急腹癥Ⅲ號對呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎大鼠腸道通透性及細(xì)菌移位的影響

王瑞明

[摘要] 目的 觀察急腹癥Ⅲ號對呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎模型大鼠腸黏膜屏障的影響，并探討其作用機(jī)制。 方法 選擇清潔型雄性SD大鼠100只，隨機(jī)分為5組。急腹癥Ⅲ號組：VAP（呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎）模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號2 mL；谷氨酰胺組：VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺顆粒2 mL；急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組：VAP模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺顆粒各2 mL；安慰劑組：VAP模型，每日灌胃生理鹽水2 mL；空白對照組：無特殊處理，每日灌胃生理鹽水2 mL。術(shù)后第5天收集尿液，采用乳果糖/甘露醇法評價腸黏膜通透性，第6天處死大鼠取腸系膜淋巴結(jié)進(jìn)行培養(yǎng)。 結(jié)果 腸道通透性方面，安慰劑組較空白對照組L/M（乳果糖/甘露醇）明顯增大（P<0.05），其余三個干預(yù)組與空白對照組相似，急腹癥Ⅲ號組L/M大于谷氨酰胺組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。細(xì)菌移位方面，安慰劑組明顯高于空白對照組（P<0.01），其余三組陽性率均低于安慰劑組（P<0.05）。培養(yǎng)結(jié)果主要為腸道寄生菌（大腸桿菌為主）。 結(jié)論 呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎模型破壞了大鼠的小腸黏膜結(jié)構(gòu)并增加了腸道通透性，出現(xiàn)腸道細(xì)菌移位。院內(nèi)制劑急腹癥Ⅲ號可使腸黏膜通透性減小，促進(jìn)腸黏膜結(jié)構(gòu)修復(fù)，減少腸道菌群移位。谷氨酰胺和急腹癥Ⅲ號聯(lián)合使用對腸道黏膜結(jié)構(gòu)保護(hù)作用并沒有更加明顯。

[關(guān)鍵詞] 急腹癥Ⅲ號；呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎；腸道通透性；細(xì)菌移位

[中圖分類號] R563 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）34-0020-04

Effect of acute abdomen Ⅲ on intestinal permeability and bacterial translocation in ventilator-associated pneumonia rats

WANG Ruiming

Department of Emergency Medicine， Hangzhou Traditional Chinese Medicine Hospital， Hangzhou 310007， China

[Abstract] Objective To observe the effect of acute abdomen Ⅲ on intestinal mucosal barrier in ventilator-associated pneumonia model rats and to explore its mechanism. Methods A total of 100 clean male Sprague-Dawley rats were randomly divided into 5 groups. The acute abdomen group Ⅲ group： VAP（ventilator-associated pneumonia） model， daily gavage of acute abdomen Ⅲ 2 mL； glutamine group： VAP model， daily gavage of glutamine particles 2 mL； acute abdomen Ⅲ combined with glutamine group： VAP model， daily gavage of acute abdomen Ⅲ 2 mL and glutamine particles 2 mL； placebo group： VAP model， daily intake of saline 2 mL； blank control group： No special treatment， daily gavage of saline 2 mL. The urine was collected on the fifth day after operation. The permeability of intestinal mucosa was evaluated by lactulose/mannitol method. The rats were sacrificed on the 6th day and mesenteric lymph nodes were cultured. Results The intestinal permeability of the placebo group was significantly higher than that of the blank control group L/M （lactulose/mannitol）（P<0.05）. And the intestinal permeability of the other three intervention groups was similar to that of the blank control group. And L/M in the acute abdomen Ⅲ group was higher than that of the glutamine group， but there was no significant difference. The placebo group had significantly higher bacterial translocation than that of the blank control group（P<0.01）. The positive rate of bacterial translocation in the remaining three groups was lower than that of the placebo group（P<0.05）. The culture results were mainly intestinal parasites （Escherichia coli）. Conclusion Ventilator-associated pneumonia model destroys the intestinal mucosa of rats and increases intestinal permeability， resulting in intestinal bacterial translocation. In-hospital preparation of acute abdomen Ⅲ can reduce intestinal mucosal permeability， promote intestinal mucosal repair and can reduce intestinal bacterial translocation. The combination use of Glutamine and acute abdomen Ⅲ has no more obvious protection role in intestinal mucosal structure.endprint

[Key words] Acute abdomen Ⅲ； Ventilator-associated pneumonia； Intestinal permeability； Bacterial translocation

腸道被認(rèn)為是危重病應(yīng)激的“中心器官”和MODS的“始動器”[1]。腸道黏膜屏障是人體抵御外界細(xì)菌入侵的重要屏障，但因其本身存在大量細(xì)菌，所以又極其容易受到損傷。人體在各種應(yīng)激狀態(tài)下，如缺氧、嚴(yán)重感染等，可以出現(xiàn)腸道黏膜屏障的改變，通透性增高，免疫功能受到抑制，腸道菌群出現(xiàn)移位，甚至發(fā)展為多器官功能障礙綜合征（MODS）。呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎也不例外。本實驗研究院內(nèi)制劑急腹癥Ⅲ號對呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎腸道黏膜屏障和腸道菌群移位的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 100只體重280～320 g的清潔型雄性SD大鼠（上海西普爾必凱實驗動物有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號：SCXK（滬）2013-0016。實驗動物使用許可證號：浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗研究中心，SYXK（浙）2013-0184）。

1.1.2 實驗設(shè)備 光學(xué)顯微鏡Olympus（日本），石蠟切片機(jī)RM2135型（德國），低溫高速離心機(jī)Beckman（德國），SX-300S凝膠圖像分析處理系統(tǒng)（上海小源科技有限公司），高效液相色譜儀（美國water公司），精密電子天平（Sartorius公司），電泳儀（Bio-RAD公司），代謝籠等。

1.1.3 實驗藥品及試劑 （1）急腹癥Ⅲ號（其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參、川芎、生山梔、蒲公英），由杭州市中醫(yī)院制劑室提供（批準(zhǔn)文號：浙藥制字Z20100112），150 mg/（kg·次）。（2）谷氨酰胺（日本壽制藥株式會社）：等氮量的谷氨酰胺0.3 g/kg每日灌胃。（3）乳果糖標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）和甘露醇標(biāo)準(zhǔn)品（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 造模方法

1.2.1 大鼠呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎模型建立[2] （1）經(jīng)口氣管插管：用16和18號靜脈套管針制備氣管導(dǎo)管。大鼠麻醉前禁食12 h。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的烏拉坦腹腔注射麻醉，用消毒小紗布將舌向左外側(cè)上方輕輕拉出，頭部盡量向上抬起，同時上下頜分開。在額戴式喉鏡反射光照射下對準(zhǔn)聲門旋轉(zhuǎn)插入自制氣管導(dǎo)管，插入深度為套管針尾部與牙齒平齊。觀察棉絮在氣管導(dǎo)管口的起伏并用聽診器聽雙肺呼吸音以確定導(dǎo)管在氣管內(nèi)，將氣管導(dǎo)管外層與大鼠上唇縫合固定，連接動物呼吸機(jī)控制呼吸。呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)定為：潮氣量（V）12 mL/kg，呼吸頻率70次/min，吸入氧濃度 （FiO2）1.0。為防止體位引起的肺不張，每隔30 min行2～3次大V通氣。股靜脈插管，以3～5 mL/h輸入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的葡萄糖鹽水。（2）大鼠VAP模型制備：每只大鼠機(jī)械通氣24 h（無需使用肌松劑）后，豎起固定板>45°，以微量注射器快速注入0.2 mL 3×108 cfu/L銅綠假單胞菌（PA）菌液和0.55 mL氣體，并保持體位5 min。

1.2.2 造模成功的標(biāo)準(zhǔn)[2] （1）出現(xiàn)肺炎臨床表現(xiàn)。（2）肉眼觀察大鼠肺葉，可見不同程度的融合性出血性病灶。（3）大鼠肺組織光鏡下觀察呈小葉性肺炎特征。（4）外周血和肺泡灌洗液（BALF）細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)陽性。

1.3 給藥方法

將雄性SD大鼠隨機(jī)分為5組。（1）急腹癥Ⅲ號組：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號2 mL×5 d。（2）谷氨酰胺組：大鼠VAP模型，每日灌胃谷氨酰胺顆粒2 mL×5 d。（3）急腹癥Ⅲ號聯(lián)合谷氨酰胺組：大鼠VAP模型，每日灌胃急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺顆粒各2 mL×5 d。（4）安慰劑組：大鼠VAP模型，每日灌胃生理鹽水2 mL×5 d。（5）空白對照組：無特殊處理，每日灌胃生理鹽水2 mL×5 d。

1.4 檢測項目及方法

1.4.1 腸道通透性 術(shù)后第5 d，經(jīng)口灌胃乳果糖+甘露醇混合液2 mL，轉(zhuǎn)代謝籠收集24 h尿液。取10 mL尿液加硫柳汞2 mL 置-20℃冰箱保存。用HS色譜工作站對色譜圖形進(jìn)行積分處理。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算公式算出標(biāo)本中甘露醇及乳果糖濃度，從而計算得出L/M。

1.4.2 腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng) 術(shù)后第6天處死大鼠，在無菌條件下取數(shù)枚腸系膜根部淋巴結(jié)，經(jīng)碾磨后置37℃培養(yǎng)箱孵育48 h后鑒定菌種及統(tǒng)計菌落計數(shù)。菌落數(shù)超過100/g組織為細(xì)菌移位陽性。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。腸道細(xì)菌移位分析（計數(shù)資料）采用χ2檢驗進(jìn)行組間比較，通透性檢測用單因素方差分析及Dunnetts法進(jìn)行兩兩比較，組間數(shù)據(jù)比較采取方差分析，治療前后比較采取自身對照t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠L/M比較的單因素方差分析

單因素方差分析結(jié)果表示，五組術(shù)后第5天24 h尿液L/M不全相同（F=19.43，P<0.01）（表1）。進(jìn)一步采用Dunnetts法進(jìn)行兩兩比較，結(jié)果顯示，安慰劑組L/M高于空白對照組（P<0.05），其余三組則與空白對照組相似，均低于安慰劑組（P<0.01）（表1）。

2.2各組陽性率與安慰劑組的比較

組織培養(yǎng)：細(xì)菌培養(yǎng)陽性率見表2，采用χ2檢驗進(jìn)行組間比較，安慰劑組明顯高于空白對照組（P<0.01），其余三組陽性率均低于安慰劑組（P<0.05）。培養(yǎng)結(jié)果主要為大腸桿菌為主的腸道寄生菌。

3 討論

隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到胃腸道參與了許多危重病病理生理過程，是嚴(yán)重創(chuàng)傷、休克等等“二次打擊”的發(fā)生的誘因和參與者。腸道通透性與危重癥病情呈正相關(guān)，病情越重，腸道通透性越高，而通透性增高又加重病情[3]。腸道通透性增加后，內(nèi)毒素及細(xì)菌就可通過受損的腸黏膜屏障而導(dǎo)致細(xì)菌移位。Berg RD和Garlinton AW[4]定義細(xì)菌移位：胃腸道內(nèi)寄生菌通過某些通道進(jìn)入正常無菌組織，如腸系膜淋巴結(jié)和其他臟器，事實上移位應(yīng)包括所有有活力和無活力的微生物及其產(chǎn)物如內(nèi)毒素等。促使細(xì)菌移位的機(jī)制[5]：（1）腸黏膜屏障的損傷和萎縮；（2）機(jī)體免疫功能的下降；（3）腸道菌群失調(diào)引起細(xì)菌過度增殖。研究表明，腸道通透性改變可準(zhǔn)確反映腸黏膜的損害。腸道通透性與腸屏障有關(guān)，而腸屏障又可從腸黏膜形態(tài)的變化來判斷其損害的情況。故腸道通透性增高可反映早期腸屏障的損傷。呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎也是如此，本實驗通過監(jiān)測實驗大鼠尿液中L/M、腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)來判斷其腸黏膜損傷的情況。endprint

急腹癥Ⅲ號是我院院內(nèi)制劑，其基本成分為生大黃、川樸、枳殼、丹參、川芎、生山梔、蒲公英等。主要是根據(jù)《傷寒論》大承氣湯加減化裁而成，具有泄熱通腑，清熱解毒等功效，臨床上多應(yīng)用于熱瘀所致的腑實證。中醫(yī)認(rèn)為“六腑以通為用”，六腑傳化水谷，需不斷收納、消化、傳導(dǎo)和排泄，虛實更替，宜通而不宜滯，因此通腑法在腑氣不通及胃腸功能受損方面屢有見效。大黃作為通腑要藥在《神農(nóng)本草經(jīng)》中早有記載：“蕩滌腸胃，推陳致新，通利水谷，調(diào)中化食，安和五臟”。藥理研究表明本院內(nèi)制劑具有抗凝和抑制血小板黏附、聚集、釋放及擴(kuò)張血管的作用，保護(hù)腸黏膜屏障功能，減少細(xì)菌移位，改善腸黏膜微循環(huán)的作用[6]。李軍等[7]實驗證實急腹癥Ⅲ號治療急性胰腺炎后小腸組織學(xué)損害減輕，細(xì)菌腸外器官移居程度下降，此結(jié)果與陳德昌等[8]的研究結(jié)果相符。其治療重癥胰腺炎和降低死亡率機(jī)制部分是通過保護(hù)腸黏膜屏障功能和減輕小腸缺血性損傷來實現(xiàn)的。

腸黏膜屏障及免疫系統(tǒng)受損，隨之發(fā)生細(xì)菌和內(nèi)毒素易位，可導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)（SIRS）和多器官功能衰竭（MODS）的發(fā)生[9，10]。腸黏膜通透性增高是腸屏障功能受損的重要表現(xiàn)[11]，腸道黏膜通透性增高常常出現(xiàn)在腸黏膜形態(tài)學(xué)之前。因此，通過測定尿L/M比值可有效地反映腸道通透性的改變[12]。谷氨酰胺對危重患者的腸道保護(hù)作用已初步得到肯定[13]，它可以減輕腸屏障損害，防止腸源性感染[14，15]，抑制小腸黏膜萎縮[16]，本實驗通過院內(nèi)制劑急腹癥Ⅲ號與谷氨酰胺及空白對照組對比研究發(fā)現(xiàn)呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎模型腸道通透性增高（安慰劑組L/M高于空白對照組（P<0.05），細(xì)菌移位率增加（安慰劑組明顯高于空白對照組（P<0.01）。此結(jié)果與Diebel LN等[17]研究結(jié)果相似。

綜上，院內(nèi)制劑急腹癥Ⅲ號及谷氨酰胺均能減輕呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎腸黏膜結(jié)構(gòu)的破壞，降低腸道通透性及減少腸道菌群移位。關(guān)于大黃制劑的作用機(jī)制，主要有促進(jìn)腸道蠕動、改善胃腸黏膜血流[18]、維護(hù)腸黏膜黏液屏障、阻止腸道菌群移位、防止腸道內(nèi)毒素入侵[19]、保持腸道菌群平衡，具有抗炎作用[20]，急腹癥Ⅲ號為復(fù)方制劑，具體作用成分及機(jī)制有待進(jìn)一步研究探討。

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（收稿日期：2017-09-18）endprint