發(fā)酵底物錳含量對(duì)牦牛體外瘤胃發(fā)酵的影響

劉慧麗 薛艷鋒* 郝力壯** 劉書(shū)杰** 柴沙駝 張曉衛(wèi)

(1.省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省高原放牧家畜動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；2.青海高原牦牛研究中心，西寧 810016；3.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016)

牦牛作為高原的特有物種，在嚴(yán)酷的自然環(huán)境下具有高免疫性、抗逆性和快速適應(yīng)性等特點(diǎn)[1]，其絨、乳、肉等為牧民提供了主要的物質(zhì)生活資料。一直以來(lái)，牦牛的生存主要依靠于天然草場(chǎng)，低產(chǎn)犢率、低生長(zhǎng)速率、冷季掉膘嚴(yán)重等問(wèn)題嚴(yán)重制約著牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此近些年來(lái)，牦牛的冷季補(bǔ)飼越來(lái)越受到研究者和牧民的關(guān)注，科學(xué)配制牦牛飼糧也顯得尤為重要。關(guān)于牦牛能量和蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)方面已經(jīng)有一定量的研究[2-3]，但是關(guān)于牦牛微量元素錳方面的研究基本上處于空白狀態(tài)。錳作為微量元素的一種，是動(dòng)物生命活動(dòng)中所必需的微量元素之一。錳能促進(jìn)骨骼發(fā)育[4-5]，參與造血[6]，增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能[7-8]，是很多酶類的組成成分[9]。郗麗蘭[10]報(bào)道，牛對(duì)飼糧錳的需要量為46.40～48.40 mg/kg。莊懷飛等[11]研究了不同飼糧錳、銅含量下荷斯坦公?？寡趸笜?biāo)的變化，結(jié)果表明飼糧錳的適宜含量為50.00 mg/kg。紀(jì)守坤等[12]的研究表明，公羔羊和母羔羊?qū)﹀i的維持需要量分別為0.29和0.22 g/d，折算成每千克飼糧干物質(zhì)大約分別為116和88 mg/kg。本研究通過(guò)體外瘤胃發(fā)酵技術(shù)探究35～70 mg/kg的甘氨酸錳對(duì)生長(zhǎng)期牦牛瘤胃發(fā)酵的影響，旨在得出生長(zhǎng)期牦牛飼糧中錳微量元素的適宜含量，進(jìn)而完善牦牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)，為科學(xué)地配制牦牛補(bǔ)飼飼糧提供理論依據(jù)，促進(jìn)牦牛產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)管理

選擇3頭健康、體況接近、裝有永久性瘤胃瘺管的大通閹牦牛作為試驗(yàn)動(dòng)物。試驗(yàn)飼糧包括精料和粗料(燕麥青干草)，精粗比60∶40，單頭飼喂，每日2次(08:00、18:00)，自由飲水。預(yù)飼15 d之后，清晨空腹采集瘤胃液。

1.2 發(fā)酵底物

參考我國(guó)《肉牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》(NY/T 815—2004)和文獻(xiàn)[13]，按照150 kg牦牛日增重500 g設(shè)計(jì)牦?；A(chǔ)飼糧，以燕麥青干草作為粗料，精粗比為60∶40，以此飼糧為發(fā)酵底物，發(fā)酵底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵底物組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共5個(gè)處理，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。以甘氨酸錳(由長(zhǎng)沙興嘉生物工程有限公司提供，純度為21%，產(chǎn)品編號(hào)2015071810)形式在發(fā)酵底物中添加錳，使錳含量分別達(dá)到35.00、40.00、50.00、60.00、70.00 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))，其他微量元素鐵、鋅、硒、銅的含量一致，分別為5.26、6.27、0.04、4.40 mg/kg(干物質(zhì)基礎(chǔ))。

1.4 體外瘤胃發(fā)酵

按照Menke等[14]的方法制備人工瘤胃液，按照表2中各溶液的配方分別配制微量元素溶液(A液)，緩沖液(B液)，常量元素溶液(C液)，指示劑和還原液。按照順序依次向2 L的玻璃廣口瓶中加入667 mL的超純水，0.17 mL的A液，333 mL的B液，333 mL的C液，1.70 mL的指示劑，67 mL的還原液，配制人工瘤胃液。30 mL人工瘤胃液和200 mg發(fā)酵底物共同裝入發(fā)酵管中，放入人工瘤胃培養(yǎng)箱，(39±0.5) ℃開(kāi)始發(fā)酵[15-16]，分別在培養(yǎng)2、4、6、8、12、14、16、24、30、36、48 h讀取每個(gè)發(fā)酵培養(yǎng)管的刻度并記錄。

表2 人工瘤胃液各單一溶液的配方

1.5 測(cè)定指標(biāo)與測(cè)定方法

1.5.1 錳含量的測(cè)定

錳含量參考GB/T 13885—2003[17]測(cè)定，使用TAS-990原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定發(fā)酵底物中微量元素錳含量。錳含量標(biāo)準(zhǔn)曲線為：

Abs=0.182 90Conc.+0.003 140 0
(r=0.999 7，n=4)。

式中：Conc.為錳含量(μg/mL)；Abs為279.5 nm處的吸光度值。

1.5.2 產(chǎn)氣量、pH、干物質(zhì)消失率(DMD)及微生物蛋白質(zhì)(MCP)和氨態(tài)氮(NH3-N)含量的測(cè)定

發(fā)酵底物產(chǎn)氣量和DMD采用以下公式計(jì)算：

產(chǎn)氣量(mL)=某時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)管
產(chǎn)氣量(mL)-對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)
空白管產(chǎn)氣量(mL)；DMD(%)=[(樣本DM重-殘?jiān)麯M重+
空白管DM重)/樣本DM重]×100。

發(fā)酵液pH的測(cè)定使用HANNA-HI221高精密酸度計(jì)進(jìn)行。發(fā)酵液MCP含量用南京建成生物研究所提供的試劑盒測(cè)定。發(fā)酵液NH3-N含量采用馮宗慈等[18]改進(jìn)的比色法測(cè)定。

1.5.3 甲烷產(chǎn)量、VFA含量的測(cè)定

甲烷產(chǎn)量參考文獻(xiàn)[19-20]測(cè)定，使用氣相色譜儀(GC-2014，日本島津公司)測(cè)定體外瘤胃發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體中的甲烷含量，進(jìn)而計(jì)算甲烷產(chǎn)量。測(cè)定條件：火焰氫離子檢測(cè)器(FID)，色譜柱為毛細(xì)管柱(FFAP,30.00 m×0.32 mm,0.50 μm)；色譜柱溫度為100 ℃，恒溫模式；汽化室溫度100 ℃；FID溫度110 ℃；進(jìn)樣量100 μL；載氣為高純氮?dú)?99.99%)，壓力0.7 MPa；氫氣壓力0.4 MPa，空氣壓力0.4 MPa；毛細(xì)管柱壓力65 kPa，分流比40∶1。

本試驗(yàn)所使用的甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體委托蘭州華特化工供應(yīng)站生產(chǎn)，氣體成分如表3所示。

表3 甲烷標(biāo)準(zhǔn)氣體成分

本試驗(yàn)所擬合的甲烷標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=249 833X+78 225.5(r=0.999)[Y為進(jìn)樣的峰面積，X為甲烷含量(mmol/L)]。

VFA含量參考文獻(xiàn)[21-22]測(cè)定。樣品的前處理：發(fā)酵液經(jīng)4層紗布過(guò)濾后，取5 mL于干凈的離心管中，3 000 r/min離心10 min，取上清液2 mL于離心管中，準(zhǔn)確加入0.2 mL、25%的偏磷酸溶液，混勻之后，靜置10 min充分反應(yīng)，之后在12 000 r/min、4 ℃的條件下離心10 min，轉(zhuǎn)移上清到新的離心管中，-80 ℃凍存，備用。

用氣相色譜儀測(cè)定VFA含量。測(cè)定條件：FID，色譜柱為毛細(xì)管柱(FFAP，30.00 m×0.32 mm，0.50 μm)；色譜柱升溫程序，初始60 ℃，以10 ℃/min升溫至120 ℃，保留2 min，以15 ℃/min升溫至180 ℃，保留5 min；汽化室溫度250 ℃；FID溫度250 ℃；進(jìn)樣量1 μL，載氣為高純氮?dú)?99.99%)，壓力0.7 MPa；氫氣壓力0.4 MPa，空氣壓力0.4 MPa，毛細(xì)管柱壓力0.6～0.8 MPa，分流比40∶1。本試驗(yàn)所擬合的VFA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)表4。

1.5.4 淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)、胰蛋白酶(TYS)和纖維素酶(CLS)活力的測(cè)定

AMS、LPS、TYS和CLS活力測(cè)定用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒。單位定義：每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物作用30 min，水解10 mg淀粉定義為1個(gè)AMS活力單位；每毫升含酶溶液在37 ℃下與底物反應(yīng)1 min，每消耗1 μmol底物定義為1個(gè)LPS活力單位；每毫升含酶溶液在pH 8.0、37 ℃的條件下，每分鐘使反應(yīng)體系的吸光度值變化0.003定義為1個(gè)TYS活力單位；每毫升含酶溶液每分鐘催化產(chǎn)生1 μg葡萄糖定義為1個(gè)CLS活力單位。

表4 VFA含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

Y為進(jìn)樣的峰面積，X為組分含量(mmol/L)。

Ywas peak area of sample， andXwas component content (mmol/L).

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)的初步整理，采用SAS 9.1.3軟件中ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較。試驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量、DMD及發(fā)酵液pH

從表5中可以看出，隨著錳含量的升高，產(chǎn)氣量呈現(xiàn)降低趨勢(shì)，發(fā)酵液pH呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，DMD呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。產(chǎn)氣量在錳含量為35.00 mg/kg時(shí)處于最高值73.80 mL，在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)處于次高值72.80 mL，錳含量為35.00、40.00、50.00和60.00 mg/kg時(shí)產(chǎn)氣量差異

不顯著(P>0.05)，但這4個(gè)處理均顯著高于錳含量為70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)。甲烷產(chǎn)量在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值8.01 mL，顯著高于錳含量為35.00、40.00和50.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。DMD在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值68.73%，顯著高于錳含量為35.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為40.00和50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵液pH在錳含量為70.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值7.49(P<0.05)，顯著高于錳含量為35.00和40.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為50.00和60.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。

表5 發(fā)酵底物錳含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量、甲烷產(chǎn)量、DMD及發(fā)酵液pH的影響

同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同或無(wú)小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same row, values with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), while with the same small or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.2 發(fā)酵液NH3-N和MCP含量

從表6中可以看出，隨著錳含量的升高，發(fā)酵液NH3-N和MCP含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵液NH3-N含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值10.60 mg/dL，顯著高于錳含量為50.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為35.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵液MCP含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值3.90 g/L，顯著高于錳含量為35.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。

表6 發(fā)酵底物錳含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵發(fā)酵液NH3-N和MCP含量的影響

2.3 發(fā)酵液消化酶活力

從表7中可以看出，隨著錳含量的升高，發(fā)酵液AMS、LPS、TYS活力呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵液CLS活力呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。發(fā)酵液AMS活力在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.51 U/mL，顯著高于錳含量為35.00、40.00和50.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵液LPS活力在錳含量為50.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.50 U/mL，顯著高于其他處理(P<0.05)，錳含量

為40.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)，但顯著高于錳含量為35.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)；發(fā)酵液TYS活力在錳含量60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值65.46 U/mL，顯著高于錳含量為35.00 mg/kg、70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為40.00 mg/kg、50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。發(fā)酵液CLS活力各處理間差異不顯著(P>0.05)，在錳含量為70.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值81.12 U/mL。

2.4 發(fā)酵液VFA含量

從表8中可以看出，隨著錳含量的升高，發(fā)酵液乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸的含量都呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。發(fā)酵液乙酸含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值47.12 mmol/L，顯著高于錳含量為50.00、60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為35.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵液丙酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05)，在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值19.45 mmol/L；發(fā)酵液異丁酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05)，在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.35 mmol/L；發(fā)酵液丁酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05)，在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值5.41 mmol/L；發(fā)酵液異戊酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05)，在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.96 mmol/L；發(fā)酵液戊酸含量各處理間差異不顯著(P>0.05)，在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值0.50 mmol/L；發(fā)酵液總揮發(fā)性脂肪酸含量在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值72.24 mmol/L，顯著高于錳含量為60.00和70.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為35.00和50.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)；發(fā)酵液乙酸/丙酸在錳含量為50.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最小值2.05，顯著低于錳含量為35.00、40.00和60.00 mg/kg時(shí)(P<0.05)，但與錳含量為70.00 mg/kg時(shí)差異不顯著(P>0.05)。

表8 發(fā)酵底物錳含量對(duì)體外瘤胃發(fā)酵發(fā)酵液VFA含量的影響

3 討 論

瘤胃發(fā)酵產(chǎn)氣量的多少反映飼糧的降解程度[23]，產(chǎn)氣量越高，表明飼糧發(fā)酵越充分，為機(jī)體提供的能量越多，越有利于動(dòng)物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中產(chǎn)氣量在錳含量為35.00 mg/kg時(shí)處于最高值，隨著錳含量的增加，產(chǎn)氣量逐漸降低，說(shuō)明錳含量越高，越不利于瘤胃發(fā)酵。甲烷產(chǎn)量在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最高值。產(chǎn)氣量降低，甲烷產(chǎn)量反而升高，意味著能量損失增大。在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)，甲烷產(chǎn)量達(dá)到最高，為8.01 mL，高效酸丙酸的含量達(dá)到最低，為12.71 mmol/L，乙酸/丙酸達(dá)到最大,為2.87，表明錳含量為60.00 mg/kg時(shí)不利于動(dòng)物生長(zhǎng)。從發(fā)酵液MCP含量結(jié)果來(lái)看，也恰恰證明了這一點(diǎn)，在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)，發(fā)酵液MCP含量較低，此時(shí)瘤胃微生物活力低。pH是瘤胃發(fā)酵的綜合反映，受發(fā)酵底物類型、有機(jī)酸沉淀等各種因素的影響[24]，只有當(dāng)pH處于正常范圍之內(nèi)，才能夠保證瘤胃發(fā)酵、飼料降解的正常進(jìn)行。本試驗(yàn)不同錳含量下體外瘤胃發(fā)酵后的發(fā)酵液pH在7.03～7.49，屬正常范圍(5.60～7.50)。

DMD直接反映飼糧在瘤胃中的降解程度。本試驗(yàn)中，DMD隨錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在錳含量為60.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值68.73%。由此可見(jiàn)，錳含量為60.00 mg/kg時(shí)最有利于飼料的降解。錳可以顯著促進(jìn)瘤胃微生物對(duì)纖維素的降解。Martinez等[25]研究表明，底物中錳含量為5.00～30.00 mg/L時(shí)，都能促進(jìn)瘤胃微生物降解纖維素，而其中錳含量為15.00 mg/L時(shí)效果最佳。黃靜龍[26]研究表明，40.00 mg/kg錳組的飼糧表觀消化率顯著高于120.00 mg/kg錳組和160.00 mg/kg錳組。DMD的結(jié)果與瘤胃消化道酶活力的測(cè)定結(jié)果基本吻合，發(fā)酵液AMS、LPS、TYS活力隨錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，只有發(fā)酵液CLS活力隨錳含量的升高呈現(xiàn)持續(xù)升高的趨勢(shì)，并且都在錳含量為40.00～60.00 mg/kg時(shí)處于較高水平。因此從瘤胃消化酶活力和DMD的角度看，當(dāng)錳的含量在40.00～60.00 mg/kg時(shí)，最有利于飼糧的降解。

NH3-N來(lái)源于飼糧中蛋白質(zhì)的降解，主要用于微生物合成MCP[27]，在瘤胃中基本處于動(dòng)態(tài)平衡。本試驗(yàn)中的發(fā)酵液NH3-N含量在6.42～10.60 mg/dL，都處于正常范圍(0.35～29.00 mg/dL[28-29])。發(fā)酵液NH3-N含量隨著錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，并且在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最高值。MCP提供了反芻動(dòng)物機(jī)體40%～60%的蛋白質(zhì)需要量。發(fā)酵液MCP含量隨著錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，且在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最大值。由此可見(jiàn)，錳含量為40.00 mg/kg時(shí)，最有利于NH3-N和MCP的形成。

VFA是反芻動(dòng)物重要的能量物質(zhì)，提供了反芻動(dòng)物60%～80%的消化能[30-31]。乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸、總揮發(fā)性脂肪酸的含量都隨著錳含量的升高呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，都在錳含量為40.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最高值，并且都在錳含量為35.00～50.00 mg/kg時(shí)處于較高水平。同時(shí)，對(duì)于反芻動(dòng)物來(lái)說(shuō)，為機(jī)體提供能量的物質(zhì)主要是來(lái)源于肝臟組織中糖異生作用產(chǎn)生的葡萄糖，而丙酸是糖異生作用的重要前體物質(zhì)，是一種高效酸，乙酸/丙酸越低，表明丙酸所占比例也越大，越利于反芻動(dòng)物的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)中乙酸/丙酸在錳含量為50.00 mg/kg時(shí)達(dá)到最低值2.05，最有利于瘤胃發(fā)酵過(guò)程中高效酸丙酸的生成。因此，從揮發(fā)性脂肪酸的角度看，當(dāng)錳含量為35.00～50.00 mg/kg時(shí)，有利于瘤胃發(fā)酵能量物質(zhì)的生成。

4 結(jié) 論

① 對(duì)于生長(zhǎng)期牦牛，若以甘氨酸錳作為錳元素添加形式，推薦牦牛飼糧錳含量在40.00～50.00 mg/kg，有利于瘤胃發(fā)酵和飼草料降解。

② 根據(jù)現(xiàn)有資料設(shè)定的牦牛飼糧中錳含量只有33.82 mg/kg，遠(yuǎn)低于牦牛對(duì)錳的需要量40.00～50.00 mg/kg，處于極度缺乏狀態(tài)，必須額外補(bǔ)充微量元素錳，才能改善牦牛瘤胃發(fā)酵，提高生長(zhǎng)性能。

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*Contributed equally

**Corresponding authors: HAO Lizhuang, associate professor, E-mail: lizhuanghao1122@foxmail.com; LIU Shujie, professor, E-mail: mkylshj@126.com