烏骨雞黑色素沉積機理及相關候選基因

彭燦陽 郭松長 柳 序 徐明明 曲湘勇

(湖南農業(yè)大學動物科學技術學院，湖南畜禽安全生產協(xié)同創(chuàng)新中心，長沙 410128)

烏骨雞因具有極高的營養(yǎng)價值及藥用價值而深受消費者青睞，消費者一般以烏骨雞烏色度的深淺來評判其品質的優(yōu)劣，而烏骨雞機體黑色素沉積的程度決定其烏色度的深淺。也有相關研究發(fā)現(xiàn)，烏骨雞的滋補作用主要基于其黑色素含量[1]。除了一般常規(guī)經濟性狀外，烏骨雞烏色度，即黑色素的沉積是選育工作的核心目標。黑色素是由黑色素細胞合成并運輸到細胞外，并在其附近組織中沉積。脊椎動物黑色素細胞源自于神經嵴，在胚胎發(fā)育早期成黑色素細胞由神經嵴細胞分化、遷移至體節(jié)中胚層，并進入外胚層形成表皮黑色素細胞，使得黑色素細胞在胚胎內能夠廣泛分布[2]。烏骨雞黑色素的沉積是受多因子共同調控的復雜過程。本文綜述了烏骨雞黑色素的發(fā)生、沉積規(guī)律及其候選基因的研究進展，以期為今后的相關研究工作提供參考。

1 成黑色素細胞的分化及遷移

在早期原腸胚階段神經系統(tǒng)形成時期，神經嵴細胞經背側途徑，沿體節(jié)和外胚層遷移，分化為成黑色素細胞，最后進入外胚層，在真皮層甚至表皮層形成黑色素細胞；后續(xù)研究又發(fā)現(xiàn)神經嵴干細胞分化為雪旺細胞前體，通過腹側途徑遷向皮膚，最終發(fā)育分化為黑色素細胞[3-4]。禽類軀干部神經細胞體外的培養(yǎng)結果表明，具有成黑色素潛質的神經嵴細胞要在6 h后才逐漸遷移[5]。雞胚胎發(fā)育第12～13期，神經嵴細胞開始遷移，在胚胎第20期，成黑色素細胞從神經嵴出發(fā)，開始背側遷移[6]。神經嵴細胞的遷移途徑、分化趨勢會受到其他各種因子的調控影響，繼而影響黑色素細胞的生成及在組織中的分布。某些因子對黑色素細胞的生成、遷移具有抑制作用。叉頭框(fork head box，F(xiàn)ox)家族成員之一FOxD3，是一種干細胞關鍵轉錄因子，能調控神經嵴細胞的生成、遷移和分化；研究還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxD3在雞神經管中異位表達，能抑制神經嵴和神經嵴分化衍生物的形成[7]，F(xiàn)oxD3還能抑制黑色素原的形成。Kos等[8]曾報道，F(xiàn)oxD3抑制神經嵴細胞向成黑色素細胞分化，并抑制成黑色素細胞的遷移。而黑色素細胞的生成及遷移也會受機體其他因子的促進；小眼畸形相關轉錄因子(microphthalmia transcription factor，Mitf)調控成黑色素細胞分化、發(fā)育，是神經嵴細胞定向發(fā)育分化成黑色素細胞發(fā)生標志之一；研究發(fā)現(xiàn)，Mitf通過其螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸拉鏈(basic helix-loop-helix leucine zipper，bHLHZip)結構識別位于靶基因啟動子區(qū)上高度保守的E盒子(E-box)或M盒子(M-box)序列，啟動下游靶基因的轉錄而參與黑色素細胞分化與發(fā)育[9]。配對框3(paired box，Pax3)轉錄因子對黑色素細胞的遷移、分化、抗凋亡等過程中也起到了重要的調控作用，神經細胞黏著分子1(neuralcell adhesion molecule 1，NCAM1)的主要作用是促進細胞間的黏附，而Pax3能直接抑制NCAM1的表達或間接使NCAM1在合成后迅速磷酸化后失去黏附功能，促進細胞的遷移[10-11]。Pax3與性別決定基因同源盒基因10(SRY-box containing gene 10，Sox10)協(xié)同作用促進Mitf的表達，促使黑色素細胞的分化；在胚胎期，Pax3通過抑制p53依賴性細胞凋亡，以保證黑色素細胞完成發(fā)育[12]。

成黑色素細胞的分化及遷移主要發(fā)生在胚胎期，黑色素細胞在動物機體的分布情況在一定程度上決定了動物機體黑色素的沉積量。田穎剛等[13]對泰和烏骨雞皮膚和肌肉組織進行切片、染色觀察發(fā)現(xiàn)，皮膚組織中黑色素細胞在真皮層分布密度大于表皮層；肌肉組織中黑色素細胞主要分布在肌外膜及部分肌束膜中，肌纖維中黑色素細胞分布較少，使得泰和烏骨雞胸肌肌肉外側比內部黑。蔣明[14]在廣西烏骨雞上也有同樣的發(fā)現(xiàn)。烏骨雞不同個體間烏色度的差異、不同組織中黑色素沉積量的差異，可能是由于黑色素細胞數量的差異所造成。影響機體中黑色素細胞數量的因素較多，其選育空間也較大，而烏骨雞黑色素細胞的增殖、衰老及不同生長周期組織中黑色素細胞的分布情況未見報道，有必要進行深入的研究，以期找到影響烏骨雞黑色素細胞分布的關鍵分子標記物，加快烏骨雞烏色度選育進程。

2 黑色素的合成及轉運

2.1 合成

黑色素小體是成熟的黑色素細胞合成與儲存黑色素的特定細胞器，包括合成黑色、棕色的真黑色素小體與合成紅色、黃色、褐色的偽黑色素小體。酪氨酸(tyrosine，Tyr)是黑色素合成的主要前體物質，在酪氨酸酶(tyrosinase，TYR)的作用下，催化形成多巴醌，再經一系列氧化、聚化反應形成多巴色素，多巴色素在酪氨酸相關蛋白2(tyrosinase-related proteins2，TYRP2)的作用下被羥化為5，6-二羥基吲哚-2-羧酸(5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid，DHICA)。DHICA有2種反應途徑，一是被酪氨酸相關蛋白1(tyrosinase-related protein 1，TYRP1)催化形成5，6-吲哚醌羧酸，5，6-吲哚醌羧酸是一種中等可溶的褐色物質；二是脫羧成5，6-二羥基吲哚(5,6-dihydroxyindole，DHI)，DHI再經過TYR的催化下快速氧化、聚合，形成5，6-吲哚醌，5，6-吲哚醌是一種高分子質量的可溶性暗褐色或黑色多聚物。5，6-吲哚醌羧酸和5，6-吲哚醌都是真黑色素。偽黑色素是一種含硫物質，與真黑色素合成不同，半胱氨酸(cysteine，Cys)或谷胱甘肽(glutataione，GSH)參與進來與多巴醌結合，經一系列反應生成偽黑色素[15]。

黑色素的合成要經過一系列復雜的反應過程，受到多種信號分子調控。TYR是黑色素合成的第一限速酶，TYR活性決定著黑色素合成的速度與產量，TYR活性低，會使過量的GSH參與黑色素的合成，形成大量偽黑色素。TYRP1和TYRP2與TYR有40%同源，在黑色素合成過程中也發(fā)揮重要的功能作用[16]。腺苷酸環(huán)化酶(adenylatecyclase，AC)通路是黑色素合成過程中的重要信號通路，α-黑色素細胞刺激素(α-melanocyte stimulating hormone，α-MSH)與黑色素皮質素受體1(melanocortin-1 receptor，MC1R)結合激活AC通路，使環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量提高，進而提高黑色素細胞TYR活性，促進黑色素合成[17-18]。鼠灰色蛋白(agouti signaling protein，ASIP)是MC1R拮抗劑，能與a-MSH競爭性結合MC1R，導致cAMP含量降低，TYR活性下降，偽黑色素生成量增多[19-20]。Mitf也能與TYR、TYRP1、TYRP2基因啟動子結合，刺激基因的表達，促進黑色素的合成。烏骨雞烏色度的深淺也由真黑色與偽黑色素的量決定，由此可知，提高TYR、TYRP1及TYRP2活性，可促進真黑色的生成量，提高烏骨雞烏色度。

2.2 轉運

黑色素細胞通過其樹突和細胞-細胞結構與周圍40多個角質形成細胞相互接觸形成1個黑色素單位，并向其輸送黑色素。黑色素的運輸實質是黑色素小體的轉運，包括細胞內的轉運及細胞間的轉運。細胞內的轉運指黑色素小體從細胞核周圍沿樹突運送至外圍活性區(qū)域，并將黑色素固定在細胞膜附近，此過程需要微管、微絲以及馬達蛋白的協(xié)同作用下完成[21]。微絲馬達蛋白首先要與黑色素小體固定，肌球蛋白利用水解三磷酸腺苷(ATP)產生的能量與微絲結合并向其鉤狀末端短程移動，三磷酸鳥苷結合蛋白(RAB27A)、肌球蛋白5a(myosin 5a，MYO5A)和黑素親和素(melanophilin，MLPH)形成復合結構連接肌球蛋白和黑色素小體，協(xié)助黑色素小體的轉運[22-24]。研究發(fā)現(xiàn)在這3種基因發(fā)生突變的小鼠體內，其黑色素細胞中黑色小體集聚在核周圍，無法達到細胞膜附近[25]。黑色素小體到達細胞膜附近后才能被轉運至周圍角質細胞，關于黑色素小體在細胞間轉運的形態(tài)和機制研究很少，其可能的方式有3種。第1種是基底角質細胞通過吞噬黑色素細胞的突出末端來獲得黑色素；第2種是黑色素細胞分泌黑色素胞及角質細胞的吞噬作用；第3種是2種細胞相互融合，形成共同通道轉運[26-27]，而有相關報道，黑色素小體轉運方式并不是單一的，而是幾種機制共同存在[28]。大量研究表明，黑色素運輸機制的障礙也是導致動物皮膚、被毛著色稀釋的主要原因[29-31]。Xu等[32]研究發(fā)現(xiàn)，安義瓦灰雞具有“五灰”表現(xiàn)型，即灰羽、灰腳、灰皮、灰喙和灰冠，此外其肌肉顏色和骨膜也呈現(xiàn)灰色，通過對“五灰”機制的研究，發(fā)現(xiàn)其主要原因是MLPH基因突變導致的黑色素轉運障礙。烏骨雞皮膚、肌肉黑色素深淺會直接影響其品質，而關于黑色素轉運對烏骨雞皮膚、肌肉黑色素沉積影響的報道還較少，有待進一步深入研究。

3 影響黑色素的相關基因

3.1 TYR基因家族

TYR、TYRP1、TYRP2和前黑色素小體蛋白17(pre-melanosomal prtein17，Pmel17)是TYR基因家族的4個成員，均來源于1個共同祖先基因。研究發(fā)現(xiàn)，家禽黑色羽毛中TYR基因的表達量顯著高于白色羽毛[33-34]。雞TYR基因是復等位基因，位于1號染色體的長臂4區(qū)4帶[35]。鄭嫩珠等[36]研究報道，在白絨烏骨雞皮膚、肌肉及內臟組織中，TYR基因的表達量與黑色素的含量呈顯著正相關，說明TYR基因的過度表達有利于黑色素的沉積。TYR基因在我國地方雞品種，尤其是烏骨雞中具有豐富的變異資源。陳志強等[37]在雞TYR基因上游調控區(qū)序列-641～-2 125 bp發(fā)現(xiàn)3個單核苷酸多態(tài)(SNP)位點，與雞的脛色和皮膚顏色顯著相關。TYRP1基因所編碼的TYRP1是一種跨膜糖蛋白，在內質網中合成并轉運至黑色素細胞內部。在人類研究中，TYR基因在黑膚色類型人的黑色素細胞中表達與白膚色類型人無顯著差異，而TYRP1基因的表達量有明顯提高[38]。Li等[39]研究發(fā)現(xiàn)TYRP1基因在黑馬中的表達量是灰馬6.54倍；劉薇[40]研究發(fā)現(xiàn)，在絲毛烏骨雞胚胎除眼睛外的組織中，黑色素可見的時間都晚于組織中TYRP1開始表達的時間。由此可見，TYRP1對黑色素的合成起重要作用。TYRP2又稱多巴色素異構酶(DT)，能使多巴色素轉化為DHICA，控制黑色素細胞中DHICA和DHI的比例，加速真黑色素的合成，是影響動物毛色的重要蛋白[41]。Pmel17基因編碼的蛋白質與TYR基因家族其他3個成員編碼的蛋白質的一級結構非常相似,故也將它作為TYR基因家族的第4個成員，參與黑色素生成途徑終末步驟的調節(jié)。Pmel17是在內質網中合成的Ⅰ型跨膜轉運糖蛋白，轉運到黑色素小體內，經前蛋白轉化酶及一系列酶參與的解朊作用裂解并組成淀粉樣纖維結構，促進黑色素小體結構的形成[42-43]，以利于黑色素的合成和沉積。Pmel17基因含11個外顯子，研究發(fā)現(xiàn)小鼠Pmel17基因1個終止密碼子突變[44]，以及1個單核苷酸插入造成額外12個氨基酸的突變[45]都可產生銀色毛表現(xiàn)型。馬Pmel17基因p.Arg618Cys位點突變也可產生銀色毛表型[46]；雞Pmel17基因p.R618C位點突變產生紅褐色羽毛表型、第10外顯子一個9 bp片段的插入會產生顯性白色羽毛表型[47]。Pmel17基因突變會影響黑色素小體的成熟，導致黑色素合成、沉積障礙，關于Pmel17基因對烏骨雞皮膚、肌肉組織中黑色素沉積的影響還未見報道，進一步的深入研究對了解烏骨雞黑色素沉積原理具有重要意義。

3.2 MC1R基因

雞MC1R基因由擴展黑色(extendeds black，E)位點所編碼[48]，是調節(jié)黑色素合成的關鍵基因。MC1R是位于黑色素細胞表面的G蛋白耦合受體，有7個跨膜結構域，為最小的G蛋白耦合受體，在AC通路中作為α-MSH的受體，對黑色素合成發(fā)揮重要作用[49]。鄭嫩珠等[33]研究MC1R基因在半番鴨和番鴨黑白羽中表達差異，結果顯示，MC1R基因在半番鴨黑羽中表達量是白羽的9.08倍，在番鴨黑羽中表達量是白羽中的3.13倍，而且差異都達到了極顯著的程度。杜曉明[50]研究相同日齡、生長環(huán)境和營養(yǎng)狀況下的黑色邊雞和灰白色邊雞皮膚、肝臟和羽髓組織中的MC1R基因的表達的情況，結果表明該基因在黑色邊雞中的以上各組織中表達量均顯著高于灰白雞。楊永升等[51]在雞MC1R基因的編碼區(qū)檢測到3個SNP，發(fā)現(xiàn)與膚色、肉色、脛色顯著相關；研究發(fā)現(xiàn)，雞MC1R基因的E92K和M7IT 2個位點突變會使雞產生全黑的羽毛，H215P位點突變會抑制黑色素沉積[52]。遲良等[53]利用反轉錄PCR克隆烏骨雞MC1R基因，結果顯示烏骨雞MC1R基因全長945 bp，編碼314個氨基酸，有4個明顯的突變位點，分別為M71T、E92K、S124G和H215P，推測S124G位點突變是造成烏骨雞烏皮、烏肉、烏骨，而具有純白色羽毛的原因，其具體機制有待進一步研究。

3.3 Mitf基因

Mitf基因是黑色素合成通路中的關鍵調控基因，不但影響黑色素細胞的分化和發(fā)育，還直接調控酪氨酸基因家族的表達，影響黑色素的生成[54]。Zhu等[55]研究發(fā)現(xiàn)Mitf基因在羊駝棕色被毛皮膚組織中的表達量顯著高于白色被毛皮膚；在鳥類中，Mitf基因表達量與羽色具有一定相關性。Li等[56]研究發(fā)現(xiàn)Mitf基因在鴨子的黑色毛球中有比較高的表達量，而在白色毛球中幾乎不表達；Minvielle等[57]研究發(fā)現(xiàn)，Mitf基因突變會導致純合子的日本鵪鶉表現(xiàn)為銀白羽色。Wang等[58]也發(fā)現(xiàn)Mitf基因編碼區(qū)1 109 bp位點上的堿基突變與浙東白鵝白羽性狀高度相關。鄭嫩珠等[59]克隆了白絨烏雞Mitf基因的cDNA序列，長度為1 431 bp，編碼468個氨基酸，并且發(fā)現(xiàn)，在白絨烏骨雞不同組織中，Mitf基因的表達量與黑色素含量呈顯著正相關，說明Mitf基因表達有助于烏骨雞黑色素沉積。

3.4 MLPH基因

MLPH參與黑色素細胞中成熟黑色素小體的轉運，使黑色素小體在黑色素細胞樹突末梢聚集，調控動物皮膚和被毛的顏色。MLPH基因的突變會導致色素沉著減少，出現(xiàn)被毛稀釋表現(xiàn)型。國內外大量研究發(fā)現(xiàn)，貓、狗、兔子、鵪鶉和美國水貂MLPH基因的突變，都導致毛色變淡，出現(xiàn)毛色稀釋表型[30-31，60-62]。劉杰等[63]研究發(fā)現(xiàn)，MLPH基因在20周齡浙東白鵝母鵝中的表達存在組織特異性，在黑化部位眼睛中表達量最高，在背部皮膚、腹部皮膚及腳蹼中表達量較低，而在心臟、肝臟等部位未檢測到表達，這種表達規(guī)律與鵝的黑色素沉著規(guī)律一致，進一步證明了MLPH基因與黑色素沉積有關。

4 小 結

烏骨雞是我國特有的地方雞品種，其最大的經濟與藥用價值在于黑色素的沉積。黑色素性狀的常規(guī)選育主要通過觀察(肉眼)烏色度深淺，進展較為緩慢，利用分子標記輔助選育十分必要。關于動物被毛黑色素沉積機理方面已有大量研究，在此基礎上，研究與烏骨雞黑色素沉積相關的基因具有重要意義。從黑色素細胞的發(fā)生、遷移，黑色素的合成、轉運，以及黑色素在組織中是否會發(fā)生降解等多個方面去研究影響烏骨雞烏色度的主要因素，探明基因調控黑色素沉積的具體機制，尋找影響烏骨雞黑色素沉積的主效基因及分子標記物，并在生產中利用分子標記物對黑色素性狀進行早期選擇，提高烏骨雞烏色度，加快選育進度。

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*Corresponding author, professor, E-mail: quxy99@126.com