血液從心臟循環(huán)到大腦，并且腦耗氧量占總耗氧量的20%左右。由于腦高代謝需求，因此腦細(xì)胞對(duì)缺氧極其敏感，氧氣供應(yīng)切斷5 min即可造成腦細(xì)胞死亡[10]。缺血缺氧性腦損害病灶由中心壞死區(qū)及周?chē)娜毖氚祹ЫM成。目前研究腦缺血缺氧的動(dòng)物模型最廣泛的是鼠，可通過(guò)頸動(dòng)脈結(jié)扎和頸動(dòng)脈夾的開(kāi)閉來(lái)控制缺血與再灌注時(shí)間[11]。這種嚙齒類(lèi)動(dòng)物卒中模型的缺點(diǎn)是外周血管具有一定的手術(shù)創(chuàng)傷性。斑馬魚(yú)作為一種新型的沒(méi)有組織損傷的動(dòng)物模型，有以下優(yōu)勢(shì)：①斑馬魚(yú)作為水生生物，可以把溶解在水中的化學(xué)物質(zhì)通過(guò)鰓的呼吸而進(jìn)入血循環(huán)或皮膚表皮屏障而吸收；②斑馬魚(yú)是一個(gè)單一的循環(huán)回路：心-鰓-身體-心。Yu等[10]將斑馬魚(yú)放入一個(gè)缺氧室里，里面裝有氧濃度很低的水(< 0.8 mg/mL)來(lái)模擬一個(gè)缺血缺氧性腦損傷模型。缺氧一定時(shí)間后魚(yú)會(huì)沉到容器底部，然后將其轉(zhuǎn)移到正常培養(yǎng)環(huán)境讓其復(fù)氧。缺氧處理后的斑馬魚(yú)會(huì)有行為學(xué)上的改變?nèi)绯榇?、不平衡游?dòng)等，缺氧性腦損傷后的斑馬魚(yú)腦組織用TTC染色觀察腦組織損傷的分布，發(fā)現(xiàn)缺血缺氧后10 min的斑馬魚(yú)腦組織視神經(jīng)葉頂蓋處會(huì)出現(xiàn)缺血半暗區(qū)，并且隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng)梗死灶的范圍會(huì)擴(kuò)大。此研究構(gòu)建了一個(gè)相當(dāng)于缺血性腦卒中造成的缺血缺氧性腦損傷的斑馬魚(yú)模型，對(duì)于研究腦卒中復(fù)雜的細(xì)胞分子病理生理改變和臨床上開(kāi)發(fā)神經(jīng)保護(hù)藥物有著重要意義。

1.3　腦微出血的腦血管修復(fù)

出血性腦卒中和腦微出血是由于血管破裂引起的，腦血管破裂的關(guān)鍵因素是內(nèi)皮細(xì)胞層完整性的破壞[12]。因此，能快速修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的損傷和內(nèi)皮細(xì)胞的完整性是腦出血最有希望的治療方法。內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)可以通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞的自我復(fù)制和骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞的分化[13]。但是，這兩種修復(fù)機(jī)制一般是發(fā)生在缺血性腦卒中的血管再生，在治療過(guò)程中往往伴隨著新生血管的形成。因此，腦血管破裂修復(fù)的分子機(jī)制還有待闡明。

巨噬細(xì)胞與腦損傷、腦出血以及血管發(fā)育和重塑等密切相關(guān)。為了到達(dá)損傷的炎癥部位，巨噬細(xì)胞在血流運(yùn)動(dòng)中通過(guò)粘附因子(如PECAM1和ICAM1)與活化的內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行物理粘附，然后穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)跨越內(nèi)皮細(xì)胞層遷移[14]。此外，巨噬細(xì)胞也被報(bào)導(dǎo)可通過(guò)分泌血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF-C)來(lái)穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞間的接觸和增強(qiáng)血管的復(fù)雜性[15]。巨噬細(xì)胞在血管修復(fù)中扮演重要角色。由于缺乏高分辨率體內(nèi)實(shí)時(shí)示蹤技術(shù)，各類(lèi)細(xì)胞參與腦血管修復(fù)過(guò)程的研究受到很大限制[16]。

最近，西南大學(xué)羅凌飛團(tuán)隊(duì)在斑馬魚(yú)中利用多光子激光束靶向灼傷建立了腦血管定點(diǎn)破裂技術(shù)。體內(nèi)延時(shí)成像顯示，腦血管破裂損傷后巨噬細(xì)胞到達(dá)損傷處延長(zhǎng)絲狀或板狀偽足物理粘附于破裂的血管內(nèi)皮的兩端，然后巨噬細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械牽引力把破裂的血管兩端連接起來(lái)，穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞間的融合，從而修復(fù)破裂的血管[16]。另外，他們還發(fā)現(xiàn)，微絲的解聚作用和抑制PI3K或Rac1的活性可破壞巨噬細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間的物理粘附和阻止腦血管的修復(fù)[16]。利用斑馬魚(yú)模型建立的腦血管破裂誘導(dǎo)系統(tǒng)，不僅揭示了巨噬細(xì)胞通過(guò)直接物理粘附和機(jī)械牽引治療腦血管破裂修復(fù)的分子機(jī)制，也為腦出血的內(nèi)源性修復(fù)療法的研究奠定了基礎(chǔ)。

2　斑馬魚(yú)在神經(jīng)退行性疾病中的研究

2.1　帕金森氏病

帕金森氏病(Parkinson’s disease, PD)是一種常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病，病理表現(xiàn)為中腦黑質(zhì)紋狀體多巴胺能(dopaminergic, DA)神經(jīng)元變性缺損及路易小體形成。PD的易感基因很多，α-synuclein, parkin和ubiquitin C-terminal hydrolase (UCH-L1)基因是PD的三個(gè)主要致病基因[17-19]。其中，泛素羰基末端水解酶(ubiquitin C-terminal hydrolase, UCH-L1)基因?qū)Χ喟桶纺苌窠?jīng)元有重要作用，其編碼的UCH-L1蛋白既具有泛素水解酶活性，又具有泛素連接酶活性，同時(shí)又有穩(wěn)定單體的作用。UCH-L1功能異常會(huì)導(dǎo)致蛋白水解途徑障礙，使得神經(jīng)元中異常蛋白聚積，如PD特征性病理表現(xiàn)路易小體的形成。斑馬魚(yú)uch-L1與人UCH-L1同源性高達(dá)79%，并且在神經(jīng)組織上特異性表達(dá)。Son等[20]通過(guò)雙熒光原位雜交發(fā)現(xiàn)，uch-L1基因與多巴胺能分子標(biāo)記物酪氨酸羥化酶在48 hpf斑馬魚(yú)的間腦腹側(cè)共表達(dá)，而該區(qū)域相當(dāng)于人類(lèi)PD的病理改變部位-中腦黑質(zhì)，提示了該基因可能對(duì)間腦腹側(cè)多巴胺能神經(jīng)元的分化具有重要作用，也為研究PD的發(fā)病機(jī)制提供了理想的疾病模型。此外，除了α-synuclein,parkin和UCH-L1外，DJ-1基因也與PD有關(guān)。Bretaud等[21]在斑馬魚(yú)上注射DJ-1 MO敲降DJ-1基因，發(fā)現(xiàn)DJ-1的敲降會(huì)增加多巴胺能神經(jīng)元對(duì)過(guò)氧化氫和蛋白酶抑制劑MG132的敏感性，使得p53和bax表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡，而加入p53抑制劑治療可拯救多巴胺能神經(jīng)元的死亡。此外，即使沒(méi)有暴露于毒物，同時(shí)敲降DJ-1和p53的負(fù)調(diào)控因子mdm2也可導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元死亡，提示p53參與DJ-1缺陷介導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元的死亡。敲降DJ-1基因構(gòu)建的PD斑馬魚(yú)模型，可以用來(lái)研究DJ-1和p53在PD疾病中潛在的上下游信號(hào)通路調(diào)控機(jī)制。

2.2　阿爾茨海默病

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種以大腦神經(jīng)細(xì)胞外淀粉樣蛋白(β-amyloid peptides, Aβ)沉積為核心的老年斑、 細(xì)胞內(nèi)Tau 蛋白過(guò)度磷酸化異常聚集形成神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)(neurofibrilary tangles，NFTs)以及神經(jīng)元丟失為主要病理特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變性疾病，是癡呆最常見(jiàn)的病因[22]。Tau蛋白屬于微管相關(guān)蛋白家族，由微管相關(guān)蛋白Tau(microtubule associated protein tau,MAPT)基因編碼，主要分布于神經(jīng)元內(nèi)，是AD和其他神經(jīng)退行性疾病中神經(jīng)纖維纏結(jié)的主要成分。Tau蛋白與微管結(jié)合而促進(jìn)微管的組裝和維持微管的穩(wěn)定性，對(duì)軸突的延伸和運(yùn)輸有重要作用[23]。AD的Tau蛋白病因假說(shuō)認(rèn)為，異常條件修飾下Tau蛋白過(guò)度磷酸化可生成雙螺旋神經(jīng)絲(paired helical filament, PHF)和NFTs，使得軸突運(yùn)輸功能障礙和神經(jīng)元活性下降甚至死亡，最終導(dǎo)致AD的發(fā)病。在AD進(jìn)程中Tau蛋白在神經(jīng)元軸突的正常分布到神經(jīng)元胞體出現(xiàn)NFTs病理改變，其Tau蛋白是如何再分配的還不清楚。為了探討Tau蛋白早期功能改變對(duì)神經(jīng)元的影響，Tomasiewicz等[24]建立了過(guò)表達(dá)Tau蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)，該模型中斑馬魚(yú)的神經(jīng)纖維原細(xì)胞上能特異表達(dá)人Tau-GFP融合蛋白。將導(dǎo)致人AD遺傳性癡呆的第17號(hào)染色體上突變的Tau基因表達(dá)在斑馬魚(yú)上會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)元骨架的破壞，這與AD進(jìn)程中的NFTs的病理改變非常相像。過(guò)表達(dá)Tau蛋白的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型的構(gòu)建對(duì)于神經(jīng)退行性疾病發(fā)展的早期階段的機(jī)制研究至關(guān)重要。

除了Tau蛋白異常是AD的病因外，β淀粉樣沉積也是AD的發(fā)病機(jī)制之一。Aβ是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein, APP)水解而產(chǎn)生的蛋白片段，很容易積聚沉積形成斑塊。目前公認(rèn)的Aβ級(jí)聯(lián)假說(shuō)認(rèn)為，Aβ代謝異常造成Aβ片段積聚沉積，而導(dǎo)致了AD的發(fā)病。AD淀粉樣假說(shuō)認(rèn)為Aβ聚合物是有毒的，因此目前對(duì)于AD的治療主要致力于研制能降低Aβ毒性損害的化合物。β分泌酶(β-site APP cleaving enzyme 1)是Aβ產(chǎn)生的限速酶，也是藥物研究的主要靶點(diǎn)。Bace1是β分泌酶的抑制劑，為了評(píng)定斑馬魚(yú)體內(nèi)bace1的功能和尋找AD治療藥物的靶點(diǎn)，van Bebber等[25]利用鋅指核酸酶技術(shù)成功構(gòu)建了bace1和bace2基因表達(dá)缺失突變的斑馬魚(yú)，bace1突變體(bace1-/-)表現(xiàn)出外周神經(jīng)系統(tǒng)部分缺乏髓鞘和感覺(jué)神經(jīng)節(jié)增多的表型，而bace2突變體則表現(xiàn)出黑素細(xì)胞遷移的表型。bace1和bace2雙純合突變體沒(méi)有表現(xiàn)出單純合體表型的增強(qiáng)，提示這兩個(gè)基因沒(méi)有明顯冗余的生理功能。并且，bace1純合突變體和bace1、bace2雙純合突變體斑馬魚(yú)都是可生育產(chǎn)生下一代的，提示bace1是一個(gè)AD治療中對(duì)機(jī)體副作用較小的潛在基因治療靶點(diǎn)。

3　斑馬魚(yú)在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘疾病中的研究

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis, MS)是最常見(jiàn)的CNS白質(zhì)炎性脫髓鞘病變，它是自身免疫性疾病?；颊逤NS處的髓鞘或少突膠質(zhì)細(xì)胞上的共同抗原會(huì)受到免疫細(xì)胞的攻擊，進(jìn)而導(dǎo)致CNS白質(zhì)髓鞘的脫失。脫髓鞘會(huì)嚴(yán)重影響神經(jīng)沖動(dòng)的傳遞，從而出現(xiàn)各種神經(jīng)功能障礙。目前對(duì)于MS的治療大多是用藥物抑制免疫炎癥反應(yīng)，但是這類(lèi)免疫抑制劑對(duì)于復(fù)發(fā)進(jìn)展型MS的抑制作用是有限的，因?yàn)樗鼈儾荒艽龠M(jìn)MS脫髓鞘的再生修復(fù)。因此，近年來(lái)對(duì)MS治療的研究主要是促進(jìn)軸突的再髓鞘化[26]。CNS的髓鞘化是由少突膠質(zhì)細(xì)胞粘附包裹神經(jīng)纖維軸突并引發(fā)質(zhì)膜極化形成多層髓鞘的過(guò)程。

生物學(xué)上斑馬魚(yú)與哺乳動(dòng)物的髓鞘是同源的。另外，成像技術(shù)和多種轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系的發(fā)展，為在體研究髓鞘形成和髓鞘再生提供了一個(gè)實(shí)時(shí)可視化的髓鞘模型[27]。CNS由少突膠質(zhì)細(xì)胞負(fù)責(zé)髓鞘化。少突膠質(zhì)細(xì)胞可由不同來(lái)源的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cells，OPCs)分化而來(lái)。Kirby等[28]在表達(dá)綠色熒光蛋白的少突膠質(zhì)細(xì)胞譜系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)上用激光束靶向灼傷少突膠質(zhì)細(xì)胞，通過(guò)延時(shí)拍攝發(fā)現(xiàn)，當(dāng)少突膠質(zhì)細(xì)胞灼傷后，斑馬魚(yú)體內(nèi)的OPCs可通過(guò)伸偽足運(yùn)動(dòng)遷移到灼傷處包裹軸突，替代損傷的少突膠質(zhì)細(xì)胞而維持髓鞘的功能。且OPCs這種遷移運(yùn)動(dòng)是由周?chē)腛PCs和少突膠質(zhì)細(xì)胞的分布密度決定的。LINGO-1是少突膠質(zhì)細(xì)胞參與髓鞘形成的一個(gè)重要的負(fù)調(diào)控因子，它可以抑制OPC的分化[29]。LINGO-1可選擇性地在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的OPCs和神經(jīng)元上表達(dá)[30]，提示與OPC分化成熟和髓鞘化有關(guān)。

Yin等[31]將LINGO-1b基因的啟動(dòng)子序列，整合到熒光報(bào)告序列的表達(dá)載體上，構(gòu)建了少突膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)品系。在共聚焦顯微鏡下檢測(cè)到3 dpf時(shí)綠色熒光信號(hào)主要分布于腦和脊髓處的少突膠質(zhì)細(xì)胞和某些神經(jīng)元上。通過(guò)注射morpholino來(lái)敲降斑馬魚(yú)lingo-1b基因后發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)Lingo-1蛋白的下調(diào)會(huì)促進(jìn)髓鞘化和OPC分化。Tg(Lingo-1b:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)的構(gòu)建對(duì)于研究OPC參與髓鞘再生的機(jī)制有重要意義。

4　斑馬魚(yú)在亨廷頓氏舞蹈病中的研究

亨廷頓病(Huntington’s disease，HD)是一種常染色體顯性遺傳性神經(jīng)退行性疾病，是由致病蛋白的異常積聚和細(xì)胞自身清除異常蛋白能力失調(diào)造成的，其臨床表現(xiàn)主要為不自主地肢體舞蹈樣運(yùn)動(dòng)、精神異常和癡呆等。HD是由編碼亨廷頓蛋白(Huntingtin, Htt)的HD基因第一個(gè)外顯子中CAG重復(fù)序列異常擴(kuò)展所致。正常情況下，HD基因編碼產(chǎn)物為Htt 氨基末端的一段多聚谷氨酰胺重復(fù)序列(polyglutamine, PolyQ),而突變的HD基因則會(huì)編碼產(chǎn)生具有超長(zhǎng)PolyQ結(jié)構(gòu)的突變亨廷頓蛋白(mutant huntingtin, mHtt)[32-33]。以往研究發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的PolyQ使mHtt蛋白形成異常的的空間結(jié)構(gòu)而不能被及時(shí)降解，而是錯(cuò)誤折疊在神經(jīng)元核內(nèi)和神經(jīng)氈內(nèi)形成核內(nèi)聚集物(intranuclear aggregate)和神經(jīng)氈聚集物(neuropil aggregate)[34]，這種異常的錯(cuò)誤折疊的聚集物可對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用。因此，防止mHtt引起的細(xì)胞毒性的關(guān)鍵是降低細(xì)胞內(nèi)這種錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)聚集。

Hsc70碳末端相互作用蛋白(carboxyl terminus of Hsc70-interacting protein，CHIP)是具有分子伴侶和泛素連接酶功能的蛋白。CHIP氮端的三十四肽重復(fù)單元(TPR)結(jié)構(gòu)域負(fù)責(zé)與Hsp70和Hsp90等分子伴侶相互作用參與分子伴侶介導(dǎo)的蛋白質(zhì)折疊過(guò)程，而E4/U-box結(jié)構(gòu)域具有泛素E3連接酶活性，負(fù)責(zé)與蛋白酶體相互作[35-36]。細(xì)胞中錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)如果不及時(shí)清除會(huì)形成聚集物對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性。機(jī)體的“蛋白質(zhì)質(zhì)量監(jiān)控體系”，是清除體內(nèi)異常聚集蛋白的重要途徑。CHIP可與分子伴侶Hsp70、Hsp90等分子結(jié)合，引導(dǎo)錯(cuò)誤折疊的蛋白進(jìn)入泛素-蛋白酶體途徑降解。因此，CHIP被稱(chēng)為“分子伴侶依賴(lài)的泛素E3連接酶”[37]。為了探討CHIP在HD疾病中對(duì)PolyQ的作用，Miller等[38]構(gòu)建了PolyQ積聚HD疾病的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)模型，并向PolyQ-GFP斑馬魚(yú)模型注射CHIP表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)可以降低斑馬魚(yú)胚胎的死亡率并且使胚胎表型趨于正常。結(jié)果表明，CHIP蛋白可以抑制PolyQ的聚集和毒性，這是神經(jīng)細(xì)胞對(duì)于錯(cuò)誤折疊的PolyQ蛋白的一種重要反應(yīng)手段。這個(gè)模型的建立對(duì)于研究CHIP作為HD疾病治療的潛在靶點(diǎn)有重要作用。

5　斑馬魚(yú)模型在脊髓損傷修復(fù)研究中的應(yīng)用

脊髓損傷(spinal cord injury, SCI)作為嚴(yán)重的神經(jīng)損傷，可造成損傷節(jié)段以下軀體運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)及自主神經(jīng)功能障礙。SCI的修復(fù)和治療一直是研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)，如何有效地促進(jìn)脊髓損傷的修復(fù)一直是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的難題。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型對(duì)于研究脊髓損傷修復(fù)的潛在分子機(jī)制是非常重要的。這些動(dòng)物模型有猴、鼠來(lái)進(jìn)行脊髓損傷的手術(shù)，如壓迫性損傷、脊髓半切、脊髓完全性橫切[39-41]。相比于鼠和猴，成年斑馬魚(yú)對(duì)于神經(jīng)損傷，顯示出強(qiáng)大的神經(jīng)再生、神經(jīng)突和功能性突觸形成的能力，且在神經(jīng)損傷時(shí)維持低細(xì)胞凋亡水平[42-43]。因此，斑馬魚(yú)CNS損傷后非凡的再生能力使其成為研究脊髓損傷修復(fù)的理想動(dòng)物模型。為了研究脊髓損傷修復(fù)的分子機(jī)制，Shen等[44]和Zhang等[45]研究團(tuán)隊(duì)利用外科手術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚(yú)脊髓完全橫斷損傷模型，并且提供了兩個(gè)評(píng)估斑馬魚(yú)脊髓損傷和功能恢復(fù)的指標(biāo)：一是行為學(xué)分析斑馬魚(yú)手術(shù)前后的游動(dòng)能力，發(fā)現(xiàn)脊髓完全橫斷后的成年斑馬魚(yú)6周左右可以自主恢復(fù)到損傷前的運(yùn)動(dòng)水平；二是在形態(tài)學(xué)上通過(guò)生物素順行性軸索跟蹤，發(fā)現(xiàn)脊髓損傷后隨著時(shí)間的推移，脊髓軸突可以穿越橫斷處向灰質(zhì)和白質(zhì)處延伸。斑馬魚(yú)脊髓損傷模型的構(gòu)建對(duì)于研究脊髓損傷后軸突再生的分子機(jī)制和脊髓損傷的修復(fù)機(jī)制有重要作用。

6　應(yīng)用展望

斑馬魚(yú)基因序列與酵母、線(xiàn)蟲(chóng)和果蠅等相比，與人類(lèi)的同源性更高(70%～80%)[46]。其優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：①與人類(lèi)基因的相似度達(dá)87%，這意味著利用其作為研究模型所得到的結(jié)果在多數(shù)情況下也適用于人體；②成魚(yú)個(gè)體小，繁殖能力強(qiáng)，與鼠相比，斑馬魚(yú)體外受精發(fā)育，發(fā)育快，性成熟周期短，且胚胎身體透明，便于形態(tài)學(xué)觀察；③具有6000多種遺傳突變，可提供研究人員豐富的正向遺傳學(xué)品系來(lái)進(jìn)行發(fā)育機(jī)制上的研究；④Morpholino反義寡核苷酸、CRISPR/Cas9等技術(shù)的發(fā)展，可用逆向遺傳學(xué)手法來(lái)驗(yàn)證基因的功能。正向遺傳學(xué)和逆向遺傳學(xué)的方法相互結(jié)合來(lái)研究斑馬魚(yú)遺傳發(fā)育等的規(guī)律，也是斑馬魚(yú)目前成為研究人類(lèi)疾病較好模型的特點(diǎn)之一；⑤斑馬魚(yú)的細(xì)胞標(biāo)記技術(shù)、組織移植技術(shù)、突變技術(shù)、轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因活性抑制技術(shù)等已經(jīng)成熟。以上這些優(yōu)點(diǎn)，使得斑馬魚(yú)廣泛應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病分子機(jī)制的研究。