投喂時間影響大菱鲆幼魚的生長及類胰島素樣生長因子-Ⅰ基因的表達

王藝超 鄭珂珂 徐后國 梁萌青

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,青島 266071)

類胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)是一類具有胰島素樣代謝和促進有絲分裂功能的多肽類激素，能促進組織細(xì)胞的增值、分化和凋亡，是調(diào)控魚類生長和發(fā)育的重要內(nèi)分泌體系。IGFs系統(tǒng)包括類胰島素樣生長因子-Ⅰ(IGF-Ⅰ)、類胰島素樣生長因子-Ⅱ(IGF-Ⅱ)2種同源多肽。魚類IGF-Ⅰ在進化上相當(dāng)保守，一級結(jié)構(gòu)由70個氨基酸序列組成，具有部分與胰島素相似的功能，如降低血糖水平、促進魚類對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收等。IGF-Ⅰ通過循環(huán)系統(tǒng)發(fā)揮作用，其中90%的IGF-Ⅰ由肝臟合成，以內(nèi)分泌的形式進入血液，部分組織如骨髓、腦等也能夠合成IGF-Ⅰ，主要通過旁分泌和/或內(nèi)分泌的形式發(fā)揮作用。魚類IGF-Ⅰ的表達受到營養(yǎng)狀況、生長環(huán)境及激素水平等因素的調(diào)節(jié)[6]。

大菱鲆(Scophthalmusmaximus)，又稱多寶魚，屬鰈形目(Pleuronectiformes)鲆科(Bothidae)，以肉質(zhì)鮮美、富含豐富膠原蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)著稱，由于大菱鲆具有生長迅速、易馴化，對配合飼料接受能力強，適合高密度養(yǎng)殖的特點，自1992年由黃海水產(chǎn)研究所雷霽霖院士引進我國后，迅速發(fā)展成為我國北方最重要的經(jīng)濟魚種之一。本試驗通過研究不同投喂時間對大菱鲆幼魚生長、飼料利用及肝臟IGF-Ⅰ基因表達的影響，旨在為大菱鲆人工養(yǎng)殖中投喂方式的確定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗用飼料為青島七好生物科技有限公司生產(chǎn)的國產(chǎn)鰈鲆鰨類幼魚專用2號飼料，粒徑200～300 μm，主要營養(yǎng)成分如下：粗蛋白質(zhì)含量48.83%，粗脂肪含量9.52%，粗灰分含量12.53%。試驗用Trizol Reagent試劑盒、Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒和FastStart Essential DNA Green Master實時熒光定量試劑盒均購自青島賽尚科貿(mào)有限公司。試驗用瓊脂糖、氯仿、異丙醇、乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 試驗設(shè)計與飼養(yǎng)管理

試驗用大菱鲆幼魚購自日照水產(chǎn)研究所試驗基地，選取規(guī)格整齊、健康的大菱鲆幼魚，馴養(yǎng)1周后開始分組，分組前對大菱鲆饑餓處理1 d。試驗按照投喂時間分為3個組，分別于早上(06:00)、中午(12:00)、傍晚(18:00)3個不同的時間點投喂大菱鲆幼魚[初始平均體重為(8.95±0.13) g]，每組3個重復(fù)，每個重復(fù)25尾。養(yǎng)殖試驗在日照水產(chǎn)研究所深藍色的容積為200 L的養(yǎng)殖桶中進行，采用室內(nèi)靜水養(yǎng)殖。采取表觀飽食投喂，馴養(yǎng)期間每日投喂1次(18:00)，正式試驗期間按照設(shè)定的投喂時間投喂，投喂1 h后收集殘餌，稱重，計算日投喂量。養(yǎng)殖試驗過程中，日換水1次，投喂前1 h換水，換水量1/2～2/3。試驗用水為砂濾自然海水，溫度為15～18 ℃，溶氧濃度≥6.0 mg/L，鹽度在30‰左右，pH 7.5～8.0。試驗周期為45 d。試驗期間，每隔1周對大菱鲆稱重1次，根據(jù)大菱鲆體重相應(yīng)調(diào)節(jié)投飼量；稱重前停喂1 d，定期對養(yǎng)殖桶進行清理消毒處理。

1.3 樣品采集

試驗結(jié)束后取樣前，對大菱鲆幼魚進行禁食24 h處理。每個重復(fù)隨機取出2尾魚，用解剖剪將腹腔剪開，在相同位置取1 g左右肝臟，迅速放入液氮中速凍，速凍樣品于-80 ℃下保存待測；剪開顱腔，小心挑出魚腦，迅速放入液氮中速凍，速凍樣品于-80 ℃下保存待測。

1.4 生長指標(biāo)計算公式

增重率(WGR,%)=100×(Wt-W0)/W0； 特定生長率(SGR,%/d)=100×(lnWt-lnW0)/t;
攝食率(FR,%/d)=100×Wf/[t×(Wt+W0)/2]； 飼料效率(FE)=(Wt-W0)/Wf。

式中：Wt為試驗結(jié)束時大菱鲆幼魚的平均體重(g)；W0為試驗開始時大菱鲆幼魚的平均體重(g)；t為試驗天數(shù)(d)；Wf為平均投喂量(g)。

1.5 實時定量PCR檢測肝臟和腦中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量

1.5.1 總RNA的提取和cDNA的合成

采用Trizol Reagent試劑盒提取大菱鲆幼魚肝臟和腦中總RNA，利用Nanodrop 2000微量核酸測定儀檢測總RNA的濃度以及260與280 nm處吸光度(OD)值，采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測總RNA的品質(zhì)；選擇OD260 nm/OD280 nm值在1.8～2.0之間，凝膠電泳條帶分離清晰、無明顯拖帶現(xiàn)象的總RNA樣本為模板，利用Transcriptor First Stand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒，選用20 μL反應(yīng)體系合成cDNA；用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測合成的cDNA片段長度與目的基因是否相符，將得到的cDNA于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 實時熒光定量PCR

試驗采用相對熒光定量法，即2-△△Ct法對大菱鲆幼魚肝臟和腦IGF-Ⅰ mRNA表達量進行差異分析。首先，用參照基因?qū)π?zhǔn)樣本和待測樣本進行校正，由于本試驗屬于相互對照，故隨機選取1個重復(fù)作為對照樣本，對其他待測樣本進行校正；然后，對校準(zhǔn)樣本和待測樣本的△Ct歸一化處理；最后，表達差異計算2-△△Ct值。計算公式如下：

△Ct(校準(zhǔn)樣本)=Ct(對照樣本)-Ct(參照基因)；△Ct(待測樣本)=Ct(待測樣本)-Ct(參照基因);
△△Ct=△Ct(待測樣本)-△Ct(校準(zhǔn)樣本)。

參照基因選用β-肌動蛋白(β-actin)(序列號：AY008305)，目的基因為大菱鲆幼魚IGF-Ⅰ(序列號：FJ160587.1)，2個基因均根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫提供的基因序列設(shè)計引物，送交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。引物序列見表1。

試驗選用20 μL反應(yīng)體系，按FastStart Essential DNA Green Master實時熒光定量PCR試劑盒說明操作，在實時熒光定量PCR儀(Applied Biosystem 7500 Real-Time PCR System)上進行擴增和數(shù)據(jù)分析，反應(yīng)程序：95.0 ℃，10 min；95.0 ℃，10 s；58 ℃，15 s；72 ℃，20 s；40個循環(huán)。

表1 試驗所用實時熒光定量PCR引物

1.6 統(tǒng)計分析

采用SPSS 17.0軟件包對數(shù)據(jù)結(jié)果進行單因素方差分析(one-way ANOVA)，差異顯著時采用Duncan氏法進行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異顯著水平為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 投喂時間對大菱鲆幼魚生長的影響

養(yǎng)殖試驗期間無大菱鲆幼魚死亡，各組存活率均為100%。由表2可知，隨著投喂時間的推移，大菱鲆幼魚的增重率和特定生長率顯著降低(P<0.05)，其中06:00投喂組大菱鲆幼魚的增重率和特定生長率均達到最高，分別為97.23%和1.94%/d，顯著高于12:00和18:00投喂組(P<0.05)，12:00投喂組增重率和特定生長率又顯著高于18:00投喂組(P<0.05)。投喂時間對大菱鲆幼魚的攝食率沒有產(chǎn)生顯著影響(P>0.05)，3個投喂時間組的攝食率均介于1.5%/d～1.6%/d。18:00投喂組大菱鲆幼魚的飼料效率僅為0.91，顯著低于06:00和12:00投喂組(P<0.05)，06:00投喂組飼料效率略高于12:00投喂組，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 投喂時間對大菱鲆幼魚生長的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

Values in the same row with different letter superscripts are significantly different (P<0.05), while with no or the same letter superscripts not significantly different (P>0.05).

2.2 投喂時間對大菱鲆幼魚肝臟和腦中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量的影響

對反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA進行瓊脂糖凝膠電泳，試驗用Maker長度為2 000 bp，結(jié)果顯示，合成的cDNA片段長度大約為121 bp，與目的基因理論長度相符。

如圖1所示，投喂時間對大菱鲆幼魚肝臟中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量有顯著影響(P<0.05)。06:00投喂組IGF-Ⅰ mRNA相對表達量最高，其2-△△Ct值高達2.17，顯著高于其他2組(P<0.05)；18:00投喂組IGF-Ⅰ mRNA相對表達量最低，其2-△△Ct值僅有1.13，顯著低于其他2組(P<0.05)。

如圖2所示，投喂時間對大菱鲆幼魚腦中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量沒有顯著影響(P>0.05)。大菱鲆幼魚腦中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量以06:00投喂組最高，其2-△△Ct值為1.41；其次是18:00投喂組，其2-△△Ct值為1.37；12:00投喂組最低，其2-△△Ct值為1.24。

數(shù)據(jù)柱標(biāo)注不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下圖同。

Date columns with different letters are significantly different (P<0.05), while with no or the same letters are not significantly different (P>0.05). The same as below.

圖1投喂時間對大菱鲆幼魚肝臟中IGF-ⅠmRNA相對表達量的影響

Fig.1 Effects of feeding time on the relative expression level ofIGF-Ⅰ mRNA in liver of juvenile turbot (Scophthalmusmaximus)

圖2 投喂時間對大菱鲆幼魚腦中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量的影響

3 討 論

3.1 投喂時間對大菱鲆幼魚生長的影響

投喂時間往往比照養(yǎng)殖魚類的攝食節(jié)律進行選擇的，攝食節(jié)律是生物在長期進化過程中與自然環(huán)境相適應(yīng)的結(jié)果，在自然環(huán)境下，1～2齡大菱鲆主要以糠蝦和多毛類等小型甲殼動物為食，稍大個體逐漸進食小型魚類和軟體動物等，成魚則開始食魚[7]。糠蝦和多毛類幼體有明顯的趨光性，日間活動較夜間更加頻繁，出于食源的選擇，大菱鲆幼魚在日間攝食活躍。同時，大菱鲆屬冷水性魚類，水溫的升高會降低大菱鲆的運動與攝食，增加排氮[8]，減緩大菱鲆的生長。目前有很多學(xué)者證實了這種說法，常青等[9]認(rèn)為大菱鲆幼魚幾乎全天都有攝食行為，黎明時攝食活動最強。苗淑彥等[10]認(rèn)為生態(tài)習(xí)性的轉(zhuǎn)變會對攝食節(jié)律產(chǎn)生重大影響，鰈形目魚類存在漂浮生活和底棲生活2個階段，其攝食節(jié)律在2個階段表現(xiàn)出不同的特點。同時，孫國祥等[11]研究發(fā)現(xiàn)，流速、溫度以及養(yǎng)殖系統(tǒng)等也對大菱鲆的攝食節(jié)律有著顯著影響。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，在06:00、12:00、18:00這3個時間投喂的大菱鲆幼魚的攝食率沒有顯著差異，但投喂時間對飼料效率產(chǎn)生了顯著影響，06:00投喂組飼料效率顯著高于其他2組；同時，在生長上則表現(xiàn)為06:00投喂組的增重率和特定生長率顯著高于其他2組，驗證了關(guān)于大菱鲆幼魚攝食節(jié)律的說法。

根據(jù)魚類天然的生物節(jié)律、攝食周期來安排養(yǎng)殖生產(chǎn)中的投喂時間，可以提高魚類對飼料的利用率，進而提高生產(chǎn)效率。不同時間投喂的大菱鲆幼魚的攝食率沒有顯著差異，而日間(06:00、12:00)投喂組的大菱鲆幼魚的飼料效率顯著高于晚上(18:00)投喂組。類似的結(jié)果在以往研究中也有相關(guān)報道。夜間(20:00)投喂的瓦氏黃顙魚和白天(08:00)投喂的瓦氏黃顙魚在攝食率上沒有顯著差異，而夜間投喂組的飼料利用率顯著優(yōu)于白天投喂組[2]。Marinho等[12]對塞內(nèi)加爾鰨(Soleasenegalensis)幼魚的研究發(fā)現(xiàn)，與夜間投喂組相比，日間投喂組的的特定生長率和氮儲積率顯著提高，氨氮排放量顯著降低，作者認(rèn)為日間投喂組的塞內(nèi)加爾鰨可以更好地將飼料蛋白質(zhì)用于體生長。

3.2 投喂時間對大菱鲆幼魚肝臟和腦中IGF-Ⅰ基因表達的影響

本試驗結(jié)果表明，大菱鲆幼魚肝臟中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量在不同投喂組間存在顯著差異，其中06:00投喂組的肝臟中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量最高，與大菱鲆幼魚的生長狀況相適應(yīng)，推斷原因，可能是投喂時間的不同對調(diào)控相應(yīng)激素的mRNA表達產(chǎn)生的刺激存在差異，從而影響到大菱鲆幼魚循環(huán)系統(tǒng)的激素水平，進而影響到大菱鲆幼魚的生長發(fā)育以及營養(yǎng)代謝等生理生化過程。陳乃松等[13]也發(fā)現(xiàn)，大口黑鱸的營養(yǎng)狀況與其肝臟中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量呈正相關(guān)的關(guān)系。

不同投喂時間對大菱鲆幼魚腦中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量并沒有產(chǎn)生顯著影響。華益民等[14]在研究中發(fā)現(xiàn)，營養(yǎng)狀況對鯉魚幼魚肝臟以外組織中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量沒有顯著影響。對銀鮭(Oncorhynchuskisutch)的研究認(rèn)為，IGF-Ⅰ mRNA對營養(yǎng)狀況的反應(yīng)僅限于肝臟內(nèi)，在饑餓狀態(tài)下肝臟中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量下降，而在肝臟以外組織中并沒有發(fā)現(xiàn)IGF-I mRNA相對表達量的下降[15]。

4 結(jié) 論

投喂時間對大菱鲆幼魚的生長以及肝臟中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量有顯著影響，其中以06:00投喂組大菱鲆幼魚的增重率、特定生長率、飼料效率以及肝臟中IGF-Ⅰ mRNA相對表達量最高，因此，建議8 g左右大菱鲆幼魚的投喂時間為06:00。

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*Corresponding author, professor, E-mail: liangmq@ysfri.ac.cn