男性不育患者Y染色體AZF區(qū)微缺失的臨床研究

陳俊豐+殷瑋琪+王愷赟+馬超+王力+馬琪

[摘要] 目的 探討男性不育患者Y染色體微缺失檢測(cè)的臨床意義。 方法 應(yīng)用PCR多重技術(shù)對(duì)293例無精子和嚴(yán)重少弱精子的不育患者（非梗阻性無精子癥159例、嚴(yán)重少弱精子癥134例）Y染色體上AZFa、AZFb和AZFc 3個(gè)區(qū)域進(jìn)行微缺失檢測(cè)。 結(jié)果 在293例患者中，共檢出31例患者AZF區(qū)域微缺失，缺失率為10.58%；其中，非梗阻性無精癥23例，嚴(yán)重少弱精癥8例。上述患者中，4例位于AZFb區(qū)，5例位于AZFb+AZFc區(qū)，20例位于AZFc區(qū)，2例被檢出AZFc+AZFb+AZFa區(qū)域三重缺失。 結(jié)論 Y染色體AZF區(qū)微缺失是引起男性不育的重要原因之一，無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥不育患者有必要進(jìn)行Y染色體微缺失檢查，便于早期診斷和治療。

[關(guān)鍵詞] Y染色體；AZF微缺失；男性不育；無精子癥；弱精子癥

[中圖分類號(hào)] R698.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2017）34-0007-03

Clinical study on microdeletion of AZF regions of Y chromosome in male infertile patients

CHEN Junfeng1，2 YIN Weiqi2 WANG Kaiyun1，2 MA Chao3 WANG Li3 MA Qi1，2

1.Translational Research Laboratory for Urology， Ningbo Key Laboratory， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China； 2.Department of Urology， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China； 3.Andrology Laboratory， Ningbo First Hospital， Ningbo 315010， China

[Abstract] Objective To investigate the clinical significance of Y chromosome microdeletion in male infertile patients. Methods PCR multiple technique was applied to perform microdeletion detection in the three regions of AZFa， AZFb and AZFc on the Y chromosome in a total of 293 infertile patients with azoospermia and oligoasthenospermatism（non-obstructive azoospermia in 159 cases and severe oligoasthenospermatism in 134 cases）. Results Among 293 patients， a total of 31 patients had microdeletion of AZF region， with the deletion rate of 10.58%； among them， non-obstructive azoospermia was in 23 cases， and severe oligospermia was in 8 cases. Of the above patients， 4 patients were located in the AZFb region， 5 were located in AZFb+AZFc region， and 20 were located in AZFc region. AZFc+AZFb+AZFa region triple deletion was detected in 2 cases. Conclusion The microdeletion of Y chromosome in AZF region is one of the important causes of male infertility. For the infertile patients with azoospermia and severe oligoasthenospermatism， there was a need to carry out Y chromosome microdeletion examination， which is easy to perform early diagnosis and treatment.

[Key words] Y chromosome； AZF microdeletion； Male infertility； Azoospermia； Asthenospermia

全球有10%～15%的育齡夫婦受困于不育，其中男性因素超過一半[1-2]。引起男性不育的因素很多，而無精子癥和嚴(yán)重少精子癥是男性不育中常見的病因[3]。造成非梗阻性無精子癥和嚴(yán)重少精子癥最常見遺傳學(xué)病因是精子發(fā)生基因的異常。Y染色體長(zhǎng)臂11間隔存在控制精子發(fā)生的基因?yàn)闊o精子癥因子（azoospermic factor，AZF），AZF發(fā)生的區(qū)域主要有4 個(gè)：AZFa、AZFb、AZFc 及AZFd，這其中以AZFc 的缺失最多見，AZFb 的缺失次之，AZFa、AZFd 區(qū)少見[4-5]。這些區(qū)域任意1個(gè)位點(diǎn)的微缺失可導(dǎo)致精子發(fā)生障礙，臨床上可表現(xiàn)為男性無精子癥或嚴(yán)重少弱精子癥，因此對(duì)AZF的研究備受關(guān)注。本文利用兩組多重PCR技術(shù)對(duì)293例無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者外周血進(jìn)行Y染色體AZF區(qū)微缺失檢測(cè)，探討在男性不育患者中Y染色體微缺失檢測(cè)的臨床意義。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料

篩選2012年11月～2015年4月在寧波市第一醫(yī)院泌尿外科就診的男性不育患者293例，年齡20～50歲，平均（27.64±4.57）歲，均有不育史，其中非梗阻性無精子癥159例，嚴(yán)重少弱精子癥134例。精液分析及無精子癥、嚴(yán)重少精子癥的診斷均按照WHO第5 版《人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》要求進(jìn)行[6]，即連續(xù)3次精液檢查并經(jīng)離心沉淀檢測(cè)均無精子者為無精子癥，3次精子濃度均<5.0×106個(gè)/mL者為少弱精子癥。此外，本研究選取40例健康生育男性作為陽(yáng)性對(duì)照，和10例女性作為陰性對(duì)照，以此監(jiān)測(cè)樣本是否污染。

1.2 研究方法

Y染色體微缺失檢測(cè)：本研究參照歐洲男科學(xué)會(huì)和歐洲分子遺傳質(zhì)量網(wǎng)聯(lián)合推薦的體系及位點(diǎn)，即在每個(gè)AZF區(qū)域使用2個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)：SY84（AZFa）、SY86（AZFa）、SY127（AZFb）、SY134（AZFb）、SY254（AZFc）、SY255（AZFc）。利用這6個(gè)序列標(biāo)簽位點(diǎn)通過兩套多重聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增：Ⅰ組為SY254、SY86、SY127，Ⅱ組為SY255、SY84、SY134。

本研究直接用外周血作為底物擴(kuò)增，改良強(qiáng)力多重PCR技術(shù)體系，PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)緩沖液包括60 mM Ttricine，5 mmol/L（NH4）2SO4，3.5 mmol/L Mgcl2，6%甘油，PH8.7，全血2.5 μL，dNTP 2 μL，1 μL突變型Tag酶，0.1～0.2 μM各引物濃度。PCR循環(huán)條件為：95℃初始預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，58℃退火90 s，72℃延伸60 s，35個(gè)反應(yīng)循環(huán)后72℃延伸15 min，4℃保存樣品。Y染色體性別決定基因SRY為內(nèi)控對(duì)照，已育健康男性的DNA作為陽(yáng)性對(duì)照，正常女性DNA作為陰性對(duì)照，滅菌蒸餾水作為空白對(duì)照。PCR產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳電壓120 V，電泳時(shí)間90 min，通過凝膠成像儀觀察分析。

2 結(jié)果

2.1 無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者中Y染色體缺失率情況

293名無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者中，31例發(fā)生AZF微缺失，總?cè)笔蕿?0.58%。無精子癥159例中23例缺失，缺失率為14.47%；嚴(yán)重少弱精子癥134例中8例缺失，缺失率為5.97%；40例正常男性對(duì)照未發(fā)現(xiàn)缺失位點(diǎn)。

2.2 AZF不同區(qū)域的缺失率情況

31例AZF微缺失患者中，無精子癥23例，嚴(yán)重少弱精子癥8例。AZFb區(qū)域缺失4例，占1.37%；AZFc區(qū)域缺失20例，占6.82%；AZFb+AZFc區(qū)缺失5例，占1.71%；AZFa+AZFb+AZFc區(qū)缺失2例，占0.68%。在31例男性AZF缺失患者中無精子癥患者發(fā)生的缺失率明顯高于嚴(yán)重少弱精子癥患者。無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者各區(qū)域缺失具體情況見表1。封三圖1A為正常男性Y染色體微缺失檢測(cè)陰性結(jié)果電泳圖，封三圖1B為Y染色體AZFc區(qū)域微缺失檢測(cè)結(jié)果的電泳圖。

3 討論

引起男性不育有多種原因，其中無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥是影響男性不育的重要遺傳因素。Y染色體AZF區(qū)微缺失是導(dǎo)致精子發(fā)生障礙的重要原因之一，通過微缺失篩選可以避免一些不必要的藥物和手術(shù)治療。由于地區(qū)、民族、納入研究樣本的標(biāo)準(zhǔn)及選擇AZF區(qū)序列標(biāo)簽位點(diǎn)的數(shù)量及位置差異，AZF微缺失發(fā)生率在無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者中也不盡一致。有研究表明AZF微缺失發(fā)生率在無精子癥和嚴(yán)重少弱精子癥患者中，分別為10%～15%和5%～10%[7]。韓瑞鈺等[8]報(bào)道1875例不育患者中，Y染色體微缺失率為11.6%，其中無精子癥缺失率為18.4%，少弱精子癥缺失率為4.8%，重度少精子癥缺失率為4.8%。Ambulkar等[9]報(bào)道在印度156名男性不育患者中，Y染色體缺失率達(dá)8.83%，其中在61名無精子癥患者中有8例Y染色體缺失，缺失率達(dá)13.1%，在嚴(yán)重少弱精子癥患者中Y染色體缺失率為5.3%。Naasse等[10]研究顯示，573名摩洛哥無精子癥和少精子癥患者中，有60例Y染色體微缺失，缺失率為10.5%，其中無精子癥和重度少精子癥患者中的缺失率分別為13.06%和1.55%。本研究顯示，Y染色體微缺失發(fā)生率在無精子癥患者中為14.47%，少弱精子癥患者中為5.97%，總?cè)笔蕿?0.58%，與國(guó)內(nèi)外報(bào)道相近。

Y染色體長(zhǎng)臂AZF區(qū)，主要由四個(gè)相互獨(dú)立的區(qū)域AZFa、AZFb、AZFc和A ZFd組成，各個(gè)區(qū)域的缺失引起的臨床表型不同[11]。AZFa的缺失非常罕見，僅占男性不育Y染色體微缺失中的3%左右，整個(gè)區(qū)域缺失多表現(xiàn)為唯支持細(xì)胞綜合征，為原發(fā)性無精子癥[12-13]。AZFb缺失區(qū)域的患者，占男性不育Y染色體微缺失中的15%左右，生殖細(xì)胞成熟障礙，生精過程阻滯在初級(jí)精母細(xì)胞階段，睪丸內(nèi)可見精原細(xì)胞和初級(jí)精母細(xì)胞，但無精子生成[13-14]。AZFa與AZFb區(qū)缺失的不育患者，即使睪丸穿刺也無法獲取精子，也不能做卵母細(xì)胞質(zhì)內(nèi)單精子注射，只能通過他人供精的方式生育后代。AZFc區(qū)域缺失最常見，占男性不育Y染色體微缺失中的60%左右，臨床表現(xiàn)多樣化，從輕度弱精子癥到無精子癥[13，15]。目前普遍認(rèn)為，AZFc區(qū)域缺失的患者，尚存生成精子的能力，因此，可以通過輔助生殖技術(shù)生育自己的后代。AZFd缺失的患者，一般表現(xiàn)為中輕度少精癥，有些甚至是擁有正常的精子數(shù)，但精子的形態(tài)卻畸形。目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道該區(qū)域獨(dú)立缺失的情況存在，其常同其他區(qū)域聯(lián)合缺失[16-17]。韓瑞鈺等[8]報(bào)道1875例不育患者中，217名患者Y染色體微缺失，Y染色體微缺失率為11.6%，AZFa區(qū)缺失8例，占3.7%；AZF b區(qū)缺失9例，占4.2%；AZFc區(qū)缺失122例，占56.2%，AZFb+AZFc區(qū)缺失46例，占21.2%，AZFa+AZFb+AZFc區(qū)缺失32例，占14.7%。Asadi等[18]研究報(bào)道1885名伊朗無精子癥和少精子癥患者中，有99例Y染色體微缺失，缺失率為5.2%。在這99例微缺失患者中，AZFc區(qū)域缺失患者為70例，缺失率高達(dá)70.7%，AZFb+AZFc缺失率為18.1%，AZFb缺失率為5.0%，AZFa與AZFa+AZFb+AZFc區(qū)缺失率均為3%。Kim等[19]報(bào)道，在1306例韓國(guó)男性不育患者中，有101例Y染色體微缺失，其中AZFc區(qū)域缺失率為53.5%，AZFb+AZFc缺失率為24.7%，AZFa+AZFb+AZFc缺失率為8.9%。一項(xiàng)對(duì)中國(guó)男性不育患者Y染色體微缺失的多中心研究顯示，在1808例不育患者中，發(fā)現(xiàn)有150例（8.3%）Y染色體微缺失，在這些微缺失患者中，有2例在AZFa區(qū)缺失，3例在AZFb區(qū)缺失，35例在AZFc區(qū)缺失，AZFb+AZFc與AZFa+AZFb+AZFc聯(lián)合缺失各有3例[20]。本研究尚未發(fā)現(xiàn)單純AZFa和AZFd區(qū)缺失患者，可能與這些缺失類型比較少見、收集樣本量較少有關(guān)。本文AZFb區(qū)域缺失4例，占12.9%，AZFc區(qū)域缺失20例，占64.52%，AZFb+AZFc區(qū)缺失5例，占16.13%，AZFa+AZFb+AZFc區(qū)缺失2例，占6.45%。我們報(bào)道的AZF各位點(diǎn)微缺失發(fā)生率與國(guó)內(nèi)外報(bào)道有相同的趨勢(shì)。endprint

本研究表明非梗阻性無精子癥和嚴(yán)重少精子癥患者與Y染色體微缺失密切相關(guān)。Y染色體微缺失在輔助生殖中可垂直傳遞給后代，導(dǎo)致子代不育。因此為了減少這種遺傳病的發(fā)生，在輔助生殖前進(jìn)行Y染色體微缺失檢測(cè)具有重要的臨床意義。

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（收稿日期：2017-09-25）endprint