干酪乳桿菌對(duì)北京黑豬保育階段生長(zhǎng)性能及腸道菌群的影響

王四新 季海峰* 石國(guó)華 劉 輝 王紅衛(wèi) 張董燕 王 晶 張 偉 王雅民

(1.北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，北京 100097；2.北京黑六牧業(yè)科技有限公司，北京 102211)

隨著科技發(fā)展和社會(huì)進(jìn)步，養(yǎng)殖業(yè)中飼用抗生素將逐漸被禁用，尋求抗生素替代品和替代技術(shù)備受關(guān)注。益生菌能夠改善腸道菌群平衡，產(chǎn)生益生性物質(zhì)，促進(jìn)動(dòng)物健康，提高生產(chǎn)性能，被人們寄予了厚望。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)是益生菌的一種，農(nóng)業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》(2013)允許其在養(yǎng)殖動(dòng)物中添加使用。縣怡涵等[1]、張魏偉等[2]和王齊桓等[3]給仔豬(大×長(zhǎng)和杜×長(zhǎng)×大)飼喂含干酪乳桿菌的飼糧后發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了仔豬腸道絨毛及黏膜上皮細(xì)胞發(fā)育，提高了仔豬采食量和日增重，降低了料重比。有關(guān)益生菌和抗生素對(duì)仔豬腸道菌群的影響，Zhang等[4]給仔豬(長(zhǎng)×大)口服羅伊氏乳桿菌制劑或金霉素后發(fā)現(xiàn)，與金霉素組相比，羅伊氏乳桿菌組仔豬空腸內(nèi)的菌群ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)變大，菌群豐富度增加；Looft等[5]在仔豬飼糧中添加抗生素后發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)容物中變形菌門(mén)的相對(duì)含量增加。然而，Poole等[6]在仔豬(杜×大)飼糧添加中低劑量(50 g/t)金霉素后沒(méi)有發(fā)現(xiàn)仔豬糞便菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生顯著變化；Li等[7]在仔豬(杜×長(zhǎng)×大)飼糧中用糞腸球菌替代抗生素，發(fā)現(xiàn)豬腸道菌群變化規(guī)律與添加抗生素類(lèi)似。對(duì)于不同豬種的腸道(糞便)菌群差異，楊柳等[8]、肖文萍[9]、楊麗娜[10]和楊偉平[11]分別研究了長(zhǎng)白豬、大白豬和杜洛克豬以及藏豬、榮昌豬、巴馬豬、二花臉和梅山豬的腸道(糞便)菌群情況，發(fā)現(xiàn)不同品種豬的糞樣菌群種/屬及數(shù)量存在較大差異，國(guó)內(nèi)品種比國(guó)外瘦肉型品種的腸道(糞便)菌群多樣性更豐富。北京黑豬是我國(guó)自主培育的特色品種，與引進(jìn)品種杜洛克、長(zhǎng)白豬、大白豬或其雜交豬相比，具有肉質(zhì)好、耐粗飼和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)，越來(lái)越受到民眾的歡迎。目前，有關(guān)干酪乳菌對(duì)北京黑豬的應(yīng)用研究尚未見(jiàn)報(bào)道。開(kāi)展干酪乳桿菌對(duì)北京黑豬保育階段生長(zhǎng)性能和腸道菌群的研究，將會(huì)為北京黑豬的科學(xué)養(yǎng)殖和綠色發(fā)展提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

干酪乳桿菌活菌凍干制劑(活菌數(shù)2.0×1010CFU/g)，由北京市農(nóng)林科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所制備。15%金霉素預(yù)混劑購(gòu)自金河集團(tuán)。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物分組與飼養(yǎng)管理

選用北京黑豬保育階段豬120頭，(35±2)日齡、體重為(7.53±0.21) kg，隨機(jī)分成3組，分別為對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組，每組4欄(重復(fù))，每欄10頭。對(duì)照組試驗(yàn)豬飼喂基礎(chǔ)飼糧(不添加干酪乳桿菌和金霉素)；干酪乳桿菌組試驗(yàn)豬飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加干酪乳桿菌活菌凍干制劑的飼料，每千克飼料中有效活菌數(shù)在4.0×109CFU；金霉素組試驗(yàn)豬飼喂在基礎(chǔ)飼糧中添加金霉素預(yù)混劑的飼料，每千克飼料含金霉素75 mg。基礎(chǔ)飼糧的組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

試驗(yàn)在同一保育豬舍進(jìn)行，實(shí)行高床分欄飼養(yǎng)，自由采食，自由飲水，舍內(nèi)溫度24～28 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，豬群飼養(yǎng)管理按場(chǎng)內(nèi)統(tǒng)一技術(shù)規(guī)程進(jìn)行，試驗(yàn)期為30 d。

1.3 生長(zhǎng)性能測(cè)定

分別在試驗(yàn)開(kāi)始和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)空腹稱(chēng)重，記錄每天消耗飼糧情況，計(jì)算平均日增重、平均日采食量和料重比。

1.4 糞樣采集與總DNA提取、16S rRNA測(cè)序

糞樣采集：在試驗(yàn)的第28天清晨飼喂前采集糞樣，每欄采集2頭份，每組采集8頭份，共采集糞樣24頭份。用無(wú)菌不銹鋼勺采集豬自然排出的糞便，每頭采集新鮮糞便20 g于無(wú)菌管中，置于干冰中，帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于-80 ℃冰箱，用于提取總DNA。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

1)預(yù)混料為每千克飼糧提供The premix provides the following per kilogram of the diet：Cu (as copper sulfate) 150 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 150 mg，Zn (as zinc sulfate) 140 mg，Mn(as manganese sulfate) 40 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg，I (as potassium iodide) 0.6 mg，VA 8 000 IU，VD31 800 IU，VE 24 IU，VK 1.8 mg，VB11.6 mg，VB26 mg，VB63.2 mg，VB120.05 mg，生物素 biotin 0.3 mg，葉酸 folic acid 1.2 mg，煙酸 nicotinic acid 24 mg，泛酸 pantothenic acid 18 mg，氯化膽堿 choline chloride 0.4 g，L-賴(lài)氨酸鹽L-lysine salt 2.2 g，蘇氨酸鹽 threonine salt 0.4 g，鈣 calcium 5 g，總磷 total phosphorus 3 g。

2)水分、粗蛋白質(zhì)、鈣和總磷為實(shí)測(cè)值。Moisture, CP, Ca and TP are measured values.

總DNA提取：用TIANamp微生物DNA Kit[天根生化科技(北京)有限公司]提取豬糞便中細(xì)菌總DNA，具體提取步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用DNA純化試劑盒對(duì)提取的總DNA進(jìn)行純化，用原子分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)總DNA濃度和純度，然后置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

16S rRNA基因擴(kuò)增及測(cè)序：以北京黑豬保育階段豬糞便細(xì)菌總DNA為模板，PCR擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的V3～V4區(qū)。擴(kuò)增體系：4 μL的5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol/L dNTPs，各0.8 μL的上、下游引物(5 μmol/L)，0.4 μL的FastPfu DNA Polymerase，10 ng的DNA模板，最終體積20 μL。采用細(xì)菌通用引物：338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃變性3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，進(jìn)行27個(gè)循環(huán)；72 ℃，延伸10 min。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒(Axygen公司)切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。參照電泳初步定量結(jié)果，將PCR產(chǎn)物使用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進(jìn)行檢測(cè)定量，之后按照每個(gè)樣本的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合；在Illumina Miseq平臺(tái)進(jìn)行PE250測(cè)序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

過(guò)濾read尾部質(zhì)量值20以下的堿基，設(shè)置50 bp的窗口，如果窗口內(nèi)的平均質(zhì)量值低于20，從窗口開(kāi)始截去后端堿基，過(guò)濾質(zhì)控后50 bp以下的reads；根據(jù)PE reads之間的overlap關(guān)系，將成對(duì)reads拼接(merge)成一條序列，最小overlap長(zhǎng)度為10 bp；拼接序列的overlap區(qū)允許的最大錯(cuò)配比率為0.2，篩選不符合序列；根據(jù)序列首尾兩端的barcode和引物區(qū)分樣品，并調(diào)整序列方向，barcode允許的錯(cuò)配數(shù)為0，最大引物錯(cuò)配數(shù)為2。按照97%相似性對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行操作分類(lèi)單元(OTU)聚類(lèi)，在聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到OTU的代表序列，將所有優(yōu)化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。為了得到每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的物種分類(lèi)信息，采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)學(xué)分析，并在各個(gè)水平統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的菌群組成。

生長(zhǎng)性能數(shù)據(jù)結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)處理與分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件中的ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，以P<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長(zhǎng)性能情況

由表2可知，在北京黑豬保育階段飼糧中添加干酪乳桿菌和金霉素均能提高平均日增重、降低料重比。與對(duì)照組相比，干酪乳桿菌組和金霉素組的平均日增重分別提高了12.71%(P<0.05)和8.58%(P<0.05)，料重比分別降低了7.34%(P<0.05)和4.52%(P>0.05)。與金霉素組相比，干酪乳桿菌組的平均日增重和料重比都有所改善，但差異不顯著(P>0.05)。

表2 干酪乳桿菌對(duì)北京黑豬保育階段生長(zhǎng)性能的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05).

2.2 腸道菌群情況

2.2.1 序列及OTU統(tǒng)計(jì)

對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組共采集鮮糞樣24個(gè)，對(duì)其分析后共獲得了1 439 917條高質(zhì)量序列，有效長(zhǎng)度為634 742 973 bp，平均長(zhǎng)度為440.82 bp。對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組的序列數(shù)分別為467 327、488 949和483 641，長(zhǎng)度分別為206 235 445、215 290 320和213 217 208 bp。

按照97%相似性，對(duì)非重復(fù)序列(不含單序列)進(jìn)行OTU聚類(lèi)，聚類(lèi)過(guò)程中去除嵌合體，得到所有24個(gè)糞樣OTU的代表序列871 056、OTU數(shù)14 390，對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組糞樣的OTU數(shù)分別為4 782、4 920和4 688。由圖1可知，對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組共有的OTU數(shù)為823，對(duì)照組獨(dú)有的OTU數(shù)為5，干酪乳桿菌組獨(dú)有的OTU數(shù)為29，金霉素組獨(dú)有的OTU數(shù)為3。

C：對(duì)照組；L：干酪乳桿菌組；A：金霉素組。下圖同。

C: control group; L:Lactobacilluscaseigroup; A: chlortetracycline group. The same as below.

圖13組糞樣OTU維恩圖

Fig.1 The OTU Venn diagram of fecal samples among three groups

2.2.2 腸道菌群多樣性

由表3可知，對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組糞樣的測(cè)序覆蓋率在99.68%～99.72%。3組糞

樣中，對(duì)照組的ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)最低；干酪乳桿菌組的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)都是最高；金霉素組的Simpson指數(shù)最高，Shannon指數(shù)最低。通過(guò)對(duì)3組糞樣中ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)比較，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌組的腸道菌群豐富度和多樣性高于對(duì)照組和金霉素組。

2.2.3 腸道菌群組成

在門(mén)分類(lèi)水平上，菌群組成情況見(jiàn)圖2和圖3。3組糞樣中總共有17個(gè)菌門(mén)，其中擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和螺旋體門(mén)(Spirochaetae)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，它們的相對(duì)豐度在99.02%～99.07%。3組糞樣中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度有差異，其中金霉素組的擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度為51.28%，厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和螺旋體門(mén)的相對(duì)豐度分別為44.94%、2.38%和0.43%；干酪乳桿菌組和對(duì)照組的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度相近，它們的擬桿菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)和螺旋體門(mén)相對(duì)豐度分別為47.30%和47.30%、47.89%和46.86%、3.01%和3.89%、0.82%和1.02%。另外，干酪乳桿菌組獨(dú)有疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)，其相對(duì)豐度為0.000 69%。

表3 3組糞樣的菌群多樣性指數(shù)

在屬分類(lèi)水平上，菌群組成情況見(jiàn)圖4和圖5。3組糞樣中總共有206個(gè)菌屬，對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組糞樣分別含有198、200和197個(gè)菌屬，相對(duì)豐度大于1%的菌屬有30個(gè)，總相對(duì)豐度在83.28%～86.02%。3組糞樣中的菌屬相對(duì)豐度不同，金霉素組中普氏菌屬9(Prevotella_9)的相對(duì)豐度較高，為27.90%，干酪乳桿菌組和對(duì)照組的相近，分別為19.87%和20.27%；金霉素組中普雷沃氏菌科NK3B31群(Prevotellaceae_NK3B31_group)的相對(duì)豐度(5.12%)低于干酪乳桿菌組和對(duì)照組(分別為7.31%和7.22%)。另外，在對(duì)照組中，鏈球菌屬(Streptococcus)和不可培養(yǎng)韋榮球菌科(Veillonellaceae_uncultured)的相對(duì)豐度較高，分別為5.31%和3.94%；在金霉素組中，巨型球菌屬(Megasphaera)和乳酸桿菌屬(Lactobacillus)的相對(duì)豐度較高，分別為6.47%和3.16%；在干酪乳桿菌組，未分類(lèi)毛螺旋菌科(Lachnospiraceae_unclassified)和厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)的相對(duì)豐度較高，分別為5.76%和3.49%。

Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Spirochaetae：螺旋體門(mén)；Others：其他。

圖2門(mén)水平上的優(yōu)勢(shì)菌群分布

Fig.2 Distribution of dominant flora at phylum level

2.2.4 相似性分析

通過(guò)對(duì)3組糞樣門(mén)水平上聚類(lèi)樹(shù)圖分析，3組糞樣中菌群組成和相對(duì)豐度有所不同，見(jiàn)圖6。與對(duì)照組和干酪乳桿菌組相比，金霉素組糞樣中擬桿菌門(mén)相對(duì)豐度較高，厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)相對(duì)豐度較低，對(duì)照組與干酪乳桿菌組的糞樣中菌群組成和相對(duì)豐度較接近。

3 討 論

3.1 干酪乳桿菌對(duì)北京黑豬保育階段生長(zhǎng)性能的影響

益生菌能夠增強(qiáng)腸道屏障功能，增加小腸絨毛高度，增大小腸的吸收面積，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收和健康生長(zhǎng)?？h怡涵等[1]、張魏偉等[2]和王齊桓等[3]的研究均表明干酪乳桿菌能夠顯著提高斷奶仔豬小腸的絨毛高度，增加絨毛高度與腸隱窩深度的比值(V/C值)，增加肌層厚度及增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)含量，能有效維護(hù)斷奶仔豬腸道健康，減輕大腸桿菌對(duì)腸黏膜結(jié)構(gòu)的損害，促進(jìn)腸道的發(fā)育，提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能和飼料利用效率。本研究在北京黑豬保育階段飼糧中分別添加干酪乳桿菌制劑和金霉素，發(fā)現(xiàn)干酪乳桿菌和金霉素均可提高仔豬的生長(zhǎng)性能，干酪乳桿菌組的平均日增重比對(duì)照組提高了12.71%，料重比降低了7.34%；金霉素組的平均日增重比對(duì)照組提高了8.58%，料重比降低了4.52%；干酪乳桿菌組與金霉素組相比，平均日增重和料重比也有所改善，但差異不顯著。本研究結(jié)果表明，北京黑豬保育階段飼糧中添加干酪乳桿菌制劑可以顯著提高仔豬的平均日增重，顯著降低料重比，這與縣怡涵等[1]給仔豬(大×長(zhǎng))飼喂干酪乳桿菌的效果基本一致，這也表明在豬保育階段飼糧中適當(dāng)添加干酪乳桿菌，不管是對(duì)國(guó)外引進(jìn)豬種，還是國(guó)內(nèi)培育豬種，均有助于維持腸道健康，提高仔豬生長(zhǎng)性能。

3.2 干酪乳桿菌對(duì)北京黑豬保育階段腸道菌群的影響

動(dòng)物腸道中棲息著數(shù)量龐大且復(fù)雜多樣的菌群，菌群與宿主之間存在著互利共生關(guān)系，宿主為菌群提供棲息地和營(yíng)養(yǎng)，菌群協(xié)助宿主新陳代謝，腸道菌群對(duì)宿主營(yíng)養(yǎng)消化和健康起著重要作用[12-14]。研究人員常常通過(guò)新鮮糞樣中菌群的變化了解腸道內(nèi)菌群的情況，在菌群多樣性分析過(guò)程中，Coverage指數(shù)值越高，則樣本中序列被測(cè)出的概率越高；ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)值越大，說(shuō)明群落豐富度和多樣性越高；Simpson指數(shù)值越大，說(shuō)明群落多樣性越低。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)北京黑豬保育階段24個(gè)鮮糞樣進(jìn)行了測(cè)序，測(cè)序覆蓋率在99.68%～99.72%，并獲得了1 439 917條高質(zhì)量序列和14 390個(gè)OTU，利用維恩圖對(duì)3組糞樣進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組、干酪乳桿菌組和金霉素組共有的OTU數(shù)為823個(gè)，干酪乳桿菌組獨(dú)有的OTU數(shù)最多(29個(gè))，金霉素組獨(dú)有的OTU數(shù)最少(3個(gè))。對(duì)菌群進(jìn)行多樣性分析發(fā)現(xiàn)，干酪乳桿菌組糞樣的ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于對(duì)照組和金霉素組，表明干酪乳桿菌組的糞樣菌群豐富度和多樣性均高于對(duì)照組和金霉素組；而金霉素組的Simpson指數(shù)最高，表明金霉素組糞樣中的菌群多樣性是3組糞樣中最低的。本研究結(jié)果說(shuō)明，北京黑豬保育階段飼糧中添加干酪乳桿菌可以增加腸道菌群的豐富度和多樣性，而添加金霉素降低腸道菌群的多樣性。Zhang等[4]研究了羅伊氏乳桿菌和金霉素對(duì)仔豬腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性的影響，與金霉素組比較，羅伊氏乳桿菌組的空腸菌群ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)增大，空腸菌群豐富度增加，這與本研究結(jié)果相一致。而Li等[7]在仔豬飼糧中用糞腸球菌代替抗生素，發(fā)現(xiàn)腸道菌群變化和添加抗生素時(shí)類(lèi)似，其菌群豐富度和多樣性均低于對(duì)照組。可見(jiàn)，不同微生物菌種對(duì)腸道菌群的影響效果是有差異的。

Spirochaetae：螺旋體門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)；Tenericutes：軟壁菌門(mén)；Cyanobacteria：藍(lán)細(xì)菌；Actinobacteria：放線(xiàn)菌門(mén)；Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)； Synergistetes：互養(yǎng)菌門(mén)；Bacteria_unclassified：未分類(lèi)細(xì)菌；Lentisphaerae：黏膠球形菌門(mén)；Fibrobacteres：纖維桿菌門(mén)；Fusobacteria：梭桿菌門(mén)；Chlamydiae：衣原體門(mén)；Verrucomicrobia：疣微菌門(mén)。

圖3菌群在門(mén)水平上的熱圖

Fig.3 Heatmap of microbiota at phylum level

Prevotella_9：普氏菌屬9；Prevotellaceae_NK3B31_group：普雷沃氏菌科NK3B31群；Megasphaera：巨型球菌屬；Lachnospiraceae_unclassified：未分類(lèi)毛螺旋菌科；Streptococcus：鏈球菌屬；Anaerovibrio：厭氧弧菌屬；Prevotella_2：普氏菌屬2；Prevotella_1：普氏菌屬1；Prevotellaceae_uncultured：不可培養(yǎng)普雷沃氏菌科；Veillonellaceae_uncultured：不可培養(yǎng)韋榮球菌科；Lactobacillus：乳桿菌屬；Alloprevotella：擬普雷沃菌屬；Ruminococcaceae_UCG-002：瘤胃菌科UCG-002；Prevotellaceae_unclassified：未分類(lèi)普雷沃氏菌科；Succinivibrio：琥珀酸弧菌屬；Ruminococcaceae_UCG-005：瘤胃菌科UCG-005；Selenomonas：月形單胞菌屬；Prevotella_7：普氏菌屬7；Ruminococcaceae_UCG-014：瘤胃菌科UCG-014；Phascolarctobacterium：考拉桿菌屬；Prevotellaceae_UCG-003：普雷沃氏菌科UCG-003；Ruminococcaceae_NK4A214_group：瘤胃菌科NK4A214群；Dialister：小類(lèi)桿菌屬；Mitsuokella：光崗菌屬；Others：其他。圖5同 The same as Fig.5。

圖4屬水平上的優(yōu)勢(shì)菌群分布

Fig.4 Distribution of dominant flora at genus level

圖5 菌群在屬水平上的熱圖

Bacteroidetes：擬桿菌門(mén)；Firmicutes：厚壁菌門(mén)；Proteobacteria：變形菌門(mén)； Others：其他。

圖6門(mén)水平上的菌群組成聚類(lèi)樹(shù)圖

Fig.6 Microbiota community barplot with cluster tree at phylum level

國(guó)內(nèi)外多位學(xué)者探討了在飼糧中添加抗生素和益生菌對(duì)腸道菌群的影響，Kim等[15]在飼糧中添加泰樂(lè)菌素后發(fā)現(xiàn)可引起腸道內(nèi)微生物種群的變化，特別是乳酸桿菌屬、Sporacetigenium、Acetanaerobacterium和Eggerthella，比未添加組的檢測(cè)頻率高。Looft等[5]探討了抗生素(金霉素、磺胺甲嘧啶和青霉素)對(duì)豬腸道菌群的影響，發(fā)現(xiàn)抗生素處理14 d后，與未處理組豬只相比，變形菌門(mén)相對(duì)含量增加1%～11%。而Poole等[6]在飼糧中添加金霉素，飼喂4周低劑量(50 g/t)的金霉素后發(fā)現(xiàn)其對(duì)仔豬(杜×大)腸道菌群結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響。Li等[7]以仔豬(杜×長(zhǎng)×大)為對(duì)象，研究了飼糧中添加糞腸球菌代替抗生素的情況，發(fā)現(xiàn)豬腸道菌群變化規(guī)律與添加抗生素組類(lèi)似。本研究發(fā)現(xiàn)，在北京黑豬保育階段糞樣中，厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)是優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，普氏菌屬和普雷沃氏菌科是優(yōu)勢(shì)菌屬，這與Pajarillo等[16-17]、Kim等[18]和Zhao等[19]對(duì)杜洛克豬、長(zhǎng)白豬和大白豬生長(zhǎng)育肥階段的糞便菌群的研究結(jié)果類(lèi)似。3組糞樣中菌群組成及相對(duì)豐度是有差異的，干酪乳桿菌組獨(dú)有疣微菌門(mén)；金霉素組的擬桿菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、纖維桿菌門(mén)、黏膠球形菌門(mén)和Saccharibacteria相對(duì)豐度比對(duì)照組和干酪乳桿菌組高，而厚壁菌門(mén)、變形菌門(mén)、螺旋體門(mén)和梭桿菌門(mén)的相對(duì)豐度低于其他2組；對(duì)照組糞樣中鏈球菌屬的相對(duì)豐度高于干酪乳桿菌組和金霉素組，說(shuō)明飼糧中添加干酪乳桿菌或金霉素可以降低糞便中鏈球菌的數(shù)量；另外，研究發(fā)現(xiàn)飼糧中添加金霉素并沒(méi)有降低糞樣中乳酸桿菌屬和埃希氏桿菌屬-志賀氏菌屬的相對(duì)豐度，添加干酪乳桿菌也沒(méi)有提高糞樣中乳酸桿菌屬的相對(duì)豐度，這與Kim等[15]和Li等[7]的結(jié)論類(lèi)似。

關(guān)于不同品種豬的腸道菌群差異情況，楊柳等[8]、肖文萍[9]、楊麗娜[10]和楊偉平[11]比較了藏豬、榮昌豬、巴馬豬、二花臉、梅山豬以及長(zhǎng)白豬、大白豬和杜洛克豬的腸道(糞便)菌群情況，發(fā)現(xiàn)不同品種豬的糞樣菌群種/屬及數(shù)量有較大差異，國(guó)內(nèi)地方品種巴馬豬、二花臉和梅山豬的糞樣菌群聚為一簇，外來(lái)瘦肉型品種大白豬、約克夏和杜洛克的糞樣菌群聚為一簇。國(guó)內(nèi)豬種比國(guó)外瘦肉型豬種的腸道(糞便)菌群多樣性更豐富，盲腸中的纖維素分解菌的數(shù)量更大。本研究也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似規(guī)律，具有肉質(zhì)好、耐粗飼和抗病力強(qiáng)等特點(diǎn)的北京黑豬，其保育階段糞樣中普氏菌屬(Prevotella)、普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)、毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)和厭氧弧菌屬等纖維素分解菌(或半纖維素分解菌)的相對(duì)豐度較高。

4 結(jié) 論

在北京黑豬保育階段飼糧中添加干酪乳桿菌能增加仔豬腸道菌群的豐富度和多樣性，有利于腸道健康，進(jìn)而提高飼料利用率和仔豬的生長(zhǎng)速度。

[1] 縣怡涵,趙秀英,李晨博,等.植物乳桿菌和干酪乳桿菌對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、器官指數(shù)及小腸形態(tài)的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2015,27(12):3805-3811.

[2] 張魏偉,王安如,滕可導(dǎo),等.干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬十二指腸發(fā)育的組織學(xué)影響[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,20(3):114-120.

[3] 王齊桓,王安如,周寧聰,等.干酪乳桿菌對(duì)斷奶仔豬回腸黏膜結(jié)構(gòu)及上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)量的影響[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2016,52(2):34-37.

[4] ZHANG D Y,JI H F,LIU H,et al.Changes in the diversity and composition of gut microbiota of weaned piglets after oral administration ofLactobacillusor an antibiotic[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2016,100(23):10081-10093.

[5] LOOFT T,JOHNSON T A,ALLEN H K,et al.In-feed antibiotic effects on the swine intestinal microbiome[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109(5):1691-1696.

[6] POOLE T L,SUCHODOLSKI J S,CALLAWAY T R,et al.The effect of chlortetracycline on faecal microbial populations in growing swine[J].Journal of Global Antimicrobial Resistance,2013,1(3):171-174.

[7] LI P H,NIU Q,WEI Q T,et al.Microbial shifts in the porcine distal gut in response to diets supplemented withEnterococcusfaecalisas alternatives to antibiotics[J].Scientific Reports,20177:41395.

[8] 楊柳,張邑帆,鄭華,等.榮昌、長(zhǎng)白、杜洛克豬腸道微生物ERIC-PCR-DGGE指紋圖譜比較分析[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2011,32(5):21-25.

[9] 肖文萍.藏豬腸道微生物多樣性的研究[D].碩士學(xué)位論文.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2012:22-27.

[10] 楊麗娜.不同豬種間腸道微生物菌群以及生長(zhǎng)相關(guān)指標(biāo)的比較[D].碩士學(xué)位論文.南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2014:22-25.

[11] 楊偉平.藏豬腸道細(xì)菌群落組成與纖維素分解菌的研究[D].博士學(xué)位論文.楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2015:27-40.

[12] 朱偉云,余凱凡,慕春龍,等.豬的腸道微生物與宿主營(yíng)養(yǎng)代謝[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào),2014,26(10):3046-3051.

[13] KIM H B,ISAACSON R E.The pig gut microbial diversity:Understanding the pig gut microbial ecology through the next generation high throughput sequencing[J].Veterinary Microbiology,2015,177(3/4):242-251.

[14] ISAACSON R,KIM H B.The intestinal microbiome of the pig[J].Animal Health Research Reviews,2012,13(1):100-109.

[15] KIM H B,BOREWICZ K,WHITE B A,et al.Microbial shifts in the swine distal gut in response to the treatment with antimicrobial growth promoter,tylosin[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2012,109(38):15485-15490.

[16] PAJARILLO E A B,CHAE J P,BALOLONG M P,et al.Assessment of fecal bacterial diversity among healthy piglets during the weaning transition[J].Journal of General and Applied Microbiology,2014,60(4):140-146.

[17] PAJARILLO E A B,CHAE J P,BALOLONG M P,et al.Pyrosequencing-based analysis of fecal microbial communities in three purebred pig lines[J].Journal of Microbiobogy,2014,52(8):646-651.

[18] KIM H B,BOREWICZ K,WHITE B A,et al.Longitudinal investigation of the age-related bacterial diversity in the feces of commercial pigs[J].Veterinary Microbiology,2011,153(1/2):124-133.

[19] ZHAO W J,WANG Y P,LIU S Y,et al.The dynamic distribution of porcine microbiota across different ages and gastrointestinal tract segments[J].PLoS One,2015,10(2):e0117441.

*Corresponding author, professor, E-mail： jhf207@126.com