乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的影響

張相倫 游 偉 趙紅波 王星凌 萬發(fā)春

(山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，濟(jì)南 250100)

青貯是指以新鮮青飼料為原料，在密閉條件下，利用植物表面自然附生的乳酸菌，通過厭氧發(fā)酵，將植物表面的可溶性碳水化合物轉(zhuǎn)化為乳酸、乙酸等有機(jī)酸，降低飼料pH，抑制霉菌等腐敗微生物生長(zhǎng)繁殖，達(dá)到保持青飼料營(yíng)養(yǎng)特性的目的[1]。全株玉米青貯在反芻動(dòng)物飼料供應(yīng)中占有非常重要的地位，其由于具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、適口性好和易保存等優(yōu)點(diǎn)得到廣泛應(yīng)用，對(duì)“節(jié)糧型”及“秸稈型”畜牧業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展起到積極的推動(dòng)作用[2]。但是，在很多地區(qū)由于青貯技術(shù)不過關(guān)，加之青貯原料表面附著的乳酸菌數(shù)量不足，不能有效縮短青貯過程中的有氧呼吸階段，造成腐敗微生物滋生，營(yíng)養(yǎng)成分消耗嚴(yán)重，導(dǎo)致青貯品質(zhì)下降和飼料資源浪費(fèi)。如何生產(chǎn)高效、優(yōu)質(zhì)、安全的玉米青貯已成為行業(yè)內(nèi)高度關(guān)注的問題。近年來，關(guān)于提高青貯發(fā)酵品質(zhì)添加劑的研究主要集中在微生物制劑、酶制劑、有機(jī)酸類、糖類等。綜合前人研究表明，以乳酸菌為主的微生物制劑因具有有效抑制腐敗微生物繁殖、降低青貯營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損失、提高青貯品質(zhì)且效果較穩(wěn)定等優(yōu)勢(shì)而備受關(guān)注。乳酸菌根據(jù)其發(fā)酵產(chǎn)酸能力主要分為2類，一類是同型發(fā)酵乳酸菌，另一類是異型發(fā)酵乳酸菌。前者發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生乳酸，后者除產(chǎn)生乳酸外，還可產(chǎn)生乙酸、乙醇、二氧化碳等產(chǎn)物[2-3]。研究表明，同型發(fā)酵乳酸菌可有效提高發(fā)酵過程中青貯品質(zhì)，而異型發(fā)酵乳酸菌在提高青貯有氧穩(wěn)定性中具有重要作用[4-6]。目前，關(guān)于利用乳酸菌制劑改善青貯飼料品質(zhì)的研究多集中于單一菌種的添加，且研究表明2種類型的乳酸菌在提高青貯飼料品質(zhì)方面均表現(xiàn)出各自的優(yōu)勢(shì)，而利用同型和異型發(fā)酵乳酸菌協(xié)同作用于青貯飼料的研究還相對(duì)較少。另外，由于受使用環(huán)境[7]、添加劑量[8]等方面的影響，導(dǎo)致部分已有研究結(jié)果仍存在差異，需進(jìn)一步探討。因此，本研究以山東省2016年9月收獲的全株玉米為研究對(duì)象，采用同型和異型發(fā)酵乳酸菌復(fù)合制劑，探討不同劑量復(fù)合乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)成分的影響，以期為乳酸菌制劑的推廣應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為山東省2016年9月刈割新鮮全株玉米，營(yíng)養(yǎng)成分含量[干物質(zhì)(DM)基礎(chǔ)]：有機(jī)物(OM)86.84%，粗蛋白質(zhì)(CP)8.27%，中性洗滌纖維(NDF)55.95%，酸性洗滌纖維(ADF)26.03%。青貯袋(75 cm×40 cm×8 cm)分內(nèi)外2層，外層為聚丙烯材料，內(nèi)層為聚乙烯材料。乳酸菌制劑(11GFT,加拿大Pioneer Hi-Bred公司)，每克產(chǎn)品含有1.1×1011CFU乳酸菌，包括布氏乳桿菌和干酪乳桿菌2種。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取籽粒處于蠟熟期的新鮮全株玉米720 kg，品種為登海605，外觀呈綠色，含水量為73.67%，切短至1～4 cm，平均分為4組，每組12個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15 kg。對(duì)照組每個(gè)重復(fù)噴霧添加45 mL去離子水，試驗(yàn)組分別噴霧添加2、10和20 mg/kg的乳酸菌制劑(預(yù)先稀釋于45 mL去離子水中)，分別混合均勻。然后將全株玉米青貯快速裝填并壓實(shí)于青貯袋中，置于室溫條件下密封保存，試驗(yàn)期60 d。

1.3 樣品采集及指標(biāo)測(cè)定

于第45和60天分別開袋取樣，每組取樣6個(gè)重復(fù)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.3.1 感官評(píng)價(jià)指標(biāo)

按照德國農(nóng)業(yè)協(xié)會(huì)(DLG)青貯質(zhì)量感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)定[9]，根據(jù)青貯的氣味(14分)、結(jié)構(gòu)(4分)、色澤(2分)進(jìn)行評(píng)分。綜合3項(xiàng)得分，評(píng)定為優(yōu)(16～20分)、可(10～15分)、中(5～9分)、下(0～4分)4個(gè)等級(jí)。

1.3.2 微生物數(shù)量

取新鮮樣本30 g，加入到盛有270 mL生理鹽水的塑料袋或樣品瓶中，充分?jǐn)嚢韬髮⒋巳芤合♂?0～107倍數(shù)。微生物數(shù)量測(cè)定采用平板計(jì)數(shù)法，乳酸菌用MRS瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱取64.25 g MRS培養(yǎng)基于1 L蒸餾水中，加熱煮沸溶解后置于121 ℃高壓滅菌15 min，傾注平板備用。取100 μL不同濃度的接種液分別接種于平板上，涂勻后置于厭氧培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)2 d，分別對(duì)平板上的乳酸菌進(jìn)行計(jì)數(shù)。霉菌采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行計(jì)數(shù)，稱取40.1 g馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基于1 L蒸餾水中，加熱煮沸溶解后置于121 ℃高壓滅菌20 min，傾注平板后備用。取100 μL不同濃度的接種液分別接種于平板上，涂勻后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4 d分別進(jìn)行計(jì)數(shù)(每個(gè)平板上菌落數(shù)控制在30～300個(gè)之間為有效)。

1.3.3 pH測(cè)定

取10 g新鮮樣本，加入90 mL去離子水，4 ℃浸提24 h，采用pH計(jì)(HI9025,意大利Hanna Instruments公司)測(cè)定濾液pH。

1.3.4 有機(jī)酸及氨態(tài)氮含量測(cè)定

取35 g新鮮樣本，放入100 mL的廣口三角瓶中，加入70 mL去離子水，4 ℃浸提24 h，然后通過2層紗布和定性濾紙過濾，所得的液體為青貯浸提液，置于-20 ℃條件下保存待測(cè)。濾液用來測(cè)定乳酸(LA)、揮發(fā)性脂肪酸(VFA)和氨態(tài)氮(NH3-N)含量。乳酸含量采用對(duì)羥基聯(lián)苯法測(cè)定[10]，以乳酸鈣為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算乳酸含量，結(jié)果以g/kg DM計(jì)。揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量采用高效氣相色譜儀(GC-2010，日本島津公司)進(jìn)行測(cè)定[11]，包括乙酸、丙酸和丁酸含量，結(jié)果以g/kg DM計(jì)。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測(cè)定[12]，以氯化銨為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算氨態(tài)氮含量，結(jié)果以g/kg TN(總氮)計(jì)。

1.3.5 化學(xué)成分測(cè)定

取新鮮全株玉米青貯制備風(fēng)干樣本，按照AOAC(2015)[13]中的方法測(cè)定OM、CP、NDF及ADF含量。水溶性碳水化合物(water-soluble carbohydrate,WSC)含量采用蒽酮硫酸比色法測(cè)定[14]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算WSC含量，結(jié)果以g/kg DM計(jì)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2007初步整理后，采用SPSS 16.0軟件中的單因素方差分析(one-way ANOVA)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan氏多重比較檢驗(yàn)，結(jié)果以平均值(mean)和均方根誤差(SEM)表示，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

由表1可見，各組全株玉米青貯氣味、結(jié)構(gòu)、色澤及綜合評(píng)分均無顯著差異(P>0.05)。

表1 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯感官評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)無字母或相同字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Values in same row with no letter or the same letter superscripts mean no significant difference (P>0.05), while with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05). The same as below.

2.2 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯微生物數(shù)量的影響

由表2可見，與對(duì)照組相比，2、10和20 mg/kg組45 d的乳酸菌數(shù)量分別提高了24.54%、25.96%和25.11%，差異均顯著(P<0.05)，霉菌數(shù)量分別降低了10.09%(P>0.05)、20.00%(P<0.05)和14.13%(P>0.05)；2、10和20 mg/kg組60 d的乳酸菌數(shù)量分別提高17.44%、20.93%和20.54%，差異均顯著(P<0.05)，霉菌數(shù)量分別降低31.01%、29.65%和28.29%，差異均顯著(P<0.05)。

表2 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯微生物數(shù)量的影響

2.3 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯pH及有機(jī)酸含量的影響

由表3可見，45和60 d，各組的pH均無顯著差異(P>0.05)。45 d，2、10和20 mg/kg組的乳酸含量較對(duì)照組分別提高10.63%、7.90%和8.05%，差異均顯著(P<0.05)，乙酸含量分別提高了364.10%、288.76%和285.40%，差異均顯著(P<0.05)，而丁酸含量分別降低17.72%、15.19%和11.39%，差異均顯著(P<0.05)。60 d，與對(duì)照組相比，2及10 mg/kg組乙酸含量分別提高767.17%和171.73%，差異顯著(P<0.05)，各組其他指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。

表3 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯pH及有機(jī)酸含量的影響

2.4 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯化學(xué)成分的影響

由表4可見，45 d，與對(duì)照組相比，2和20 mg/kg組CP含量提高了7.70%和11.85%，差異顯著(P<0.05)，2 mg/kg組NDF含量提高了15.90%，差異顯著(P<0.05)，2、10和20 mg/kg組氨態(tài)氮含量分別顯著降低了15.44%、21.87%和18.60%(P<0.05)。60 d，20 mg/kg組WSC含量較對(duì)照組降低了33.14%，差異顯著(P<0.05)，其他指標(biāo)間無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

3.1 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯品質(zhì)的影響

青貯的基本原理是利用好氣性微生物和植物細(xì)胞本身的呼吸作用使青貯窖內(nèi)盡快形成厭氧環(huán)境，然后在密閉厭氧條件下利用乳酸菌的活動(dòng)，產(chǎn)生乳酸，抑制其他腐敗微生物的活動(dòng)，達(dá)到飼料長(zhǎng)期保存及使用的目的[15]，一般包括好氧細(xì)菌活動(dòng)階段，乳酸菌發(fā)酵階段和發(fā)酵穩(wěn)定階段等[16]。本研究表明，各組全株玉米青貯感官評(píng)價(jià)綜合評(píng)分均在16～20分，達(dá)到優(yōu)級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，說明各組青貯效果均較好。微生物數(shù)量方面，添加乳酸菌制劑組的乳酸菌數(shù)量顯著提高，霉菌數(shù)量均有不同程度降低，這與前人研究結(jié)果類似[17-18]，說明添加乳酸菌制劑可以促使乳酸菌成為青貯過程中的優(yōu)勢(shì)菌群，縮短好氧細(xì)菌活動(dòng)階段，對(duì)霉菌等有害微生物產(chǎn)生抑制作用[17]。有機(jī)酸含量分析結(jié)果表明，添加乳酸菌制劑可提高發(fā)酵45 d乳酸含量，表明添加乳酸菌制劑可以提高青貯早期乳酸生成量，改善青貯品質(zhì)。但各組發(fā)酵60 d乳酸含量無顯著差異，且60 d乳酸含量較45 d降低。分析原因?yàn)楸驹囼?yàn)采用的乳酸菌制劑為布氏乳桿菌和干酪乳桿菌混合劑，其中布氏乳桿菌屬異型發(fā)酵乳酸菌，能分解乳酸產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸如乙酸等。Kung等[19]將3種劑量(1×105、5×105、1×106CFU/g)布氏乳桿菌接種于紫花苜蓿中發(fā)酵56 d，結(jié)果表明乳酸含量不同程度降低，乙酸含量升高。呂文龍等[20]將布氏乳桿菌接種于青玉米秸進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)低劑量布氏乳桿菌可以一定程度上提高乳酸生成量，但隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)及劑量的提高，乳酸含量顯著降低，乙酸含量顯著升高。干酪乳桿菌屬乳桿菌屬，兼性異型發(fā)酵乳糖。Nishino等[4]報(bào)道，將干酪乳桿菌接種于全株玉米(2×106CFU/g)和全混合日糧(3×106CFU/g)發(fā)酵60 d后，乳酸含量提高，乙酸含量顯著降低。隨后，Nishino等[5]在羊茅草、全株玉米及全混合日糧中分別接種干酪乳桿菌，發(fā)酵60 d，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)乳酸含量提高，乙酸含量降低。表明干酪乳桿菌可以提高青貯乳酸生成量、降低乙酸生成量。因此，本研究觀測(cè)到的45 d試驗(yàn)組乳酸含量的升高可能與干酪乳桿菌的早期定植并發(fā)酵產(chǎn)生乳酸有關(guān)。但隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，布氏乳桿菌可在后期大量繁殖[21]，可能利用了干酪乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸，導(dǎo)致60 d乳酸含量較45 d降低。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組乙酸含量較對(duì)照組有不同程度提高，且隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乙酸含量繼續(xù)升高。據(jù)報(bào)道，布氏乳桿菌在發(fā)酵過程中能將乳酸分解成乙酸和丙二醇，而相對(duì)乳酸而言，乙酸等揮發(fā)性脂肪酸是一種更有效的抗真菌及霉菌的酸類物質(zhì)，因此更有利于提高青貯的有氧穩(wěn)定性。綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的乳酸、乙酸含量的變化可能是布氏乳桿菌和干酪乳桿菌共同作用的結(jié)果。丁酸是由腐敗菌和酪酸菌分別分解蛋白質(zhì)、葡萄糖和乳酸而生成的產(chǎn)物，其含量的高低反映青貯飼料品質(zhì)的優(yōu)劣，丁酸含量越多，青貯品質(zhì)越差[7,22]。本研究發(fā)現(xiàn)添加乳酸菌制劑可以降低45 d青貯的丁酸含量，這與霉菌等腐敗菌數(shù)量的降低相符合。

表4 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯化學(xué)成分的影響

3.2 乳酸菌制劑對(duì)全株玉米青貯營(yíng)養(yǎng)成分的影響

全株玉米青貯的營(yíng)養(yǎng)成分是評(píng)價(jià)青貯質(zhì)量好壞的另一項(xiàng)重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，添加乳酸菌制劑可以一定程度上提高全株玉米青貯的CP含量，降低其中氨態(tài)氮的比例。青貯飼料中氨態(tài)氮主要由植物酶對(duì)蛋白質(zhì)的降解和微生物分解利用蛋白質(zhì)和氨基酸產(chǎn)生，總氮中氨態(tài)氮含量反映了青貯飼料蛋白質(zhì)降解的程度[23-24]。Nishino等[5]將布氏乳桿菌、干酪乳桿菌分別接種于羊茅草和全混合日糧中進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果表明氨態(tài)氮含量均顯著降低。Li等[25]報(bào)道，在玉米秸稈中接種復(fù)合乳酸菌制劑發(fā)酵150 d后，總氮中氨態(tài)氮含量較對(duì)照組顯著降低，CP含量顯著提高。上述試驗(yàn)結(jié)果均與本研究類似，推測(cè)乳酸菌可能通過降低全株玉米在儲(chǔ)存過程中蛋白質(zhì)的降解作用或抑制腐敗微生物的分解作用，從而降低總氮中氨態(tài)氮含量，間接提高CP含量，提高了其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。此外，研究還發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組NDF含量不同程度升高，WSC含量降低，這與Addah等[22]的研究結(jié)果類似。玉米秸稈中含有較為豐富的WSC，為乳酸菌的定植提供了豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，因此乳酸菌的加入可能利用了秸稈中的WSC，使得細(xì)胞壁中難以降解的碳水化合物如NDF等組分有所升高[2]。綜合各營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管試驗(yàn)組CP含量較對(duì)照組提高，但各組OM含量差異并不顯著，說明試驗(yàn)組全株玉米青貯的無氮化合物含量存在一定程度降低，這可能與乳酸菌利用了全株玉米青貯的可溶性碳水化合物等營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖有關(guān)，乳酸菌的生長(zhǎng)抑制了因腐敗微生物作用引起的蛋白質(zhì)的降解，從而使青貯品質(zhì)維持在較高水平。這也與本研究觀測(cè)到的發(fā)酵60 d全株玉米青貯的OM和WSC含量較45 d降低，而CP含量基本不變的結(jié)果相吻合。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，添加乳酸菌制劑可以改善全株玉米青貯品質(zhì)，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。以青貯發(fā)酵過程中霉菌數(shù)量最低為依據(jù)，推薦乳酸菌制劑的添加量為10 mg/kg。

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*Contributed equally

**Corresponding author, professor, E-mail： wanfc@sina.com