Menin和CyclinD1在非特殊型浸潤性乳腺癌中的表達及意義

龔靜青+曹端榮+鄒桂華+李曉鳴+柳玉紅+邱立

【摘要】 目的：探討非特殊型浸潤性乳腺癌組織中Menin蛋白和細胞周期素D1（CyclinD1）表達的相關性，以及兩者與乳腺癌淋巴結轉移生物學行為和臨床分期的關系，進而探討Menin蛋白和CyclinD1在乳腺癌的發(fā)生及轉移過程中的作用。方法：采用免疫組織化學SP法檢測71例伴有或不伴有淋巴結轉移的乳腺癌組織中Menin蛋白和CyclinD1的表達情況，然后研究其相關性。結果：Menin蛋白和CyclinD1在本研究乳腺癌癌組織中的表達陽性率分別為19.72%（14/71）和77.46%（55/71），兩者表達存在負相關（r=-0.411，P<0.05）。Menin蛋白和CyclinD1表達與乳腺癌的TNM分期有關（P<0.05），但與乳腺癌患者的年齡和腫塊大小無明顯關系（P>0.05）。Menin蛋白和CyclinD1在存在淋巴結轉移組的乳腺癌癌組織中，前者有淋巴結轉移組陽性率低于無淋巴結轉移組（P<0.05），而后者有淋巴結轉移組陽性率高于無淋巴結轉移組（P<0.05）。結論：Menin蛋白和CyclinD1參與了乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展，Menin蛋白的失活可能在乳腺癌發(fā)生及轉移過程中起重要作用，而CyclinD1基因的過度表達也與乳腺癌的發(fā)生及轉移有關。

【關鍵詞】 非特殊型浸潤性乳腺癌； Menin； 細胞周期素D1； 淋巴結轉移

【Abstract】 Objective：To explore the non-special invasive breast carcinoma tissues Menin protein and CyclinD1 expression of correlation，and the clinical stage and lymph node metastasis of breast cancer biology behavior and the relationship， then dicusses the role of Menin protein and CyclinD1 in the occurrence and metastasis of breast cancer.Method：The expression of Menin protein and CyclinD1 were detected by SP immunohistochemical method in 71 cases with or without lymph node metastasis in breast cancer，and studied their correlation.Result：Menin protein and CyclinD1 in the study of breast cancer in the positive expression rate of 19.72%（14/71） and 77.46%（55/71），the expression had a significant negative correlation（r=-0.411，P<0.05）.The expression of Menin protein and CyclinD1 was associated with the TNM staging of breast cancer（P<0.05），but has no obvious relation of the patients age and tumor size（P>0.05）.Menin protein and CyclinD1 in breast cancer lymph node metastasis group，the lymph node metastasis group was lower than that without lymph node metastasis（P<0.05），while the positive rate of the group with lymph node metastasis than those without lymph node metastasis（P<0.05）.Conclusion：The expressions of Menin and CyclinD1 are closely related to lymphatic metastasis of non-special invasive breast carcinoma，the inactivation of Menin protein would be play an important role in the development of breast cancer，over-expression of CyclinD1 is related to the occurrence of breast cancer.

【Key words】 Non-special invasive breast carcinoma； Menin； CyclinD1； Lymphatic metastasis

First-authors address：The Peoples Hospital of Baoan District in Shenzhen City，Shenzhen 518101，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.33.008

非特殊型浸潤性乳腺癌（non-special invasive breast carcinoma）是來自乳腺上皮的惡性腫瘤。在中國，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率在逐年增加，是女性最常見的惡性腫瘤之一。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展過程有諸多因素參與，除與生育史、內(nèi)外源性激素肥胖、運動等因素外，還與多種原癌基因過度表達和部分抑癌基因的失活有關，相關的有細胞周期素（Cyclin）、C-erbB2、Bcl-2、P53、Rb等。Menin蛋白為抑癌基因Men1所編碼的保守蛋白，研究顯示Menin蛋白在轉錄調(diào)節(jié)、基因組穩(wěn)定、細胞分裂增殖及細胞周期調(diào)控中扮演重要角色，且參與細胞分裂增殖及與調(diào)控細胞周期的蛋白相互作用[1-2]。細胞周期蛋白D1（CyclinD1）是一種原癌基因，在細胞周期中起正調(diào)控作用，前者在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色[3-4]。文獻[5]研究表明，Menin蛋白可通過與NF-κB相互作用來抑制NF-κB介導的CyclinD1的轉錄從而達到對細胞增殖的抑制。本研究主要探討乳腺癌中CyclinD1蛋白與Menin蛋白兩者表達的相關性及其意義，現(xiàn)報告如下。endprint

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月-2015年12月深圳市寶安區(qū)人民醫(yī)院的原發(fā)性乳腺癌手術標本71例，手術患者均為女性，年齡33～75歲，中位49歲。納入標準：（1）非特殊型浸潤性乳腺癌病理診斷標準按2012年WHO腫瘤分類標準；（2）病理診斷均由相同兩位高級病理醫(yī)師證實為非特殊型浸潤性乳腺癌；（3）所有患者術前均未接受放、化療；（4）按國際抗癌聯(lián)盟UICC分期標準行TNM分期；（5）所有病例臨床資料完整，其中28例患者伴有腋窩淋巴結轉移。排除標準：乳腺癌復發(fā)病例。

1.2 方法 所有試劑均購自廣州安必平醫(yī)藥科技有限公司，應用免疫組化SP法檢測71例乳腺癌標本中CyclinD1和Menin蛋白的表達，用已知陽性片作為陽性對照。將乳腺癌標本進行脫水、石蠟包埋、4 μm切片和烤片（60 ℃，2 h），二甲苯脫蠟、梯度酒精處理，3%H2O2 37 ℃孵育10 min，磷酸鹽緩沖液（PBS）反復沖洗3次，5 min，血清工作液封閉，滴加相應一抗，37 ℃孵育2 h，PBS沖洗，（同時使用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照），滴加生物素二抗，之后滴加辣根過氧化物酶標記二抗，37 ℃孵育30 mim，PBS沖洗，DAB顯色，用自來水沖洗，蘇木素染色，脫水，透明，封片，使用顯微鏡觀察。

1.3 結果判讀 根據(jù)文獻[6]報道，Menin和CyclinD1核染色百分比及強度積分相加方法判斷陽性及陰性，方法如下，免疫組化陽性百分比0分：無腫瘤細胞陽性；1分：比例為1%～25%；2分：比例為26%～50%；3分：比例為51%～75%；4分：比例為76%～100%。免疫組化著色強度0分：細胞未染色為；1分：淡黃色；2分：棕黃色；3分：棕褐色。百分比及著色強度得分相加：0～3分判定為陰性，4～7分判定為陽性。

1.4 統(tǒng)計學處理 本實驗使用SPSS 16.0統(tǒng)計學軟件對所有數(shù)據(jù)進行解析，計數(shù)資料采用率（%）表示，比較采用 字2檢驗，相關性分析采用Spearman法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 Menin蛋白和CyclinD1在兩組乳腺癌組織中的表達 71例乳腺癌組織中Menin蛋白和CyclinD1均主要在癌細胞的細胞核中表達，兩者的陽性率分別為19.72%（14/71）和77.46%（55/71），見圖1、2。

2.2 Menin蛋白和CyclinD1表達與乳腺癌淋巴結轉移之間的關系 在伴有淋巴結轉移組的乳腺癌組織中，Menin蛋白的表達比無淋巴結轉移組低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。在伴有淋巴結轉移組的乳腺癌組織中CyclinD1表達的陽性率明顯高于無淋巴結轉移組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.3 Menin蛋白和CyclinD1表達與非特殊型浸潤性乳腺癌臨床病理特征的關系在乳腺癌TNM分期中，分期越晚，Menin蛋白表達的陽性率越低，差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=7.265，P<0.05）；而CyclinD1表達情況正好相反，即臨床分期越晚CyclinD1表達的陽性率越高，差異有統(tǒng)計學意義（ 字2=6.754，P<0.05）。而Menin蛋白和CyclinD1的表達與乳腺癌腫瘤的其他臨床病理特征如腫瘤大小和患者年齡均無明顯關系（P>0.05），見表2。

2.4 Menin蛋白和CyclinD1在乳腺浸潤癌導管癌組織中表達的相關性 71例乳腺癌組織中，Menin蛋白和CyclinD1表達均陽性6例；Menin蛋白表達陽性而CyclinD1陰性8例；Menin蛋白表達陰性而CyclinD1表達陽性49例；Menin蛋白及CyclinD1均陰性8例。Menin蛋白和CyclinD1表達呈負相關（r=-0.411，P<0.05），見表3。

3 討論

文獻[7]研究表明，我國乳腺癌發(fā)病逐年上升，每年新發(fā)病例數(shù)約24.9萬，城市發(fā)病人數(shù)高于農(nóng)村，且發(fā)病中位年齡越來越年輕，乳腺癌居女性癌癥發(fā)病首位。在我國乳腺彩超是篩查乳腺癌常用檢查，但我國人口基數(shù)大，發(fā)病人數(shù)之多，乳腺癌雖然其生存率大幅提高，但加強乳腺癌預防、研究其發(fā)病機制及提高預后還是一項艱巨任務。

乳腺癌發(fā)病的危險因素眾多，究其基因水平的病因，基因的異常表達也與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關，原癌基因的激活和抑癌基因的失活在整個乳腺癌發(fā)生和發(fā)展過程中扮演重要角色[8-9]。

本實驗旨在研究CyclinD1在非特殊型乳腺癌中的表達情況及其與淋巴結轉移生物學行為和臨床分期的關系。在本實驗71例乳腺癌病例癌組織中CyclinD1陽性率為77.46%，且隨臨床分期的增高，CyclinD1的陽性率在不同分期中具有升高趨勢，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；這與張榮君等[10]的結論相一致，他們認為CyclinD1表達的陽性率在乳腺癌的TNM不同分期中比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。本實驗中乳腺癌伴淋巴結轉移組CyclinD1陽性表達率顯著高于無淋巴結轉移組（P<0.05），提示CyclinD1在乳腺癌淋巴結轉移中起著重要促進作用，故檢測癌組織中CyclinD1的表達情況對判斷乳腺癌是否有淋巴結轉移傾向具有重要參考價值，這與文獻[11]研究相符。CyclinD1基因所編碼的CyclinD1蛋白直接參與細胞周期調(diào)控，是G1期細胞增殖的關鍵蛋白，其通過結合并激活G1時期特有的周期蛋白依賴性激酶CDK4使Rb蛋白磷酸化，從而調(diào)控細胞周期G1-S的過渡，它的異常表達可以與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關，如基底細胞癌、膀胱癌及骨腫瘤等[12]。此外，文獻[13]研究表明，在乳腺癌病例中，CyclinD1蛋白在乳腺癌病理組織分型中，級別越高，表達越高；且低表達組比高表達組的患者生存率要高，無淋巴結轉移的患者比有淋巴結轉移的患者生存率高。本實驗中，乳腺癌臨床分期越高且伴有淋巴結轉移比無淋巴結轉移組的CyclinD1陽性率高。這些均提示CyclinD1蛋白在乳腺癌中可能通過促進細胞周期G1-S的過渡，從而促進乳腺癌發(fā)生發(fā)展，所以檢測乳腺癌組織中CyclinD1蛋白表達及有無淋巴結轉移對有無患者生存率有著重要的意義。endprint

本研究涉及的Menin蛋白是由Men1所編碼，后者是一種抑癌基因，它的異常是導致Wermer綜合征的關鍵因素之一。Men1定位于染色體11q13，其編碼Menin蛋白。它主要分布在細胞核中，Menin蛋白分子量為67Da，由610個氨基酸構成，屬于保守蛋白的一種。Men1基因突變導致的Menin蛋白表達異?；蚝宿D位異常將引起一系列信號通路紊亂，從而導致腫瘤或疾病的發(fā)生發(fā)展。國內(nèi)外研究關于Menin蛋白腫瘤抑制功能的研究也越來越多。

目前多關注Menin蛋白與多種內(nèi)分泌腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關系，如：甲狀旁腺、腎上腺、垂體等。但Menin蛋白在多種不同腫瘤中通過不同途徑起作用，例如它通過與組蛋白調(diào)節(jié)酶和轉錄因子相互作用，從而抑制胰腺癌細胞在體內(nèi)外生長[14]，在胃癌AGS細胞株中，Menin高表達可能通過抑制P13K/Akt和NF-ΚB信號轉導通路從而降低其生長，起到抑制胃癌的作用[15]，Menin可抑制人類腎癌細胞的增殖[16]。研究表明Menin蛋白在乳腺癌的相關文獻中作用不盡相同，例如，Menin蛋白定位于乳腺癌細胞的細胞核，且它與雌激素受體（ER）相互作用，從而增強乳腺癌細胞中雌激素的活性，并且他們在臨床研究還證實，在使用雌激素受體調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬的乳腺癌的患者中，Menin蛋白陽性的乳腺癌比陰性的治療效果差[17]。乳腺癌作為一種受激素影響的腫瘤，Hitomi等[18]在乳腺癌細胞的研究中表明，Menin蛋白可通過激活ERα的AF-2的聯(lián)合區(qū)域，從而調(diào)節(jié)ERα轉錄功能，以影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。目前關于Menin在非特殊型浸潤性乳腺癌組織中表達情況及臨床病理特征的相關性少見報道，本實驗旨在探討Menin蛋白在非特殊型乳腺癌中的作用及其淋巴結轉移生物學行為和臨床分期的關系，以及Menin在乳腺癌中的可能存在的作用及其與CyclinD1在乳腺癌中的作用。

本實驗證實，在71例非特殊型浸潤性乳腺癌中，通過免疫組織化學方法，Menin蛋白定均位于細胞核中，而蘇寶威[19]在乳腺癌MCF-7細胞株中通過免疫熒光定位方法發(fā)現(xiàn)，Menin主要定位于細胞核中，但在細胞質及細胞膜中均有不同程度的表達，他認為在細胞質及細胞膜中表達可能因為Menin有許多核定位信號（NLSs），提示其轉錄活性可能與其進出細胞核能力有關。Menin在細胞核中通過與其他關鍵轉錄因子相互作用，從而起到基因表達調(diào)控作用[20]，本實驗表明乳腺癌組織切片中通過免疫組化結果Menin定位于細胞核此外Imachi等[17]在乳腺癌MCF-7細胞株中發(fā)現(xiàn)Menin定位于細胞核中，這與本實驗研究一致，這些提示在乳腺癌組織切片中Menin蛋白定位細胞核是否與乳腺癌MCF-7細胞株中定位相一致，且目前關于細胞質和細胞膜中Menin蛋白的作用目前尚不明確，這些均提示需對相關Menin蛋白進一步研究。

本實驗表明，71例乳腺癌中Menin蛋白表達陽性（14/71）明顯少于陰性例數(shù)（57/71），Menin蛋白表達與乳腺癌TNM分期有關系，即臨床分期越晚Menin蛋白表達的陽性率越低，這表明Menin蛋白的失活，使其抑制腫瘤細胞的增殖的作用降低，而臨床分期越晚Menin蛋白表達的陽性率越低起一定作用。非特殊型浸潤性乳腺癌伴淋巴結轉移組Menin陽性表達率顯著低于無淋巴結轉移組（P=0.006）。本研究提示，Menin蛋白在乳腺癌中發(fā)生發(fā)展過程中起抑制作用。

腫瘤危險因素眾多，其中基因異常是常見因素，它的發(fā)生又是多個基因表達相互協(xié)同、共同作用的結果。通過分子機制研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB、Smad-3、bJunD等是調(diào)節(jié)細胞增殖的關鍵的轉錄因子，Menin蛋白與它們相互作用，從而起到抑制細胞增生的作用，Men1與Menin蛋白通借助抑制細胞增殖，從而發(fā)揮降低腫瘤發(fā)病概率的目的，阻止腫瘤細胞增殖有多種機制，而其中一種機制為：Menin蛋白通過與NF-κB相互作用來抑制NF-κB介導的CyclinD1的轉錄從而導致細胞增殖的抑制[5]。這讓筆者假設，在乳腺癌發(fā)病中，Menin蛋白能否通過NF-κB通路，從而影響CyclinD1的轉錄，從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本實驗結果顯示：乳腺癌中Menin蛋白表達與CyclinD1表達呈負相關（r=-0.411，P<0.05），提示Men1基因的失活導致Menin蛋白表達的減少及CyclinD1基因的表達與乳腺癌發(fā)生發(fā)展密切相關。

本實驗中Menin蛋白和CyclinD1在不同年齡組及不同腫塊大小組中的陽性率比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明Menin蛋白和CyclinD1與乳腺癌患者的年齡和腫瘤大小可能無關。綜合CyclinD1和Menin蛋白在有無淋巴結轉移中的表達情況及臨床分期的結果提示，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中可能是通過Menin蛋白的失活，從而解除了對NF-κB介導的CyclinD1的轉錄的抑制，導致CyclinD1基因的過度表達，CyclinD1為G1期細胞增殖的關鍵蛋白，它的表達異?？赡軐е录毎漠惓Ｔ鲋扯鴮е氯橄侔┑陌l(fā)生和發(fā)展。目前已知的乳腺癌相關的基因有40多個，其中最常見的是BRCA1和BRCA2，但乳腺癌的發(fā)生是多種異?；蚬餐慕Y果，且是多步驟的過程，而這一過程是否有其它因子的參與，確切機制如何，尚需相關實驗進一步證實。

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（收稿日期：2017-10-16） （本文編輯：張爽）endprint