腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和缺氧誘導(dǎo)因子-1α在宮頸鱗癌中表達(dá)及其臨床意義

劉苗苗,邱 剛,房保栓,張洪珍

(河北省人民醫(yī)院,河北 石家莊 050051)

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，僅在2012年全球就有大約52.8萬(wàn)例新發(fā)病例，并有26.6萬(wàn)人死亡，絕大多數(shù)的宮頸癌發(fā)生在發(fā)展中國(guó)家，同時(shí)也是這些國(guó)家腫瘤死因的主要原因[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤微環(huán)境在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要作用。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)是浸潤(rùn)在腫瘤間質(zhì)的巨噬細(xì)胞，其在多種實(shí)體腫瘤缺氧區(qū)域中聚集并在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮關(guān)鍵作用[2-3]。腫瘤微環(huán)境中，TAMs可以表達(dá)多種抗體，如CD68、CD163等。缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)是缺氧環(huán)境中處于核心地位的一種異源二聚體，由α和β這2個(gè)蛋白亞基組成，其中HIF-1α是缺氧組織中最重要的標(biāo)志物[4]。本研究運(yùn)用免疫組化法檢測(cè)了HIF-1α和CD68標(biāo)記TAMs在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)情況，并分析了二者的相關(guān)性，旨在進(jìn)一步分析二者在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為宮頸癌的治療提供依據(jù)。

1 臨床資料

1.1一般資料 收集2013年6月—2016年6月在河北省人民醫(yī)院婦科手術(shù)切除的宮頸癌組織標(biāo)本65例，均經(jīng)病理證實(shí)為宮頸鱗癌?；颊吣挲g35～82歲，中位年齡50歲；組織分級(jí)根據(jù)2003年世界衛(wèi)生組織腫瘤分化標(biāo)準(zhǔn)：高分化18例，中分化33例，低分化14例；TNM分期根據(jù)FIGO 2009臨床分期標(biāo)準(zhǔn)：ⅠA期13例，ⅠB期15例,ⅡA期15例,ⅡB期22例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例；有脈管癌栓35例，無(wú)脈管癌栓30例。所有病例有完整臨床病理資料且手術(shù)前未行放療、化療、生物治療等抗腫瘤治療。同時(shí)取20例患者的癌旁正常組織作為對(duì)照。

1.2主要試劑 兔抗人HIF-1α單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Epitomics生物公司，鼠抗人CD68單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abacm生物公司，SP檢測(cè)試劑盒、DAB 顯色試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3研究方法 采用免疫組化S-P法檢測(cè)癌組織標(biāo)本和癌旁正常組織標(biāo)本中CD68、HIF-1α表達(dá)情況，分析二者與臨床病理因素的關(guān)系和二者在宮頸癌組織中的表達(dá)相關(guān)性。組織標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，過(guò)氧化氫溶液除去內(nèi)源性氧化酶；滴加一抗，4 ℃過(guò)夜；次日滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，應(yīng)用DAB顯色，洗滌，蘇木精復(fù)染，脫水，透明，中性樹脂膠封片，鏡下觀察。用已知陽(yáng)性切片作陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.4結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 染色后所有切片均由2位病理科醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行讀片并判定結(jié)果:①HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色顆粒，根據(jù)其染色強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行評(píng)分判讀。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；按染色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)染色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩項(xiàng)積分相乘<1分為陰性，≥1分為陽(yáng)性。②CD68標(biāo)記TAMs陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)染成黃褐色或棕黃色顆粒，根據(jù)其染色強(qiáng)度及細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行評(píng)分判讀。按陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)比例計(jì)分：陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%計(jì)0分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占11%～25%計(jì)1 分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占26%～50%計(jì)2 分、陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)>50%計(jì) 3 分；按染色強(qiáng)度計(jì)分：細(xì)胞無(wú)顯色為 0 分，呈現(xiàn)淡黃色為 1 分，呈現(xiàn)棕黃色為 2 分，呈現(xiàn)深褐色為3 分。將兩者得分相加，總分<4 分定義為陰性，總分≥4 分定義為陽(yáng)性[5]。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料組間差異比較采用2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CD68和HIF-1α在宮頸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況 CD68陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞質(zhì)，宮頸鱗癌組織中CD68陽(yáng)性表達(dá)率為72.31%(47/65)，顯著高于癌旁正常組織的20.00%(4/20)(P<0.05)。HIF-1α陽(yáng)性染色主要位于細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)，宮頸鱗癌組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率為64.62%(42/65)，顯著高于癌旁正常組織的10.00%(2/20)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CD68和HIF-1α在宮頸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況 例

2.2CD68和HIF-1α表達(dá)與臨床病理特征間的關(guān)系 CD68和HIF-1α在宮頸鱗癌組織中的表達(dá)與組織分級(jí)、FIGO分期、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，而與年齡無(wú)關(guān)(P均>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 宮頸癌組織中CD68和HIF-1α蛋白表達(dá)與臨床病理之間的關(guān)系 例

2.3宮頸癌組織中CD68和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示，CD68和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 宮頸癌組織中CD68和HIF-1α表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討 論

宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，是一種早期就可出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的腫瘤[6]。腫瘤的生長(zhǎng)不僅受遺傳因素的影響，還受間質(zhì)炎癥細(xì)胞、血管等腫瘤微環(huán)境的影響。腫瘤微環(huán)境中浸潤(rùn)的大量炎癥細(xì)胞所致的腫瘤相關(guān)性炎癥在2011年被Hanahan等[7]納入新定義的腫瘤十大特征之一。腫瘤間質(zhì)的炎癥細(xì)胞主要包括TAMs、淋巴細(xì)胞和樹突細(xì)胞等，其中TAMs是數(shù)量最多的炎癥細(xì)胞。TAMs大部分是由血液循環(huán)中的單核細(xì)胞受到腫瘤分泌的趨化因子影響，被招募到腫瘤組織并分化為TAMs。巨噬細(xì)胞在不同的腫瘤微環(huán)境的作用下可以分化為2個(gè)不同亞型，即M1型和M2型[8]。M1型又稱為經(jīng)典活化型，主要參與炎癥反應(yīng)，是抗腫瘤免疫的重要組成部分。M2型又稱為替代活化型，主要發(fā)揮抗炎作用，為腫瘤的生長(zhǎng)提供有利條件。TAMs與M2型巨噬細(xì)胞功能更類似，其存在于多種實(shí)體腫瘤中，可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移，最終導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展[6]。何楠等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌組織中，TAMs相較于胃正常組織中浸潤(rùn)明顯增加，M2型TAMs可能是通過(guò)促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移影響患者的預(yù)后情況。李妍等[6]對(duì)宮頸癌的研究發(fā)現(xiàn)，TAMs計(jì)數(shù)升高的患者和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者預(yù)后不良。本研究發(fā)現(xiàn)，以CD68標(biāo)記TAMs在宮頸鱗癌組織中呈高表達(dá)，且低分化、高臨床分期、有脈管癌栓和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者的CD68陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于高分化、低臨床分期、無(wú)脈管癌栓和無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，但與患者年齡無(wú)關(guān)，說(shuō)明TAMs參與了腫瘤進(jìn)展過(guò)程，TAMs高表達(dá)患者可能預(yù)后較差。

HIF-1α是缺氧狀態(tài)下HIF-1的主要表達(dá)亞基，其參與腫瘤組織血管生成、缺氧時(shí)能量代謝，在促進(jìn)腫瘤發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[10]。俸瑞發(fā)等[11]研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α在乳腺癌組織中高表達(dá)，可以影響乳腺癌組織增生和血管生成，是預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組織中HIF-1α陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，提示HIF-1α與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)，這與樓夢(mèng)等[12]研究結(jié)果一致；且HIF-1α表達(dá)與組織分級(jí)、FIGO分期、脈管癌栓、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，HIF-1α高表達(dá)可以反映腫瘤具有高侵襲性，其可以作為宮頸癌發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)重要指標(biāo)。本研究還發(fā)現(xiàn)，宮頸鱗癌組織中CD68和HIF-1α表達(dá)呈正相關(guān)，表明腫瘤組織可能分泌趨化因子，導(dǎo)致單核細(xì)胞向腫瘤缺氧區(qū)域聚集，并向TAMs活化，但是其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

綜上所述，CD68和HIF-1α在宮頸鱗癌組織中均呈高表達(dá)，二者與腫瘤進(jìn)展、侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，是影響宮頸癌預(yù)后的重要因素，但具體機(jī)制尚需深入研究。

[1] 周暉,劉昀昀,林仲秋. 《2017 NCCN宮頸癌臨床實(shí)踐指南》解讀[J]. 中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志,2017，33(1):100-107

[2] 李海濤,譚超,田書梅,等. 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的作用新進(jìn)展[J]. 腫瘤防治研究,2015，42(11):1165-1168

[3] Wu H,Xu JB,He YL,et al. Tumor-associated macrophages promote angiogenesis and lymphangiogenesis of gastric cancer[J]. J Surg Oncol,2012,106(4):462-468

[4] Kim J,So D,Shin HW,et al. HIF-1alpha upregulation due to depletion of the free ubiquitin pool[J]. J Korean Med Sci,2015,30(10):1388-1395

[5] 王珊,王玲,曹娜娜,等. 食管鱗癌組織B7-H3和CD68表達(dá)及其臨床意義[J]. 中華腫瘤防治雜志,2015，22(9):666-669

[6] 李妍,郝權(quán). 高遷移率族蛋白1和腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞與宮頸癌淋巴管密度的相關(guān)性研究[J]. 中國(guó)腫瘤臨床,2014，41(4):222-226

[7] Hanahan D,Weinberg RA. Hallmarks of cancer: the next generation[J]. Cell,2011,144(5):646-674

[8] 吳婷,周武雄. 腫瘤微環(huán)境中腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的研究進(jìn)展[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2016，32(2):265-267

[9] 何楠,金倩娜,王笛,等. 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)胃癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響[J]. 中華胃腸外科雜志,2016,19(7):793-797

[10] Kaur B,Khwaja FW,Severson EA,et al. Hypoxia and the hypoxia-inducible-factor pathway in glioma growth and angiogenesis[J]. Neuro Oncol,2005,7(2):134-153

[11] 俸瑞發(fā),柏璐,劉曉萌,等. HIF-1α對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及血管生成影響的探討[J]. 中華腫瘤防治雜志,2013，20(15):1158-1161

[12] 樓夢(mèng),賈英. HIF-1α和miR-210在宮頸鱗癌中的表達(dá)及其相關(guān)性[J]. 重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2015，40(4):604-607