牛乳鐵蛋白多克隆抗體的制備、純化及定量檢測

王 建 郝麗媛 魏婧雅 孫 鵬

(中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學國家重點實驗室，北京 100193)

近年來，人們對乳品質(zhì)的要求越來越高，乳蛋白作為衡量乳品質(zhì)的重要指標，其合成的營養(yǎng)調(diào)控已經(jīng)成為奶牛營養(yǎng)學研究的熱點。乳鐵蛋白(lactoferrin，Lf)也稱為乳運鐵蛋白，是牛奶中重要生物活性物質(zhì)之一，具有調(diào)節(jié)鐵吸收，廣譜抗細菌感染的作用[1-2]，可以調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，還具有抗氧化、抗癌、抗病毒等作用[3]。乳鐵蛋白在初乳中濃度較高，人初乳中濃度為6～8 mg/mL；奶牛初乳中濃度為1～2 mg/mL；而在常乳中濃度較低，人常乳中濃度為1～2 mg/mL，奶牛常乳中濃度為0.02～0.35 mg/mL。由于人乳來源有限，因此牛奶即成為人們獲取乳鐵蛋白的最直接途徑。為檢測牛奶與乳制品中乳鐵蛋白的濃度，有效降低牛奶加工過程中造成的損失，需要建立一種快速、準確的方法測定生鮮乳及乳制品中乳鐵蛋白的濃度。

酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme-link immunosorbent assay，ELISA)方法是檢測特定蛋白質(zhì)的有效方法，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點。ELISA方法結(jié)合十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)可用于針對特定抗原的定性和定量檢測。利用此種方法檢測生鮮乳及乳制品中的乳鐵蛋白濃度需要用到相應(yīng)的乳鐵蛋白抗體，而Sigma公司出售的商品化抗體價格昂貴，不適合大批量樣品檢測。因此，本試驗通過免疫新西蘭大白兔來制備兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體，旨在為研究奶牛乳鐵蛋白的合成調(diào)控提供有效的試驗材料。為得到純度較高、特異性較強的抗體，通過飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂對抗血清進行純化，純化后得到的抗體用ELISA方法測定其效價以及與乳鐵蛋白的抑制率，以期為定量檢測牛奶中以及奶牛乳腺中合成的乳鐵蛋白提供有效研究材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料包括乳鐵蛋白標準品(美國Sigma公司，純度≥85%)、弗氏完全佐劑(美國Sigma公司)、弗氏不完全佐劑(美國Sigma公司)、蛋白A樹脂(美國Genscript公司)、羊抗兔辣根過氧化物酶標記的免疫球蛋白G(immunoglobulin G-horseradish peroxides，IgG-HRP)(武漢博士德生物工程有限公司)。乳腺組織樣品采自中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗基地；液態(tài)奶樣品為市售超高溫滅菌乳；奶粉樣品為市售品牌普通奶粉。

1.2 試驗動物及飼養(yǎng)管理

試驗選取4只健康純種新西蘭大白兔，單籠飼養(yǎng)，每日飼喂顆粒飼料(飼料中不含酪蛋白)，自由采食和飲水。飼養(yǎng)前對兔舍進行徹底清掃和消毒，待兔適應(yīng)飼養(yǎng)環(huán)境1周后，耳緣靜脈采血，測定其血清是否與乳鐵蛋白有反應(yīng)，血清與乳鐵蛋白無反應(yīng)性的合格兔子按免疫程序進行免疫。

1.3 免疫程序及抗血清的制備

乳鐵蛋白抗血清的制備參考You等[4]的方法。試驗第1周，將弗氏完全佐劑與乳鐵蛋白溶液等比例乳化完全后，采用皮下多點注射法，每只兔注射1 mL乳化液(含500 μg乳鐵蛋白)，4周后，同樣方法背部皮下多點注射經(jīng)弗氏不完全佐劑乳化完全的乳鐵蛋白(含250 μg乳鐵蛋白)，以后每2周重復1次，每次免疫后的第7天耳緣靜脈采血，ELISA方法檢測抗血清效價。第4次免疫后的第7天進行心臟采血。待血液凝結(jié)后，于940×g離心20 min，取上清液分裝后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 飽和硫酸銨法純化抗血清

飽和硫酸銨純化參考龐學燕等[5]的方法配制，取500 μL血清加入等體積的磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline，PBS)(0.01 mol/L，pH 7.4)，冰浴下逐滴加入250 μL飽和硫酸銨溶液，旋渦混勻，4 ℃靜置30 min，4 ℃、1 550×g離心15 min，取上清液。在上清液中逐滴加入1 000 μL飽和硫酸銨溶液，旋渦混勻，4 ℃靜置30 min，離心棄上清液。沉淀用500 μL PBS溶解，在溶液中逐滴加入250 μL飽和硫酸銨溶液，邊加邊攪拌，4 ℃靜置30 min，4 ℃離心，保留沉淀。沉淀繼續(xù)用PBS溶解，滴加飽和硫酸銨溶液，靜置，離心，保留沉淀。將沉淀溶于PBS中，裝入透析袋中4 ℃透析過夜。

1.5 蛋白A樹脂純化抗血清

參考龐學燕等[5]的方法，采用蛋白A樹脂純化抗血清。向純化柱中加入1 mL結(jié)合/洗滌緩沖液，將1 mL混勻的蛋白A樹脂加入柱中，再向柱中加入5 mL結(jié)合/洗滌緩沖液以平衡柱子，流速約1 mL/min。將結(jié)合/洗滌緩沖液稀釋后的血清樣本加入柱中，保持流出速度約為1 mL/min。用30 mL結(jié)合/洗滌緩沖液沖洗柱子并使緩沖液流出速度約2 mL/min，用15 mL洗脫緩沖液洗脫抗體，保持洗脫液流速約1 mL/min。將含有抗體的洗脫液收集到含平衡緩沖液的燒杯中以中和洗脫液pH至7.4。洗脫出來的抗體溶液裝入透析袋中4 ℃透析過夜。

1.6 SDS-PAGE鑒定純化后抗體純度

配制12%的分離膠和5%的濃縮膠，取80 μL抗體樣品與20 μL 5×上樣緩沖液混勻，在沸水中煮沸5 min。每孔上樣12 μL，電壓調(diào)為80 V開始電泳(PowerPac 3000型電泳儀，美國Bio-Rad公司)，當指示染料進入分離膠后，將電壓調(diào)至120 V，繼續(xù)電泳直至染料抵達距分離膠下端約1 cm處停止電泳，固定液固定，考馬斯亮藍染色，脫色液脫色，直至條帶清晰可辨，用凝膠成像系統(tǒng)拍照觀察。

1.7 ELISA方法檢測純化后抗體的效價

抗體效價的檢測采用ELISA方法[6]。將乳鐵蛋白標準品用包被液稀釋至0.31 μg/mL，每孔100 μL包被酶標板，4 ℃過夜，并用PBS做陰性對照，次日棄去孔內(nèi)液體，每孔加入200 μL封閉液[1%卵清白蛋白(OVA)]，置37 ℃恒溫箱1 h，傾去液體后，用磷酸鹽吐溫緩沖液(phosphate-buffered saline tween，PBST)洗滌4次，每次靜置3 min后迅速傾去洗滌液，拍干。取不同稀釋度(1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、 1∶32 000、1∶64 000和1∶128 000)的純化后抗體，每個稀釋度3個重復，37 ℃溫育1 h，然后傾去液體，PBST洗滌，傾去液體，拍干。每孔加100 μL按1∶5 000稀釋的羊抗兔IgG-HRP抗體，37 ℃溫育1 h，PBST洗滌，傾去液體，拍干。每孔加入100 μL新鮮配制的四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物溶液室溫孵育20 min。每孔加入50 μL終止液(2 mol/L硫酸)，5 min后在酶標儀上測定450 nm下的吸光度(OD450 nm)值。若待測孔OD450 nm值大于或等于陰性對照孔的2.1倍，即認為是陽性值，從而得出抗體的效價。

1.8 乳鐵蛋白的測定工作曲線

用競爭性ELISA測定抗體與乳鐵蛋白之間的抑制率[6]。將抗體作適當濃度稀釋后，以等體積分別與系列倍比稀釋(40 000、20 000、10 000、5 000、2 500、1 250、625、312.5 ng/mL)的乳鐵蛋白混勻后，室溫反應(yīng)15 min。然后加至已包被處理的酶標板中。其余步驟同1.7。根據(jù)OD450 nm值繪制標準曲線，計算抗體與乳鐵蛋白的抑制率。

1.9 乳腺組織及乳制品中乳鐵蛋白濃度的測定

將從屠宰場采集的奶牛乳腺組織樣品迅速放入液氮保存。測定時，將乳腺組織樣品取出后，倒入液氮進行研磨，稱取一定量乳腺組織樣品，充分溶解于5倍體積的PBS中，同時加入放射免疫沉淀測定裂解液(radio immunoprecipitation assay，RIPA)和蛋白酶抑制劑，12 000×g離心10 min，取上清液，用二辛可酸(BCA)蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒檢測待檢樣品中總蛋白質(zhì)的濃度。取1 mL液態(tài)奶，加入蒸餾水進行稀釋后，3 000×g離心10 min，去除上層脂肪。加入1 mol/L稀鹽酸調(diào)節(jié)pH為4.6，去除酪蛋白，得到乳鐵蛋白粗品。取3 g奶粉樣品，加水定容至100 mL，離心去除脂肪和酪蛋白后，得到乳鐵蛋白粗品。利用乳鐵蛋白測定工作曲線，檢測乳腺組織、液態(tài)奶及奶粉中乳鐵蛋白的濃度。

1.10 免疫印跡法(Western-blot)鑒定純化后抗體特異性及反應(yīng)性

將乳鐵蛋白純品溶于PBS中，奶牛乳腺組織、液態(tài)奶和奶粉前處理方式同1.9。以總蛋白質(zhì)濃度作為SDS-PAGE上樣量依據(jù)，配制12%分離膠和5%濃縮膠，對乳鐵蛋白純品、奶牛乳腺組織、液態(tài)奶和奶粉樣品進行電泳，電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到預先用甲醇活化的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene difluoride,PVDF)上，利用0.5%的雞血清進行封閉，將乳鐵蛋白多克隆抗體溶液按1∶6 000稀釋后，室溫孵育2 h，PBST洗后加入羊抗兔辣根過氧化物酶標記IgG抗體(1∶5 000稀釋)，PBST洗膜，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色劑顯色后掃描結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳鐵蛋白多克隆抗體純度

SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示，經(jīng)過飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂2步純化后得到的乳鐵蛋白多克隆抗體重鏈清晰可見，表明通過純化得到了純度較高的乳鐵蛋白抗體。

1：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；2：純化后的多克隆抗體。

1: protein molecular weight standard; 2: purified polyclonal antibodies.

圖1純化后多克隆抗體的電泳圖

Fig.1 Electrophoresis of purified polyclonal antibodies

2.2 乳鐵蛋白多克隆抗體效價

用BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒測得乳鐵蛋白多克隆抗體濃度為11.02 mg/mL。圖2為多克隆抗體的效價曲線，抗體經(jīng)過純化以后，ELISA方法檢測抗體的效價為1∶128 000。

圖2 兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體效價曲線

2.3 抗體與乳鐵蛋白的抑制率

抗體與乳鐵蛋白的抑制率見圖3，抑制抗原與抗體結(jié)合50%時乳鐵蛋白的濃度(IC50)為24.55 μg/mL。測檢出限時，乳鐵蛋白設(shè)10個濃度梯度，從1 000 μg/mL起始2倍等比稀釋到1.95 μg/mL，每個濃度設(shè)6個重復，線性范圍11～40 μg/mL，檢出限為11.48 μg/mL。

圖3 抗體與乳鐵蛋白的抑制率

2.4 乳腺組織及乳制品中乳鐵蛋白濃度的測定

利用工作曲線測定乳腺組織樣品及乳制品中乳鐵蛋白濃度，測得5份乳腺組織樣品中乳鐵蛋白濃度范圍在14.72～18.64 μg/g，平均值為16.13 μg/g，相對標準偏差為11.05%，液態(tài)奶中乳鐵蛋白濃度接近于0 μg/g，奶粉中乳鐵蛋白濃度范圍為4.91～5.73 μg/g，平均值為5.28 μg/g，相對標準偏差為6.42%。

2.5 乳鐵蛋白抗體特異性

Western-blot結(jié)果如圖4所示，純化后的抗體能夠與乳鐵蛋白標準品專一性結(jié)合，表明得到的抗體能夠特異性識別乳鐵蛋白。

圖5顯示，純化后的抗體與奶牛乳腺組織中提取的乳鐵蛋白具有反應(yīng)性，同時對奶粉中的乳鐵蛋白也有特異反應(yīng)性，可用于檢測奶牛乳腺組織和乳制品中的乳鐵蛋白。途中條帶的粗細可初步反映樣品中乳鐵蛋白濃度的差異，由圖可以看出，奶粉中乳鐵蛋白濃度高于乳腺組織及液態(tài)奶樣品。

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1～2：乳鐵蛋白。

M: protein molecular weight standard; 1 to 2: lactoferrin.

圖4Western-blot法鑒定乳鐵蛋白抗體特異性

Fig.4 Identification of lactoferrin antibody specificity by Western-blot method

M：蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標準；1：液態(tài)奶樣品；2～3：乳腺組織樣品；4：奶粉樣品。

M: protein molecular weight standard; 1: liquid milk sample; 2 to 3: breast tissue sample; 4: milk powder sample.

圖5Western-blot法鑒定奶牛乳腺組織及乳制品中提取的乳鐵蛋白與抗體的反應(yīng)性

Fig.5 Identification of the reactivity between lactoferrin extracted from mammary gland tissues and milk products of dairy cows and antibodies by Western-blot method

3 討 論

牛奶中含有多種生物活性物質(zhì)，例如抗毒素、抗細菌和抗病毒以及刺激免疫系統(tǒng)的成分。其中，乳鐵蛋白即是一種多功能蛋白質(zhì)，具有與鐵元素結(jié)合的特性，不僅可以促進鐵的吸收，同時兼具抗細菌、抗病毒、抗真菌、抗炎癥、抗氧化和免疫調(diào)控等作用[3,7-9]。Habing等[10]研究發(fā)現(xiàn)，乳鐵蛋白還可以降低斷奶前腹瀉犢牛的死亡率。目前針對乳鐵蛋白的檢測方法主要有高效液相色譜法[9,11]、放射免疫擴散法[12]以及ELISA方法[13]等。

高效液相色譜法利用色譜柱根據(jù)樣品分子質(zhì)量的差異分離蛋白質(zhì)，其測定結(jié)果準確可靠，精密度高，重復性好；但僅適合于高純度樣品測定，如果樣品中乳鐵蛋白濃度較低時，由于乳鐵蛋白與其他雜蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相近，在凝膠色譜上的保留時間相近，很難將各組分區(qū)分開，進而影響定量結(jié)果[14]。且高效液相色譜法需要的儀器較為昂貴。龔廣予等[12]利用放射免疫擴散法檢測嬰幼兒配方奶粉中的乳鐵蛋白，利用抗原抗體反應(yīng)形成沉淀帶的原理計算乳鐵蛋白濃度，準確性稍差。而ELISA方法操作相對簡便，準確性好，對于乳及乳制品中濃度相對較低的乳鐵蛋白而言，該方法靈敏度高，且對樣品純度要求不高，檢測限較低，適合于乳鐵蛋白的檢測[13]。因此，制備乳鐵蛋白抗體是目前檢測牛奶及奶牛乳腺中合成的乳鐵蛋白的優(yōu)選措施。與普通抗血清相比，特異性抗體的制備要求對相應(yīng)抗血清進行純化，其制備步驟更為復雜，但抗體的效價相對較高。針對牛奶中的多種生物活性蛋白質(zhì)，已經(jīng)得到了包含兔抗牛β-酪蛋白、αs-酪蛋白和κ-酪蛋白以及乳鐵蛋白等的抗血清[14-18]，早期沈新義等[19]利用乳鐵蛋白免疫家兔得到的抗血清效價僅為1∶10 000，李巖[18]利用乳鐵蛋白免疫新西蘭大白兔和高產(chǎn)羅曼蛋雞，得到的抗血清效價僅為1∶48 000，與本試驗中特異性抗體的效價相差甚遠。

以往研究中針對抗體的純化方法多為單一純化方法，常見的有鹽析法、離子交換層析法和親和層析法等。鹽析法利用蛋白質(zhì)在高濃度鹽溶液中形成沉淀的原理分離純化蛋白質(zhì)，離子交換層析法利用離子交換樹脂與蛋白質(zhì)的選擇性結(jié)合而分離蛋白質(zhì)，而親和層析法則是利用蛋白質(zhì)與介質(zhì)中配基的特異結(jié)合而分離純化蛋白質(zhì)。由于以上方法的原理不盡相同，其純化抗體后的純度也相差甚遠，例如，通過飽和硫酸銨鹽析法得到的抗體純度一般在75%左右，而利用親和層析法純化后的抗體純度可達90%以上[4]。本試驗中在分析比較了前人所用方法的基礎(chǔ)上，先后通過飽和硫酸銨法和蛋白A樹脂2種方法純化了抗體，經(jīng)SDS-PAGE電泳后看到抗體條帶清晰，且純度較好，抗體濃度為11.02 mg/mL。

抗體滴度，即抗體效價，用抗體的稀釋倍數(shù)表示，是指某一抗體經(jīng)稀釋后能與抗原結(jié)合并出現(xiàn)可見反應(yīng)的最高稀釋倍數(shù)；或者是稀釋抗體和陰性對照的吸光度值之比大于2.0的最大的抗體稀釋度。本試驗中的多克隆抗體血清來自4只用乳鐵蛋白免疫的新西蘭白兔。在血清稀釋倍數(shù)最大為128 000時，仍然為陽性反應(yīng)，證明最終的抗體效價為1∶128 000。Western blot法證明本試驗中制備的多克隆抗體與乳鐵蛋白標準品可特異性結(jié)合，且可用于檢測奶牛乳腺組織中以及奶粉中的乳鐵蛋白。本試驗中奶牛乳腺組織、市售液態(tài)奶及奶粉樣品中的乳鐵蛋白檢測結(jié)果不盡相同，證明不同樣品中該物質(zhì)濃度有所差異。研究表明，乳鐵蛋白由機體外分泌腺分泌，主要存在于乳汁中，同時在淚液、唾液、血漿、膽汁、胰液和嗜中性粒細胞中也有存在[20]。其在初乳中濃度最高，常乳次之，而本試驗中檢測到其在奶粉樣品中濃度稍高，證明奶粉中可能含有外源添加的乳鐵蛋白。由于乳鐵蛋白具有多種生物學功能，有利于人體健康而無毒副作用，目前已成為允許在嬰幼兒配方奶粉以及食品中添加的物質(zhì)之一[21]。本試驗中液態(tài)奶中乳鐵蛋白濃度偏低可能與其加工儲存方式有關(guān)。通過利用本試驗中制備的抗體檢測不同樣品中乳鐵蛋白濃度的差異結(jié)果表明，該抗體可有效反映樣品中乳鐵蛋白的濃度。

4 結(jié) 論

本試驗通過免疫新西蘭大白兔成功制備了純度較高、特異性較強的兔抗牛乳鐵蛋白多克隆抗體，抗體濃度為11.02 mg/mL，效價達到1∶128 000，該多克隆抗體可以與乳鐵蛋白特異性結(jié)合，可用于定性鑒定和定量檢測牛奶中以及奶牛乳腺合成的乳鐵蛋白，為后續(xù)奶牛乳鐵蛋白合成調(diào)控的研究工作的開展奠定了基礎(chǔ)。

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*Corresponding author, associate professor, E-mail: sunpeng02@caas.cn