幽門(mén)螺桿菌促進(jìn)程序性死亡配體1在胃癌中的表達(dá)

曹龍磊 龔治林 于 杰 周啟昌 葉 輝 郗昌磊

(長(zhǎng)江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(荊州市中心醫(yī)院)結(jié)直腸肛門(mén)外科，湖北 荊州 434020)

幽門(mén)螺桿菌(Hp)感染可引起胃炎、消化性潰瘍、淋巴增生性胃淋巴瘤等疾病，并且與胃癌發(fā)生有密切關(guān)系，Hp已被世界衛(wèi)生組織定義為1類(lèi)致癌因子。目前對(duì)Hp導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生機(jī)制涉及多方面因素，具體機(jī)制仍然不明確。B7家族分子是一類(lèi)在免疫反應(yīng)中重要的免疫分子。其中B7-H1是B7家族中發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)家族成員，又稱(chēng)其為程序性死亡配體(PD-L)1〔1〕，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。研究證實(shí)B7-H1可以同T細(xì)胞表面的PD-1受體結(jié)合，從而抑制T細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其凋亡，抑制其功能，減少效應(yīng)細(xì)胞因子的分泌〔2〕。B7-H1的表達(dá)是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫逃避的重要機(jī)制之一，其在腫瘤細(xì)胞表面高度表達(dá)，從而抑制T細(xì)胞功能，逃避免疫監(jiān)視，促進(jìn)腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移〔3〕。目前，關(guān)于免疫環(huán)境和Hp感染的相互關(guān)系研究較少。本研究旨在探索Hp是否能夠引起B(yǎng)7-H1分子在胃黏膜細(xì)胞中表達(dá)的變化及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 胃黏膜活檢標(biāo)本取自華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院(長(zhǎng)江大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院)。胃黏膜標(biāo)本包括表面及深層的胃黏膜組織。22例標(biāo)本中Hp檢測(cè)陽(yáng)性和陰性各半。胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS購(gòu)于上海中科院細(xì)胞庫(kù)。RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購(gòu)于Gibco公司。引物購(gòu)買(mǎi)于南京金斯瑞公司。TRizol試劑、qRT-PCR試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均由TAKARA提供。SS1Hp菌株由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院普外科實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2胃癌細(xì)胞系的培養(yǎng)及共培體系 人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基當(dāng)中。比濁法測(cè)定Hp數(shù)量，將Hp數(shù)/細(xì)胞數(shù)(1∶50)共培養(yǎng)于6孔板之中。

1.3RNA的提取 按TRizol試劑說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行RNA的提取，用不含RNA酶無(wú)菌水對(duì)總RNA進(jìn)行溶解，使用分光光度計(jì)在260 nm和280 nm下測(cè)定吸光度值，計(jì)算RNA濃度。

1.4PCR步驟 對(duì)細(xì)胞中PD-L1表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。使用GAPDH作為參照，正向引物： 5′-AAAGGTACCTAGAAGTTCAGCGCGGGATA-3′；反向引物： 5′-AAAGGATCCCAGCGAGCTAGCCAGAGATA-3。用上述步驟中1 μg總RNA同PD-L1正反引物各2 μl，5×Primer Script?緩沖液4 μl，Primer Script?RT酶混合物Ⅰ 1 μl，雙蒸水補(bǔ)至20 μl體系。按下列條件反應(yīng)：37℃15 min，95℃15 s。反應(yīng)得到的cDNA放置于-80℃?zhèn)溆?。之后進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。體系20 μl，含有以下組分：SYBR?Primix Ex TagTMⅡ(2×)10 μl，PD-L1正義引物(5 μmol/L)1 μl，PD-L1反義引物(5 μmol/L)1 μl，cDNA 2 μl，雙蒸水6 μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性15 s；95℃變性10 s，60℃退火25 s，70℃延伸12 s，循環(huán)30次。使用Applied Biosystems7500系統(tǒng)，每樣設(shè)3個(gè)復(fù)孔，以GAPDH為內(nèi)參，相對(duì)定量，用N=2-ΔΔCt表示感染Hp胃組織中PD-L1相對(duì)正常組織表達(dá)的倍數(shù)，此時(shí)ΔΔCt=(CtPD-L1-CtGAPDH)感染Hp-(CtPD-L1-CtGAPDH)未感染Hp。

1.5T細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 從人外周血中提取外周血單核細(xì)胞(PBMC)，再用CD4陰性選擇試劑盒(Stemcell，Canada)提取CD4+T細(xì)胞，鑒定純度大于95%。AGS細(xì)胞4×105接種與24孔板中，24 h之后，加入Hp培養(yǎng)，再過(guò)48 h，用mitomycinc 10 μg/ml處理細(xì)胞2 h。計(jì)數(shù)1.5×106個(gè)上述提取的T細(xì)胞，96孔板培養(yǎng)，加入CD3、CD28抗體(濃度均為1.25 μg/ml)細(xì)胞。培養(yǎng)12 h后加入24孔板中共培養(yǎng)24 h后提取非貼壁細(xì)胞檢測(cè)碘化丙啶(PI)，AnnexinV/PI染色測(cè)定凋亡。

1.6ELISA測(cè)定共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子分泌 包被：將腫瘤壞死因子(TNF)-α及干擾素(IFN)-γ抗體包被緩沖液進(jìn)行稀釋。在反應(yīng)孔每孔中加入0.2 ml，4℃過(guò)夜。然后棄去孔中所有液體，洗滌緩沖液充分洗滌3次，5 min/次。加樣：抽取培養(yǎng)基上清100 μl移入反應(yīng)孔之中，37℃下孵育60 min。洗滌緩沖液洗板，5 min/次，洗滌3次。在每個(gè)反應(yīng)孔中放入酶標(biāo)記抗體150 μl，37℃下反應(yīng)40 min。洗板3次，5 min/次。上述孔中加入四甲基聯(lián)苯胺(TMB)液150 μl，37℃反應(yīng)20 min，然后放入終止液50 μl。使用酶標(biāo)儀上讀數(shù)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度，計(jì)算樣品濃度。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1PD-L1在Hp感染的胃黏膜組織及細(xì)胞系中的表達(dá) Hp陽(yáng)性組PD-L1(2.149±0.213)較Hp陰性組(1.004±0.213)明顯上升(P<0.05)。細(xì)胞系體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),AGS同Hp共培養(yǎng)時(shí)PD-L1(2.834±0.173)較無(wú)Hp培養(yǎng)的AGS組(1.091±0.123)顯著增加(P<0.05)。說(shuō)明PD-L1上調(diào)同Hp感染有顯著關(guān)聯(lián)。

2.2Hp上調(diào)CD4+T細(xì)胞分泌IFN-γ和TNF-α的表達(dá) Hp同CD4+T細(xì)胞一起培養(yǎng)，IFN-γ為(88.654±9.683)ng/ml，TNF-α為(28.144±3.183)ng/ml。無(wú)Hp感染組IFN-γ為(23.771±4.633)ng/ml，TNF-α為(5.091±3.231)ng/ml，差異顯著(P<0.05)。

2.3IFN-γ和TNF-α促進(jìn)AGS細(xì)胞表達(dá)PD-L1 AGS細(xì)胞中加入IFN-γ和TNF-α后，PD-L1為(2.234±0.410)、(5.512±0.624)，相對(duì)于對(duì)照組〔(1.034±0.098)、(1.001±0.314)〕顯著上升(P<0.05)。

2.4Hp刺激后AGS細(xì)胞促進(jìn)CD4+T細(xì)胞的凋亡 采用AGS同CD4+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，對(duì)比Hp未刺激組T細(xì)胞凋亡率為(3.5±1.6)%，Hp刺激后T細(xì)胞的凋亡率為(13.7±1.9)%，加抗PD-L1抗體后T細(xì)胞凋亡率為(4.9±1.3)%，加IgG后T細(xì)胞凋亡率為(15.3±1.8)%,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Hp感染的AGS細(xì)胞可促進(jìn)CD4+T淋巴細(xì)胞凋亡，此種效應(yīng)可被抗PD-L1抗體(10 μg/ml)阻斷，而同型IgG抗體無(wú)此效果。

3 討 論

目前對(duì)胃癌的治療仍然是以手術(shù)和藥物治療為主。對(duì)于進(jìn)展期或晚期的胃癌，療效仍然相當(dāng)有限。Hp是已知的能在胃黏膜長(zhǎng)期存活的唯一細(xì)菌〔4〕。Hp感染常常導(dǎo)致胃十二指腸消化性潰瘍的發(fā)生。研究表明，胃癌發(fā)生及發(fā)展與Hp感染有著一定的聯(lián)系〔5～8〕。研究表明，Hp可以通過(guò)分泌毒素(如CagA等),引起胃黏膜細(xì)胞一系列的生理病理變化，也可以改變胃黏膜局部炎癥微環(huán)境，影響細(xì)胞狀態(tài)，改變胃黏膜細(xì)胞增殖、凋亡等一系列變化〔7，9～11〕。

近些年來(lái)，免疫逃避被認(rèn)為是腫瘤難以治愈和復(fù)發(fā)的重要因素〔2，12，13〕。腫瘤細(xì)胞在其細(xì)胞表面能表達(dá)一些小分子，使其能夠躲避機(jī)體免疫系統(tǒng)，并且下調(diào)相應(yīng)免疫細(xì)胞功能，使得腫瘤細(xì)胞逃避免疫細(xì)胞的免疫殺傷作用而存活。有許多免疫抑制分子，PD-L1就是其中之一。PD-L1表達(dá)在多種免疫遞呈細(xì)胞或者一些其他細(xì)胞表面，以此來(lái)調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞〔12，14，15〕。研究發(fā)現(xiàn)，一部分腫瘤細(xì)胞表面PD-L1表達(dá)上升。PD-L1在腫瘤中的表達(dá)程度與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)〔16〕。PD-L1高表達(dá)往往促進(jìn)腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移。有些腫瘤PD-L1是判斷預(yù)后指標(biāo)之一。目前PD-1單抗已經(jīng)上市，并在一些腫瘤治療中取得效果〔1，17，18〕。

本次研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在胃黏膜標(biāo)本中或者胃癌細(xì)胞系中，Hp的存在可以促進(jìn)PD-L1的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。這提示Hp的存在造成了胃環(huán)境炎癥及損傷的同時(shí)，還產(chǎn)生了免疫抑制的效果。而免疫監(jiān)視能力的減弱往往導(dǎo)致了腫瘤發(fā)生和難以控制。本研究發(fā)現(xiàn)Hp能夠促進(jìn)激活的CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α和IFN-γ，TNF-α和IFN-γ這兩種細(xì)胞因子均可以促進(jìn)PD-L1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。說(shuō)明Hp不單可以直接作用于胃黏膜細(xì)胞，并且能夠通過(guò)刺激CD4+T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，作用于胃癌細(xì)胞，使其表達(dá)PD-L1，介導(dǎo)免疫抑制效應(yīng)。

本研究使用CD3和CD28抗體激活CD4+T淋巴細(xì)胞會(huì)表達(dá)PD-1受體并能發(fā)揮相應(yīng)的免疫作用。將Hp培養(yǎng)后的AGS細(xì)胞同激活的淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，Hp刺激后的細(xì)胞可以促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的凋亡，此種作用可以被抗B7-H1抗體阻斷。這說(shuō)明Hp可以刺激胃癌細(xì)胞表達(dá)PD-L1，并進(jìn)一步抑制激活淋巴細(xì)胞的免疫效應(yīng)，抑制免疫，由此導(dǎo)致局部的免疫監(jiān)視能力減弱。從而導(dǎo)致異常變異的胃黏膜細(xì)胞的存活機(jī)會(huì)增加，由此可能增加了胃癌的發(fā)生概率。