維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ和慢性丙型肝炎的研究進(jìn)展

王方平 張平安 楊曉燕

430060武漢大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科

固有免疫應(yīng)答是機(jī)體抵抗病原微生物的第一道防線。細(xì)菌、病毒等病原微生物入侵機(jī)體后，其表面的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）被機(jī)體內(nèi)的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptors，PRRs）識(shí)別，啟動(dòng)固有免疫應(yīng)答。PRR主要包括表達(dá)在細(xì)胞內(nèi)外的Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）家族，如 TLR3、TLR7 等；核酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域 NOD樣受體（nucleotidebinding oligomerization domain-like recepter，NLR），如NOD家族（NOD1-5）；以及維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ樣受體家族（RIG-like receptors，RLRs），如維甲酸誘導(dǎo)基因Ⅰ（retinoic acid inducible geneⅠ）、黑色素瘤分化相關(guān)抗原5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）等［1］。 這些 PRR 能夠識(shí)別不同的病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），如TLR4可以識(shí)別革蘭氏陰性菌脂多糖（lipopolysaccharides， LPS）［2］，RIG-Ⅰ識(shí)別 5′端帶有三磷酸基團(tuán)的RNA（5′ppp-RNA）等，進(jìn)而參與激活白細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞以及活化B細(xì)胞、T細(xì)胞，刺激干擾素分泌等過程，在固有免疫和獲得性免疫中發(fā)揮重要的作用。慢性丙型肝炎患者體內(nèi)抗病毒能力下降，如RIG-Ⅰ基因及干擾素基因表達(dá)量顯著下降等［3］。

1 丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）

HCV歸屬于黃病毒科屬，是一種單股正鏈RNA病毒，于1989年首次被發(fā)現(xiàn)［4］，是急慢性肝炎的主要原因。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球大約有1.85億人感染HCV，占世界人口的3.2%，同時(shí)每年大約有300到400萬(wàn)新發(fā)病例［5］。HCV有6種基因型，這些基因型中有70多種亞型，每種基因型感染人種不同，我國(guó)主要感染1b型、2 a型。HCV基因組長(zhǎng)約9.6 kb，包括 5′和 3′非編碼區(qū)（noncoding region，NCR），5′非編碼區(qū)下游緊接一開放的閱讀框（open reading frame，ORF），其編碼一個(gè)約3 000個(gè)氨基酸長(zhǎng)度的多聚蛋白前體，該前體可被宿主細(xì)胞或病毒自身蛋白酶裂解成十幾種蛋白質(zhì)，包括結(jié)構(gòu)蛋白和六種非結(jié)構(gòu)蛋白［6］。結(jié)構(gòu)蛋白包括核心蛋白C，兩種包膜蛋白E1、E2和p7離子通道［7］。HCV核心蛋白具有許多功能，它與宿主細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相互作用。非結(jié)構(gòu)蛋白包括 NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，不僅在病毒復(fù)制中具有作用，而且在病毒的生活周期具有重要作用［7］。NS2、NS3具有蛋白水解酶活性，參與病毒多聚蛋白前體的切割，NS3蛋白還具有螺旋酶活性，參與HCV-RNA分子解螺旋，以協(xié)助RNA復(fù)制，NS4的功能尚不清楚，NS5A是一種磷酸蛋白，可以與多種宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白相互作用，對(duì)于病毒的復(fù)制起重要作用［8］。而NS5B則具有RNA依賴的RNA聚合酶活性，參與HCV 基因組復(fù)制［8］。

在急性丙肝（acute viral hepatitis C，AHC）早期會(huì)出現(xiàn)病毒載量呈指數(shù)增加，但是隨后病毒的復(fù)制會(huì)得到抑制，這說(shuō)明固有免疫系統(tǒng)具有抑制HCV的作用。然而，在感染的細(xì)胞中，HCV能抑制抗病毒效應(yīng)蛋白的功能或表達(dá)，并且其細(xì)胞內(nèi)高水平的病毒載量和ISG共存［9］，說(shuō)明干擾素誘導(dǎo)的抗HCV作用減弱或病毒發(fā)生了逃逸突變［10］。HCV能夠通過多種機(jī)制逃避宿主的免疫反應(yīng)，NS3羧基端含DExD／H解旋酶活性，與 NS4A非共價(jià)結(jié)合形成NS3／4 A蛋白酶復(fù)合物，受 NS4A正調(diào)控，NS3／4 A蛋白酶復(fù)合物切割TLR3的下游信號(hào)分子TRIF，阻斷細(xì)胞內(nèi)IFN介導(dǎo)的抗病毒信號(hào)通路傳導(dǎo)，這是造成HCV持續(xù)感染的重要原因之一［11］；同時(shí)還能通過NS3／4 A蛋白酶復(fù)合物對(duì)MAVS C508位點(diǎn)進(jìn)行水解，使其從線粒體脫落，阻止其下游信號(hào)分子的激活，從而阻斷賴氨酸信號(hào)通路，以逃避宿主的干擾素反應(yīng)［12］；NS3／4 A、NS4B 蛋白顯著阻斷由 RIG-Ⅰ介導(dǎo)的 IFN-β 的產(chǎn)生［13］。

慢性HCV感染的一個(gè)特點(diǎn)是病毒特異性CD8T細(xì)胞在功能上受損，它們無(wú)法增殖或無(wú)法分泌抗病毒細(xì)胞因子，如IFN-γ［10］。慢性HCV感染患者外周血及肝臟內(nèi)Treg數(shù)量是健康人的3倍，這些Treg能以細(xì)胞與細(xì)胞間直接作用的方式抑制CD8＋T細(xì)胞的增殖和IFN-γ的分泌［14］。T細(xì)胞抗病毒能力下降主要與T細(xì)胞數(shù)量耗竭和病毒突變逃避免疫有關(guān)。有報(bào)道稱在慢性感染患者以及急性感染的患者體內(nèi)均存在病毒逃逸突變［9］，病毒突變與疾病的慢性化和病毒清除相關(guān)［15］。

也有證據(jù)表明病毒效應(yīng)可能不是導(dǎo)致慢性肝病的直接原因，病毒感染或酒精濫用導(dǎo)致的慢性肝病晚期階段患者對(duì)病原微生物感染表現(xiàn)出更高的易感性被認(rèn)為是宿主免疫受損的原因之一。有研究表明抗病毒治療是慢性肝炎發(fā)展為原發(fā)性肝癌的相關(guān)因素［16］，因此積極的抗病毒治療是延緩丙型肝炎慢性化進(jìn)展及發(fā)展為肝癌的有效手段。

2 RIG-Ⅰ

RIG-Ⅰ能識(shí)別5′端帶有三磷酸基團(tuán)的RNA（5′ppp-RNA），5′ppp-RNA是 RNA病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的過渡型RNA。RIG-Ⅰ能特異性識(shí)別處于復(fù)制階段的HCV RNA病毒，啟動(dòng)免疫應(yīng)答，在固有免疫和獲得性免疫中具有重要的作用。RIG-Ⅰ基因又稱為DDX58 A首先由Choo等［4］在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤易感基因（Rb-）缺陷小鼠中被篩選出，其表達(dá)模式隨后在小鼠后腦和脊髓中簡(jiǎn)要闡述，主要表達(dá)在非免疫細(xì)胞內(nèi)。人類RIG-Ⅰ基因位于染色體9p12，基因約長(zhǎng)3.0 Kb，其編碼一段925個(gè)氨基酸的殘基。RIG-Ⅰ蛋白由N端、中間端和C端構(gòu)成，其中N端包括半胱氨酸蛋白酶激活和募集結(jié)構(gòu)域（caspase activation and recruitment domain，CARD）；中間端為RNA解旋酶區(qū)；C端為抑制區(qū)（repressor doman，RD）［5］。RIG-I蛋白通過CARD結(jié)構(gòu)域與接頭蛋白CARD結(jié)構(gòu)域相互作用激活下游通路，當(dāng)細(xì)胞中CARD過表達(dá)時(shí)可誘導(dǎo)IFN產(chǎn)生；RNA解旋酶區(qū)即DExD／H區(qū)包括解旋酶TAS基序和ATP結(jié)合基序兩部分，ATP結(jié)合基序位于K270附近，其突變與RIG-Ⅰ功能障礙有關(guān)；RD結(jié)構(gòu)區(qū)主要識(shí)別病毒RNA，調(diào)控 RIG-Ⅰ下游信號(hào)通路［5］。 在靜息狀態(tài)下，RIG-Ⅰ受體處于自抑狀態(tài)，CARD結(jié)構(gòu)域和RD抑制區(qū)通過分子內(nèi)相互作用處于非活化狀態(tài)。一旦病毒入侵，RIG-Ⅰ能識(shí)別病毒RNA，首先激活A(yù)TP水解，釋放能量解除其自身抑制構(gòu)象，暴露CARD結(jié)構(gòu)域，與信號(hào)分子線粒體抗病毒信號(hào)傳送蛋白（Mitochondrial Antiviral Signaling Protein，MAVS，又稱為VISA／IPS-1／Cardif）CARD相互作用招募下游信號(hào)分子，激活干擾素刺激因子3（IFN regulatory factor-3，IRF-3）和核轉(zhuǎn)錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）效應(yīng)基因。該反應(yīng)由控制RIG-Ⅰ多聚化和MAVS相互作用的內(nèi)部抑制區(qū)RD調(diào)節(jié)［6］。

自從2004年RIG-Ⅰ作為細(xì)胞內(nèi)病毒RNA識(shí)別受體被發(fā)現(xiàn)以來(lái)［7］，關(guān)于RIG-Ⅰ蛋白及其活化的機(jī)制有較多研究。RIG-Ⅰ的活化需要以下步驟：配體結(jié)合，構(gòu)象變化，易位至線粒體，寡聚化，翻譯后修飾以及與MAVS相互作用。其活性主要通過多種蛋白質(zhì)翻譯后修飾（post-translational modification，PTM），如泛素化、乙?；Ⅴ０坊?、ISG化、SUMO化或復(fù)雜的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)非共價(jià)結(jié)合相互作用［8］。這種復(fù)雜的調(diào)節(jié)機(jī)制主要是確保病毒感染期間及感染后機(jī)體內(nèi)抗病毒能力處于適當(dāng)水平。RIG-Ⅰ的負(fù)性和正性調(diào)節(jié)因子可以被病毒或IFN激活，產(chǎn)生復(fù)雜的反饋回路，在該環(huán)路中RIG-Ⅰ活性及含量與IFN產(chǎn)生密切相關(guān)。

2.1 蛋白激酶介導(dǎo)RIG-Ⅰ磷酸化 蛋白激酶通過催化蛋白磷酸化作用控制細(xì)胞生命活動(dòng)，已知酪蛋白激酶 II（CKII）和蛋白激酶 C-α／β（PKCα／β）能介導(dǎo) RIG-Ⅰ磷酸化［9］，其中 CKII介導(dǎo) RIG-Ⅰ上的蘇氨酸770和絲氨酸854／855磷酸化以維持自身抑制狀態(tài)［10］，PKC 介導(dǎo) RIG-Ⅰ上的蘇氨酸170 和絲氨酸8殘基磷酸化，從而抑制RIG-Ⅰ與三結(jié)構(gòu)域蛋白家族25（tripartite motif 25，TRIM25）或 MAVS 的相互作用［9］。病毒感染后，與MAVS結(jié)合，TRIM25介導(dǎo)泛素化導(dǎo)致磷酸蛋白酶1（PP1-α／γ）異構(gòu)體與RIG-I相互作用脫磷酸化［11］，核因子 κB 激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase EpsilonI，KK-κB）介導(dǎo)干擾素調(diào)節(jié)因子3／7活化，從而抑制RIG-ⅠRD區(qū)絲氨酸 855 磷酸化，抑制 RIG-Ⅰ信號(hào)傳導(dǎo)［12］。

2.2 泛素化介導(dǎo)的RIG-Ⅰ降解 RIG-Ⅰ信號(hào)通路激活的同時(shí)可以促進(jìn)RIG-Ⅰ蛋白的降解，從而限制過量激活的RIG-Ⅰ信號(hào)傳導(dǎo)，平衡總的抗病毒活性。泛素-蛋白酶體（uibiquitin-proteasome system，UPS）是真核生物內(nèi)蛋白選擇性降解的途徑之一，其中泛素是一個(gè)由76氨基酸殘基構(gòu)成的蛋白質(zhì)，主要通過多聚泛素化鏈發(fā)生作用；蛋白酶體是泛素-蛋白酶系統(tǒng)的主要組成部分，主要負(fù)責(zé)識(shí)別并降解K48泛素鏈標(biāo)記的蛋白底物［13］。RIG-Ⅰ通過多個(gè)E3連接酶被K48所標(biāo)記，導(dǎo)致其能被蛋白酶體識(shí)別并降解。泛素連接酶125（RNF125）誘導(dǎo)K48在RIG-ⅠN端泛素化從而抑制 RIG-Ⅰ信號(hào)通路［14］。一旦RIG-Ⅰ被聚肌胞苷酸（polyI：C）激活，RNF125 的表達(dá)反饋性上調(diào)，這說(shuō)明RIG-Ⅰ信號(hào)通路的激活同時(shí)可以促進(jìn)RIG-Ⅰ降解，限制過量的信號(hào)傳導(dǎo)，平衡總的抗病毒能力［14］。K63泛素鏈主要參與多種細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路，它通過標(biāo)記底物蛋白，使之被特異的調(diào)控因子識(shí)別，激活下游信號(hào)通路。TRIM25與RIG-Ⅰ相互作用并催化RIG-Ⅰ的賴氨酸172上的K63 多聚泛素化［15］。

3 RIG-Ⅰ在丙型肝炎患者介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)通路

目前已知各種RNA病毒家族，如副粘病毒科、彈狀病毒科、正粘病毒科、絲狀病毒科、沙粒病毒科、布尼亞病毒科、黃病毒科、冠狀病毒科和杯狀病毒科均可激活RIG-Ⅰ［5］。將HCV RNA轉(zhuǎn)染到肝癌細(xì)胞后可以瞬時(shí)活化IRF3和IFN-β，但是在RIG-Ⅰ功能性缺乏的細(xì)胞中卻未得到相同結(jié)果，這表明RIG-Ⅰ是HCV感染細(xì)胞后激活I(lǐng)RF3的關(guān)鍵受體［17］。RIG-Ⅰ主要識(shí)別 HCV 3′非編碼區(qū)（3′-noncoding region，3′NCR），該區(qū)在HCV基因組中高度保守，并且是HCV復(fù)制的關(guān)鍵。3′NCR由三部分組成，包括含有2個(gè)莖環(huán)的可變區(qū)、單鏈多聚U富集區(qū)和含有3個(gè)莖環(huán)保守的“X”區(qū)，5′ppp帽端是激活 RIG-Ⅰ信號(hào)通路必需的條件，但是多聚 U／UC 區(qū)域才是關(guān)鍵因素［18］。 RIG-Ⅰ的C端RD結(jié)構(gòu)域中帶正電荷結(jié)合區(qū)能結(jié)合5′ppp-RNA，該結(jié)合區(qū)只能容納3個(gè)核苷酸，RIG-Ⅰ利用解旋酶域來(lái)區(qū)分特異性RNA序列［19］。

最近，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的干擾素基因刺激物（STING），被認(rèn)為是 RIG-Ⅰ信號(hào)傳導(dǎo)的激活劑。STING基因缺陷小鼠極易感染皰疹性口腔炎病毒（vesicular stomatitis virus，VAS），然而在缺乏 STING基因下利用合成dsRNA刺激細(xì)胞產(chǎn)生干擾素的能力并不受影響［20］。關(guān)于STING基因如何激活下游IRF-3和 NF-κB的具體機(jī)制不清楚，但據(jù)報(bào)道稱STING可以通過與一種八聚體復(fù)合物exocyst結(jié)合，將其以囊泡的形式分泌從而激活下游信號(hào)通路［21］。黃病毒NS4B具有與STING的同源結(jié)構(gòu)域，并與NS4B共定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，NS4B能阻斷STING與MAVS 相互作用，抑制 IFN-β 產(chǎn)生［22］。

目前有關(guān)RIG-Ⅰ在抗病毒信號(hào)通路和干擾素誘導(dǎo)作用的報(bào)道較多［22-23］。 Weber 等［23］研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)染了甲型流感病毒（influenza A virus，IAV）RNA的細(xì)胞中，RIG-Ⅰ能識(shí)別IAV RNA，并通過干擾素依賴方式抑制IAV復(fù)制。Sato等［24］在研究乙肝患者的免疫應(yīng)答時(shí)也發(fā)現(xiàn)，RIG-Ⅰ可以阻礙HBV聚合酶與5，-ε區(qū)域的相互作用，直接抑制 HBV復(fù)制。這些發(fā)現(xiàn)為研究固有免疫系統(tǒng)中模式識(shí)別受體RIG-Ⅰ提供了新的思路和方向。但是關(guān)于RIG-Ⅰ在CHC患者體內(nèi)是否同樣能抑制HCV復(fù)制，以及其具體機(jī)制是怎樣的報(bào)道較少，有研究推測(cè)RIG-Ⅰ上游一些調(diào)節(jié)蛋白，可能在RIG-Ⅰ直接抑制病毒復(fù)制中發(fā)揮著重要作用［25］，目前仍需進(jìn)一步分子機(jī)制方面的研究來(lái)闡明這些疑問。

4 結(jié)語(yǔ)

RIG-Ⅰ是識(shí)別HCV RNA病毒的重要的模式受體之一，它不僅能依賴MAVS銜接蛋白激活固有免疫應(yīng)答誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生發(fā)揮抗病毒作用，還能調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答?；趯?duì)這些分子機(jī)制的不斷深入了解，有望通過靶向調(diào)控RIG-Ⅰ信號(hào)通路為治療和控制HCV病毒感染、甚至控制炎癥反應(yīng)和治療自身免疫性疾病提供新的思路和策略。

利益沖突 無(wú)