抗菌肽Sublancin增強小鼠獲得性免疫的研究

張曉雅 楊 青 王 帥 楊天任 曾祥芳 譙仕彥

(中國農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，北京 100193)

抗菌肽(antimicrobial peptide,AMPs)是生物體產(chǎn)生的一類具有生物活性的小分子多肽，廣泛地存在于生物界，是機體先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，構(gòu)成宿主防御病原微生物入侵的第1道屏障[1-2]?？咕木哂袕V譜抗菌活性，通常廣泛地作用于革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、分歧桿菌和真菌，還對寄生蟲和病毒具有殺傷效果，甚至可以殺死腫瘤細胞[1,3-4]。大多數(shù)抗菌肽通過破壞細菌細胞質(zhì)膜的完整性發(fā)揮抗菌活性，一些抗菌肽能夠穿透細胞膜并與胞內(nèi)不同的靶標結(jié)合抑制細菌生長，不易產(chǎn)生耐藥性，因此成為抗生素替代品研究的熱點[3,5]。隨著對抗菌肽結(jié)構(gòu)和功能研究的不斷深入，其免疫調(diào)節(jié)功能逐漸被研究者們所發(fā)現(xiàn)?？咕某司哂兄苯右志钚酝猓€具有多種免疫調(diào)節(jié)作用，例如調(diào)節(jié)炎癥反應、趨化免疫細胞、促進細胞分化、激活先天性和獲得性免疫系統(tǒng)等[2,6]。研究表明，魚源α-螺旋抗菌肽、雞源β-防御素(AvBD)1～14可以提高動物的抗原特異性體液免疫和細胞免疫應答水平，提高疫苗免疫效果[7-9]。

抗菌肽Sublancin是美國馬里蘭大學Hansen研究團隊從枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)168菌株的發(fā)酵液中分離得到一種具有抑菌活性的物質(zhì)，它是由37個氨基酸組成并含有2個二硫鍵的陽離子肽，其氨基酸序列為GLGKAQCAALWLQCASGGTIGCGGGAVACQNYRQFCR，相對分子質(zhì)量約為3 875.74[10-11]?？咕腟ublancin的性質(zhì)極其穩(wěn)定，可以耐受1.5～9.5的pH，還可以在高溫環(huán)境中穩(wěn)定存在[12]?？咕腟ublancin具有抗革蘭氏陽性菌活性，其抗菌譜包括巨大芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌、產(chǎn)氣夾膜梭菌等，對革蘭氏陰性菌無明顯抑菌效果[13-15]。Paik等[13]認為抗菌肽Sublancin通過作用于細菌細胞膜合成的特定分子，使細胞膜形成孔洞，從而發(fā)揮其抗菌活性。Kouwen等[16]的研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Sublancin的抑菌活性與其對細菌膜機械敏感性離子通道有關，抗菌肽Sublancin可能通過抑制這種離子通道的關閉，使細菌細胞內(nèi)物質(zhì)快速溢出，從而使細菌裂解或死亡。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Sublancin可能通過抑制細菌的能量代謝而抑制了細菌的分裂。目前關于抗菌肽Sublancin的研究主要集中在其結(jié)構(gòu)、表達調(diào)控、殺菌活性以及殺菌機制等方面，關于抗菌肽Sublancin作為一種免疫調(diào)節(jié)分子的研究還未見報道。本試驗以BALB/c小鼠為模型動物，以卵清白蛋白(ovalbumin,OVA)為模式抗原，研究抗菌肽Sublancin經(jīng)灌胃途徑對小鼠獲得性免疫反應的影響，為抗菌肽Sublancin作為免疫增強劑在動物生產(chǎn)中的應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

OVA：Sigma公司，美國；左旋咪唑：Sigma公司，美國；抗菌肽Sublancin：由國家飼料工程技術研究中心構(gòu)建了一個新型重組質(zhì)粒并將其轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌W800中，獲得高效表達的抗菌肽Sublancin，再通過AKTA純化系統(tǒng)得到純度高達99.6%的抗菌肽Sublancin樣品，將抗菌肽Sublancin溶于生理鹽水，濃度分別為0.04、0.08和0.16 mg/mL，用于小鼠灌胃；RPMI-1640液體培養(yǎng)基：Gibco公司，美國；紅細胞裂解液：Gibco公司，美國；活細胞檢測試劑盒Cell Counting Kit-8(CCK-8)：同仁化學研究所，日本；刀豆蛋白A(concanavalin A，ConA)：Sigma公司，美國；磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)：Gibco公司，美國；胎牛血清(fetal calf serum,FBS)：Hyclone公司，美國；100 U/mL青霉素以及100 μg/mL鏈霉素：Gibco公司，美國；牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)：Sigma公司，美國；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的山羊抗小鼠的免疫球蛋白G(IgG)：Arigo公司，中國臺灣；HRP標記的山羊抗小鼠的IgG1、IgG2a：Abcam公司，英國；碳酸鹽包被緩沖液(0.05 mol/L，pH 9.6)：Na2CO31.59 g，NaHCO32.93 g，加蒸餾水至1 000 mL，磁力攪拌溶解，調(diào)pH至9.6；增強型PBS洗滌液(PBST)(0.01 mol/L，pH 7.4)：NaCl 8.00 g，Na2HPO4·12H2O 2.90 g，NaH2PO40.20 g，KCl 0.20 g，Tween-20 0.5 mL，加蒸餾水至1 000 mL，磁力攪拌溶解，調(diào)pH至7.2；抗體稀釋液，1% BSA：1 g BSA溶于100 mL洗滌液；封閉液，3% BSA：3 g BSA溶于100 mL洗滌液；底物緩沖液(pH 5.0)：Na2HPO4·12H2O 3.68 g，檸檬酸0.933 g，加蒸餾水至100 mL；四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物緩沖液：TMB儲存液(10 mg溶于100 μL二甲基亞砜和900 μL蒸餾水)0.1 mL，底物緩沖液10 mL，30% H2O210 μL，臨用前新鮮配制；終止液(2 mol/L硫酸)：濃硫酸(98%)22.2 mL，蒸餾水177.8 mL；白細胞介素-2(IL-2)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細胞介素-4(IL-4)、白細胞介素-10(IL-10)檢測酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒：R&D公司，美國。

1.2 試驗設計與飼養(yǎng)管理

試驗選取6周齡無特定病原體(specific pathogen free,SPF)雌性BALB/c小鼠(購自北京華阜康生物科技股份有限公司)60只，隨機分為5組，每組12只小鼠?？瞻讓φ战M小鼠灌胃生理鹽水，陽性對照組小鼠灌胃2.5 mg/kg體重的左旋咪唑，抗菌肽Sublancin組小鼠分別灌胃0.5、1.0和2.0 mg/kg體重的抗菌肽Sublancin。各組小鼠每天灌胃0.2 mL溶液，連續(xù)灌胃14 d。灌胃結(jié)束24 h后用模式抗原OVA對各組小鼠進行首次免疫。免疫方式為背部皮下多點注射，注射劑量為100 μg/只，注射體積為0.2 mL/只。首次免疫14 d后各組小鼠分別以相同劑量和方式加強免疫1次(二次免疫)。

本試驗在農(nóng)業(yè)部飼料效價和安全評價監(jiān)督檢驗測試中心(北京)鼠營養(yǎng)代謝室進行。小鼠飼喂在控溫和控濕的房間內(nèi)，溫度為(22±2) ℃，相對濕度為(45±10)%。晝夜光照交替時間為12 h∶12 h的光照制度，自由采食和飲水，定期換墊料，清理鼠糞，保持鼠房清潔衛(wèi)生。

1.3 樣品采集

于OVA二次免疫7 d后，用眼眶采血法采集血樣。用直徑為1 mm左右滅菌的毛細管插入小鼠眼底，捻動玻璃針擠破眼底動脈叢，收集200～300 μL血樣至1.5 mL無菌離心管中。室溫靜置2 h后，將血樣在4 ℃條件下3 000 r/min離心10 min。之后在無菌條件下，用移液槍吸出上層淡黃色血清并分裝，貯存于-80 ℃冰箱中待測。采血完成后，將小鼠頸部脫臼處死，無菌取脾臟，制備脾臟淋巴細胞懸浮液。

1.4 檢測指標

1.4.1 體重

分別于灌胃前、首次免疫前、二次免疫前以及剖殺前稱量小鼠的體重。

1.4.2 血清OVA特異性IgG及其亞類IgG1、IgG2a含量的檢測

間接ELISA法檢測小鼠血清中OVA特異性抗體IgG及其亞類IgG1、IgG2a含量。將含5 μg/mL OVA的包被液加入96孔ELISA板，100 μL/孔，4 ℃冰箱中孵育過夜。每孔加入PBST 300 μL，每次3 min，洗滌5次，拍干。加入3%的BSA封閉液，150 μL/孔，37 ℃溫箱中孵育60 min。PBST洗板5次，每次3 min，加入待檢血清(1∶1 000倍稀釋)，100 μL/孔，設2個重復，37 ℃溫箱中孵育60 min。PBST洗板5次，每次3 min，加入經(jīng)1∶5 000倍稀釋HRP標記的山羊抗小鼠IgG，1∶10 000倍稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG1或者1∶5 000倍稀釋的HRP標記的山羊抗小鼠IgG2a 100 μL/孔，37 ℃溫箱中孵育60 min。PBST洗板5次，每次3 min，加入TMB底物溶液顯色，100 μL/孔，37 ℃避光孵育5 min。每孔加50 μL 2 mol/L硫酸終止反應，輕輕振蕩混勻。立即用酶標儀測定其在450 nm波長下的吸光度(OD)值。

1.4.3 脾臟淋巴細胞增殖能力檢測

小鼠脾臟淋巴細胞活性通過CCK-8活細胞檢測試劑盒檢測，于OVA二次免疫7 d后將小鼠頸椎脫臼處死，并用75%的乙醇浸泡3～5 min。在超凈臺中無菌取脾臟，置于盛有10 mL冷Hanks液的平皿中，于200目不銹鋼絲網(wǎng)上輕輾。吸取冷3 mL Hanks液沖洗篩網(wǎng)，收集網(wǎng)下細胞注入離心管。1 000 r/min離心5 min后棄上清液。加入2 mL紅細胞裂解液，重懸細胞后，裂解5 min，加3 mL Hanks液洗滌2次，1 000 r/min離心5 min后棄去上清，用1 mL 10% FBS的RPMI-1640完全培養(yǎng)基重懸細胞。用臺盼藍染色(1∶9體積比稀釋)進行活細胞計數(shù)，保證活細胞數(shù)不低于95%，然后調(diào)整細胞濃度到2.5×106/mL。細胞懸液加入96孔板，每孔100 μL。然后在陽性對照孔加入ConA，終濃度為5 μg/mL。檢測孔加入OVA，終濃度為5 μg/mL。同時設陰性對照孔(細胞和RPMI-1640培養(yǎng)基)和空白孔(RPMI-1640培養(yǎng)基)。每孔總體積為200 μL。每個樣品重復3孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h。再將CCK-8試劑加入培養(yǎng)孔，每孔10 μL。于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h。用酶標儀測定在450 nm的OD值。計算刺激指數(shù)：

刺激指數(shù)=(各刺激孔OD值-培養(yǎng)基OD值)/
(未刺激孔的OD值-培養(yǎng)基OD值)。

1.4.4 脾臟淋巴細胞上清液細胞因子含量的檢測

按照1.4.3所述方法取脾臟并制備脾臟淋巴細胞懸浮液，染色計數(shù)調(diào)整細胞濃度至5×106/mL。將細胞懸液加入96孔板，每孔100 μL。然后再在每個孔中加入100 μL OVA，終濃度為5 μg/mL。將細胞與37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育48 h。孵育結(jié)束后，1 000 r/min離心10 min，輕輕吸取上層細胞培養(yǎng)上清液。脾臟淋巴細胞上清液中1型輔助性T細胞(T helper type 1 cell,Th1)細胞因子IFN-γ、IL-2和2型輔助性T細胞(T helper type 2 cell,Th2)細胞因子IL-4、IL-10的含量用ELISA檢測試劑盒進行檢測，具體步驟按照說明書進行。

1.5 統(tǒng)計方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件中兩獨立樣本t檢驗方法對試驗數(shù)據(jù)進行分析。試驗結(jié)果用平均值表示，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗菌肽Sublancin對小鼠體重的影響

由表1可知，在生理鹽水、左旋咪唑以及抗菌肽Sublancin灌胃小鼠2周后，各組小鼠的體重無顯著差異(P>0.05)。在OVA首次免疫小鼠14 d和二次免疫7 d后，各組小鼠的體重無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明，抗菌肽Sublancin灌胃對小鼠體重沒有影響。

2.2 抗菌肽Sublancin對小鼠血清OVA特異性IgG含量的影響

抗菌肽Sublancin對小鼠血清OVA特異性IgG含量的影響見圖1。由圖1可知，與空白對照組相比，0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組小鼠血清的OVA特異性IgG含量顯著或極顯著增高(P<0.05或P<0.01)，陽性對照組小鼠血清OVA特異性IgG含量顯著提高(P<0.05)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間小鼠血清OVA特異性IgG含量無顯著差異(P>0.05)。

表1 抗菌肽Sublancin對小鼠體重的影響

同行數(shù)據(jù)肩標無字母表示差異不顯著(P>0.05)。

In the same row, values with no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05).

2.3 抗菌肽Sublancin對小鼠血清OVA特異性IgG的亞類IgG1、IgG2a含量的影響

抗菌肽Sublancin對小鼠血清OVA特異性IgG的亞類IgG1、IgG2a含量的影響見圖2。由圖2-a可知，與空白對照組相比，2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組和陽性對照組小鼠血清OVA特異性IgG1含量顯著提高(P<0.05)，1.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組小鼠血清OVA特異性IgG1含量極顯著提高(P<0.01)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間的小鼠血清OVA特異性IgG1含量無顯著差異(P>0.05)。

由圖2-b可知，與空白對照組相比，1.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組和陽性對照組的小鼠血清OVA特異性IgG2a含量顯著提高(P<0.05)。0.5和2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組的小鼠血清OVA特異性IgG2a含量與空白對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間的小鼠血清OVA特異性IgG2a含量無顯著差異(P>0.05)。

以上結(jié)果表明，1.0和2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin灌胃2周能不同程度地提高OVA免疫小鼠血清中OVA特異性IgG亞類IgG1和IgG2a含量，且與左旋咪唑灌胃的陽性對照組無顯著差異。

2.4 抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響見圖3。由圖3可知，與空白對照組相比，1.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組和陽性對照組的小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數(shù)均顯著提高(P<0.05)。0.5和2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組的小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數(shù)與空白對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間的小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數(shù)無顯著差異(P>0.05)。

NC：空白對照組；PC：陽性對照組。數(shù)據(jù)柱標*表示與空白對照組差異顯著(P<0.05)，**表示與空白對照組差異極顯著(P<0.01)，抗菌肽Sublancin組數(shù)據(jù)柱未標字母表示與陽性對照組之間無顯著差異(P>0.05)。下圖同。

NC: blank control group; PC: positive control group. Value columns with * mean significant difference compared with blank control group (P<0.05), and with ** mean extremely significant difference compared with blank control group (P<0.01), while value columns of antimicrobial peptide Sublancin groups with no letter mean no significant difference compared with positive control group (P>0.05). The same as below.

圖1抗菌肽Sublancin對小鼠血清OVA特異性IgG含量的影響

Fig.1 Effects of antimicrobial peptide Sublancin on serum OVA-specific IgG content of mice (n=12)

2.5 抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞上清液中Th1型細胞因子含量的影響

抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞上清液中Th1型細胞因子含量的影響見圖4。由圖4-a可知，與空白對照組相比，1.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組和陽性對照組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IFN-γ含量顯著提高(P<0.05)。0.5和2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IFN-γ含量與空白對照組相比沒有顯著差異(P>0.05)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IFN-γ含量無顯著差異(P>0.05)。

由圖4-b可知，與空白對照組相比，1.0和2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-2含量極顯著提高(P<0.01)，陽性對照組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-2含量顯著提高(P<0.05)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-2含量無顯著差異(P>0.05)。

上述結(jié)果表明，1.0和2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin灌胃2周可以促進小鼠脾臟淋巴細胞分泌Th1型細胞因子IFN-γ和IL-2。

2.6 抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞上清液中Th2型細胞因子含量的影響

抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞上清液中Th2型細胞因子含量的影響見圖5。由圖5-a可知，與空白對照組相比，0.5 mg/kg抗菌肽Sublancin組和陽性對照組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-4含量顯著提高(P<0.05)，1.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-4含量極顯著提高(P<0.01)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-4含量無顯著差異(P>0.05)。

由圖5-b可知，與空白對照組相比，1.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組和陽性對照組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-10含量極顯著提高(P<0.01)，0.5 mg/kg抗菌肽Sublancin組的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-10含量顯著提高(P<0.05)。0.5、1.0、2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin組與陽性對照組之間的小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-10含量無顯著差異(P>0.05)。

上述結(jié)果表明，0.5和1.0 mg/kg抗菌肽Sublancin灌胃2周可以促進小鼠脾臟淋巴細胞分泌Th2型細胞因子IL-4和IL-10。

3 討 論

除了抗菌活性外，抗菌肽如α-防御素和β-防御素可以通過誘導巨噬細胞和樹突狀細胞的分化，趨化樹突狀細胞、單核-巨噬細胞和T細胞等免疫細胞，從而將先天性免疫和獲得性免疫聯(lián)系起來[2,6]。此外，抗菌肽如θ-防御素可以通過促進CD4+T淋巴細胞增殖與細胞因子的分泌直接調(diào)節(jié)獲得性免疫[17]。因此，抗菌肽可以增強模式抗原或病原微生物特異性的獲得性免疫反應[18]。研究表明，抗菌肽Sublancin具有一定的體外和體內(nèi)抑菌活性[13-15]，但是目前關于抗菌肽Sublancin對機體獲得性免疫的作用還不清楚。本試驗以小鼠為動物模型，選用OVA為模式抗原[7,19]，初步探討了抗菌肽Sublancin對獲得性免疫反應的影響。

圖2 抗菌肽Sublancin對小鼠血清OVA特異性IgG亞類IgG1(a)、IgG2a(b)含量的影響

圖3 抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響

獲得性免疫包括由B淋巴細胞介導的體液免疫和由T淋巴細胞介導的細胞免疫。體液免疫是抗原進入機體后誘導相應的B細胞活化、增殖、分化以及產(chǎn)生特異性抗體進入體液發(fā)揮效應的過程[20]。常用動物血清抗原特異性抗體含量來反映動物的體液免疫功能。細胞免疫應答由T細胞介導，過程包括3個階段：1)初始T細胞特異性識別抗原；2)初始T細胞活化、增殖和分化為效應T細胞；3)效應T細胞發(fā)揮免疫效應，清除抗原[20]。輔佐性T細胞(T helper cell,Th)是調(diào)節(jié)免疫應答的主要細胞，其產(chǎn)生的眾多細胞因子通過復雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡實現(xiàn)對免疫應答的調(diào)控。CD4+Th細胞根據(jù)所產(chǎn)生的細胞因子可分為Th1型細胞和Th2型細胞[21]。Th1型細胞可以通過活化巨噬細胞和釋放多種細胞因子，誘導細胞免疫反應，清除細胞內(nèi)抗原；Th2型細胞可以通過產(chǎn)生IL-4、白細胞介素-5(IL-5)、白細胞介素-6(IL-6)和IL-10等細胞因子，促進B細胞增殖、分化以及產(chǎn)生抗體，輔助體液免疫[20-21]。

本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抗菌肽Sublancin灌胃2周可以提高小鼠血清OVA特異性IgG含量，表明抗菌肽Sublancin可以增強OVA特異性體液免疫反應。除了提高血清中OVA特異性IgG含量外，抗菌肽Sublancin還促進了血清OVA特異性IgG亞類IgG1和IgG2a的產(chǎn)生。IgG1和IgG2a含量的測定可以分別用來衡量Th2和Th1型體液免疫反應[22]。因此本試驗結(jié)果表明，抗菌肽Sublancin可以增強機體的Th1型和Th2型體液免疫反應。

抗菌肽Sublancin可以提高OVA免疫小鼠脾臟淋巴細胞在OVA刺激下分泌Th1型細胞因子IL-2和IFN-γ以及Th2型細胞因子IL-4和IL-10的含量，由此可知，抗菌肽Sublancin可以增強Th1型和Th2型免疫反應。這一結(jié)果與抗菌肽Sublancin對IgG亞型產(chǎn)生的影響結(jié)果相吻合。OVA特異性抗體亞類以及細胞因子含量的檢測結(jié)果共同表明，抗菌肽Sublancin可以提高Th1和Th2混合型免疫反應。

另外，抗菌肽Sublancin可以提高小鼠脾臟淋巴細胞的刺激指數(shù)。脾臟淋巴細胞增殖能力是反映細胞免疫水平的一個重要指標[23]。本試驗結(jié)果表明，抗菌肽Sublancin可以輔助OVA誘導機體產(chǎn)生較好的細胞免疫應答，這與抗菌肽Sublancin促進Th1型細胞因子產(chǎn)生的結(jié)果吻合。

圖4 抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IFN-γ(a)和IL-2(b)含量的影響

圖5 抗菌肽Sublancin對小鼠脾臟淋巴細胞上清液中IL-4(a)和IL-10(b)含量的影響

左旋咪唑是人工合成的噻咪唑的左旋異構(gòu)體。大量研究表明，左旋咪唑具有免疫調(diào)節(jié)作用，可以作為免疫增強劑提高動物的體液免疫和細胞免疫應答，是許多免疫增強劑試驗的對照品[24-27]。因此，本試驗選用左旋咪唑作為陽性對照。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5、1.0和2.0 mg/kg抗菌肽Sublancin灌胃與2.5 mg/kg左旋咪唑灌胃對OVA免疫小鼠的體液免疫和細胞免疫的增強作用相當。本試驗的結(jié)果顯示抗菌肽Sublancin灌胃對小鼠的體重沒有顯著影響，表明抗菌肽Sublancin以0.5～2.0 mg/kg的劑量連續(xù)灌胃2周對小鼠具有很好的安全性。

抗菌肽影響機體先天免疫和獲得性免疫的免疫應答[28]。已有研究顯示抗菌肽可以增強小鼠的免疫反應，來源于人類嗜中性粒細胞的α-防御素提高其血清抗原特異性IgG含量，并促進CD4+釋放IFN-γ、IL-5、IL-6和IL-10[29-30]。人工合成的抗菌肽KLKL5KLK是產(chǎn)生Th2型適應性免疫的有效誘導劑[7]。由抗菌肽KLKL5KLK和脫氧肌苷/脫氧胞嘧啶混合的合成佐劑誘導Th1型細胞和體液免疫應答反應[31-32]。近些年來，抗菌肽可以影響機體先天和獲得性免疫應答的研究結(jié)果層出不窮，但是抗菌肽究竟是通過何種機制使機體產(chǎn)生免疫應答，與其相關的研究并不多。已有的研究顯示，抗菌肽可以通過激活先天性免疫系統(tǒng)，啟動獲得性免疫應答，如誘導樹突狀細胞、巨噬細胞的分化[33-35]?？咕倪€可以通過直接作用于T細胞和B細胞，直接調(diào)節(jié)獲得性免疫[6]。根據(jù)體內(nèi)試驗的研究結(jié)果，抗菌肽可能通過提高抗原與抗原遞呈細胞(antigen-presenting cells,APCs)之間的聯(lián)系或者延長抗原在注射部位的存留時間增強獲得性免疫反應[7]。Fritz等[7]的研究發(fā)現(xiàn)，人工合成抗菌肽KLKL5KLK可以提高OVA抗原遞呈到單核-巨噬細胞系P388D1，他們的研究還發(fā)現(xiàn)，KLKL5KLK可以延長OVA在注射部位的停留時間。抗菌肽Sublancin灌胃小鼠可以提高抗原特異性細胞免疫和體液免疫應答，并產(chǎn)生Th1和Th2混合型免疫反應，其調(diào)節(jié)獲得性免疫的機理還需進一步研究。

4 結(jié) 論

抗菌肽Sublancin可以誘導OVA免疫小鼠產(chǎn)生Th1和Th2混合型免疫反應，增強體液免疫和細胞免疫應答。

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*Corresponding author, professor, E-mail: qiaoshy@mafic.ac.cn