基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的吳茱萸-甘草配伍減毒化學(xué)成分研究

栗煥煥，張國琴，邱紫瑩，李 麗，任曉亮，劉亞男，竇志英

基于指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的吳茱萸-甘草配伍減毒化學(xué)成分研究

栗煥煥，張國琴，邱紫瑩，李 麗，任曉亮，劉亞男*，竇志英

天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 301617

研究吳茱萸與甘草配伍后發(fā)揮減毒作用的化學(xué)成分變化。采用HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的方法，研究甘草配伍對吳茱萸化學(xué)成分的影響，采用層次遞進(jìn)法進(jìn)一步研究甘草中3種主要成分配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響?；瘜W(xué)計量學(xué)結(jié)果表明，吳茱萸單煎液和吳茱萸-甘草藥對各自聚為一類，配伍后吳茱萸中多數(shù)化學(xué)成分的含量顯著降低（＜0.05），實現(xiàn)了吳茱萸配伍甘草前后成分的差異性分析，獲取了影響差異的重要化學(xué)成分；甘草組分配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響顯示，甘草3種主要成分均有不同程度的影響，其中甘草多糖、甘草酸的作用明顯，甘草苷對吳茱萸中化學(xué)成分的作用較小。所建立的指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法能夠?qū)崿F(xiàn)吳茱萸配伍甘草前后的區(qū)分，探討了吳茱萸-甘草配伍減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，為研究吳茱萸-甘草配伍的合理性提供了參考。

吳茱萸；甘草；配伍；減毒；指紋圖譜；化學(xué)計量學(xué)；甘草多糖；甘草苷；甘草酸

吳茱萸（EF）為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸(Juss.) Benth.、石虎(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang或疏毛吳茱萸(Juss.) Benth. var.(Dode) Huang的干燥近成熟果實[1]，具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎、抗腫瘤等多種藥理活性[2-4]，生物堿和苦味素類為其主要有效成分[5-8]。文獻(xiàn)記載吳茱萸有小毒，近年來臨床上關(guān)于吳茱萸不良反應(yīng)的報道日益增多，而生物堿類成分如吳茱萸堿、吳茱萸次堿是潛在的毒性成分[9-10]。甘味中藥能降低吳茱萸的毒性，甘草et（GRR）為臨床處方中使用頻率最高的藥物之一，前期研究結(jié)果顯示甘草對吳茱萸具有“減毒存效”的作用[11-14]。目前，以“甘緩”為切入點，系統(tǒng)研究甘味中藥對吳茱萸減毒作用的文獻(xiàn)極少，本研究采用中藥指紋圖譜與化學(xué)計量學(xué)相結(jié)合的方法[15-18]，以吳茱萸-甘草藥對為研究對象，研究甘草配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響，探究甘草對吳茱萸發(fā)揮減毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，并采用層次遞進(jìn)的方法研究甘草組分配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響，獲取配伍過程中對吳茱萸化學(xué)成分影響顯著的甘草成分，以期為甘味中藥的減毒作用研究提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，美國Agilent公司；Mili-Q Advantage A10超純水儀，美國Miliqore公司；DV215CD型十萬分之一天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher Scientific公司；FA2004型萬分之一天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；KDM型調(diào)溫電熱套，北京永興精佳儀器有限公司；XD-3200DTD型超聲清洗儀，南京先歐儀器制造有限公司；H2016D型高速離心機(jī)，上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司。

1.2 藥品與試劑

收集市售吳茱萸9批，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)專業(yè)馬琳教授鑒定為蕓香科吳茱萸屬植物吳茱萸(Juss.) Benth.的干燥近成熟果實，分別來自安徽、廣西、江西、四川、貴州，產(chǎn)地代碼為AH1、AH2、GX1、GX2、JX1、JX2、SC1、GZ1、GZ2，分別編號為S1～S9；甘草購自北京同仁堂藥店，經(jīng)鑒定為豆科甘草屬植物甘草Fisch.的干燥根和根莖。對照品吳茱萸堿（批號A1629030，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%）、吳茱萸次堿（批號B0605AS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）、檸檬苦素（批號D1216AS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞98%）購自大連美侖生物技術(shù)有限公司；對照品新綠原酸（批號DST190124-015，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、隱綠原酸（批號DST190824-035，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、咖啡酸（批號DST190517-013，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自成都德思特生物技術(shù)有限公司；對照品綠原酸（批號129Q-9GGW，質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.8%）購自中國食品藥品檢定研究院；對照品金絲桃苷（批號ZP0034，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、去氫吳茱萸堿（批號WP20382，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自天津萬象恒遠(yuǎn)科技有限公司；對照品甘草多糖（批號C13A9Y58599，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為95%）、甘草酸（批號C10199020，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93%）購自上海源葉生物科技有限公司；對照品甘草酸銨鹽（批號wkq19041108，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、甘草苷（批號wkq19030708，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）購自四川省維克奇生物科技有限公司；色譜純級甲醇、乙腈購自美國Sigma公司；色譜純級甲酸購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 甘草配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Waters X Select?HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液；梯度洗脫，上清液：0～20 min，7%～11%乙腈；20～23 min，11%～12%乙腈；23～35 min，12%～25%乙腈；35～40 min，25%乙腈；40～45 min，25%～40%乙腈；沉淀物：0～5 min，20%～30%乙腈；5～8 min，30%～52%乙腈；8～23 min，52%乙腈；23～30 min，52%～100%乙腈；全波長掃描確定最佳檢測波長：327 nm（上清液）、215 nm（沉淀物）；柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 分別稱取新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、金絲桃苷、去氫吳茱萸堿、檸檬苦素、吳茱萸堿、吳茱萸次堿對照品適量，精密稱定，置于量瓶中，甲醇溶解，配制成質(zhì)量濃度分別為1.58、1.54、1.59、0.27、0.47、0.81、2.68、1.15、0.83 mg/mL的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備

（1）單味中藥供試品溶液的制備：稱取吳茱萸藥材約2 g，料液比為1∶10，加水浸泡30 min，加熱回流提取1 h，濾過，4 ℃冰箱環(huán)境中靜置24 h，8000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液作為上清液層備用；取下層沉淀物，加2 mL乙醇超聲20 min溶解，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液作為沉淀物層備用。

（2）配伍藥對供試品溶液的制備：稱取吳茱萸和甘草藥材各約2 g，料液比為1∶10（另加甘草的吸水量3 mL），浸泡30 min，加熱回流1 h，濾過，4 ℃冰箱環(huán)境中靜置24 h，8000 r/min離心15 min，上清液過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液作為上清液層備用；取下層沉淀物，加2 mL乙醇超聲20 min溶解，過0.22 μm濾膜，取續(xù)濾液作為沉淀物層，備用。

2.1.4 方法學(xué)考察

（1）精密度實驗：取吳茱萸樣本JX1作為供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，以分離度好、且信號響應(yīng)較高的9個成分峰（上清液中6、13、14、16、21號峰，沉淀物中26、29、32、34號峰）為指標(biāo)，計算保留時間和峰面積的RSD值。結(jié)果各成分峰保留時間的RSD%＜2.0%，峰面積RSD%＜4.0%，表明儀器精密度良好。

（2）重復(fù)性實驗：取吳茱萸樣本JX1，按“2.1.3”項下供試品溶液的制備方法平行制備6份，按“2.1.1”項下色譜條件分析并記錄色譜圖。以分離度好、且信號響應(yīng)較高的9個成分峰（上清液中6、13、14、16、21號峰，沉淀物中26、29、32、34號峰）為指標(biāo)，計算保留時間和峰面積的RSD值。結(jié)果各成分峰保留時間的RSD＜1.0%，峰面積RSD＜3.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

（3）穩(wěn)定性試驗：取吳茱萸樣本JX1作為供試品溶液，室溫條件下放置，按“2.1.1”項下色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，分析并記錄色譜圖，以分離度好、且信號響應(yīng)較高的9個成分峰（上清液中6、13、14、16、21號峰，沉淀物中26、29、32、34號峰）為指標(biāo)，計算保留時間和峰面積的RSD值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)各成分峰保留時間的RSD＜1.0%，峰面積RSD＜2.0%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 甘草配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響 將9批吳茱萸及吳茱萸-甘草藥對按“2.1.1”項下色譜條件分別檢測上清液及沉淀物中成分，得到吸收強(qiáng)、特征明顯且穩(wěn)定性好的34個色譜峰作為共有峰，并對色譜峰進(jìn)行指認(rèn)。吳茱萸-甘草藥對供試品溶液和混合對照品溶液HPLC色譜圖如圖1所示，9批不同產(chǎn)地吳茱萸樣品的指紋圖譜如圖2所示。

6-新綠原酸 13-綠原酸 14-隱綠原酸 16-咖啡酸 21-金絲桃苷 26-去氫吳茱萸堿 29-檸檬苦素 32-吳茱萸堿 34-吳茱萸次堿

圖2 9批不同產(chǎn)地吳茱萸樣品HPLC指紋圖譜

以共有峰的峰面積作為分析變量，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）對9批吳茱萸及吳茱萸-甘草藥對進(jìn)行分類分析，評價配伍前后吳茱萸中成分變化，結(jié)果如圖3所示。提取6個主成分建立PCA模型，累積貢獻(xiàn)率2cum為0.881，2cum為0.783，說明模型性能良好，能夠反映大部分特征峰的信息，其中前2個主成分的解釋能力分別為34.1%和19.6%。由PCA得分圖可知，吳茱萸單煎液樣品相互靠近，為一類；吳茱萸-甘草藥對樣品相互靠近，為另一類；圖3-b表明吳茱萸單煎液與PC1呈負(fù)相關(guān)，吳茱萸-甘草藥對樣品與PC1呈正相關(guān)，表明2組間樣本的差異明顯，配伍前后吳茱萸中化學(xué)成分的含量發(fā)生了明顯變化。

以相對峰面積標(biāo)示含量，對吳茱萸所含化合物在單煎液與藥對提取物中的含量進(jìn)行檢驗比較分析，計算值。分別以含量顯著增加（＜0.05）、無顯著性變化（＞0.05）以及顯著降低（＜0.05）的成分?jǐn)?shù)量與所測成分的總個數(shù)的百分比進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果見表1。火山圖（volcano plot）是一種在分子生物學(xué)研究中用以分析兩樣本間顯著差異的散點圖，以變量變化倍數(shù)（fold change）的對數(shù)［log2(fold change)］為橫坐標(biāo)，以檢驗顯著性檢驗值的負(fù)對數(shù)（?lg）為縱坐標(biāo)。為了更直觀地反映每個化合物的含量變化，繪制吳茱萸中各成分含量的火山圖，結(jié)果見圖4。以＝0.05和log2(fold change)＝0為界，該圖被分為3個模塊，＜0.05且log2(fold change)＜0即紅色的點，代表該成分在藥對提取液中的含量顯著降低；＜0.05且log2(fold change)＞0即綠色的點，代表該成分在藥對提取液中的含量顯著增加，無顯著性變化（＞0.05）為黑色的點。結(jié)果顯示了配伍前后吳茱萸的化學(xué)成分含量變化情況，表明多數(shù)化合物在藥對配伍提取物中的含量與吳茱萸單煎液相比呈顯著降低的現(xiàn)象。

S代表吳茱萸生品的不同批次，共9批，每批平行制備3個樣品，每個樣品重復(fù)進(jìn)樣3次

表1 吳茱萸配伍前后化學(xué)成分含量變化情況

Table 1 Changes of chemical components in EF before and after compatibility

樣品占比/% 變小（P＜0.05）不變（P＞0.05）變大（P＜0.05） S144.1238.2417.65 S244.1235.2920.59 S341.1841.1817.65 S435.2932.3532.35 S547.0623.5329.41 S655.8826.4717.65 S744.1238.2417.65 S844.1220.5935.29 S935.2929.4135.29

圖4 吳茱萸化學(xué)成分含量火山圖

為進(jìn)一步考察甘草配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的變化情況，以相對峰面積標(biāo)示含量，將9批吳茱萸單煎液及吳茱萸-甘草藥對的34個單體成分分別計算平均含量，并繪制散點圖，如圖5所示。圖中展示了9批吳茱萸中34個單體成分在配伍前后的變化情況，每組數(shù)據(jù)中的不同點代表1個化學(xué)成分的平均含量，彼此之間的距離越近說明樣品間差距越小，由圖可知化學(xué)成分4、6（新綠原酸）、7、12、13（綠原酸）、14（隱綠原酸）、20、26（去氫吳茱萸堿）、32（吳茱萸堿）和34（吳茱萸次堿）在配伍前后表現(xiàn)出較大的變化，說明配伍過程中甘草對其影響較大，其中吳茱萸堿和吳茱萸次堿與甘草配伍后呈含量降低的趨勢。

圖5 吳茱萸配伍前后化學(xué)成分平均含量分布散點圖(n = 9)

2.2 甘草中甘草多糖、甘草酸、甘草苷的含量測定

2.2.1 甘草中甘草多糖的測定

（1）硫酸-蒽酮試劑的制備：取蒽酮0.02 g，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入濃硫酸溶解并定容，即得硫酸-蒽酮試劑溶液，臨用前配制。

（2）甘草多糖的檢測條件：取0.1 mL供試品溶液，置于離心管中，冰水浴中緩緩滴入0.25 mL硫酸-蒽酮溶液，搖勻，置于沸水浴15 min，冰水浴冷卻，用蒸餾水作空白對照，630 nm（全波長掃描后確定最佳檢測波長）下測得吸光度（），計算甘草多糖含量。

（3）供試品溶液的制備：取甘草粉末（過3號篩）約1.0 g，精密稱定，置于50 mL錐形瓶中，加無水乙醇20 mL，超聲30 min，濾過，棄去濾液，揮干溶劑，回收濾渣，加水50 mL，超聲提取40 min，補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過得濾液，取1 mL溶液稀釋至5 mL量瓶，即得甘草多糖供試品溶液。

（4）對照品溶液的制備：取無水葡萄糖對照品50 mg，精密稱定，置于50 mL量瓶中，加蒸餾水溶解并定容，搖勻，即得1 mg/mL的葡萄糖參考儲備液。

（5）葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：分別精密量取葡萄糖參考溶液0、2、3、4、6、8、10 mL置于10 mL量瓶中，分別加蒸餾水定容至刻度。按照“2.2.1”項下甘草多糖的檢測條件操作。以葡萄糖溶液質(zhì)量濃度）為橫坐標(biāo)（），值為縱坐標(biāo)（）進(jìn)行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為＝0.783 4＋0.029 4，＝0.996 2，線性范圍為0.203～1.016 mg/mL。

2.2.2 甘草中甘草苷、甘草酸的測定

（1）色譜條件：色譜柱為Waters X Select?HSS T3（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈- 0.05%磷酸水溶液；梯度洗脫：0～10 min，22%乙腈；10～13 min，22%～48%乙腈；13～20 min，48%～54%乙腈；全波長掃描確定最佳檢測波長：237 nm；柱溫35 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖6。

（2）供試品溶液的制備：取過3號篩的甘草粉末約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，為最大限度地提取甘草中的甘草苷和甘草酸，使用70%乙醇作為提取溶劑，精密加入70%乙醇25 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷，70%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖6 甘草及甘草苷、甘草酸對照品HPLC圖

（3）對照品溶液的制備：取甘草苷和甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%乙醇，制成質(zhì)量濃度分別為0.265、0.255 mg/mL的對照品溶液（甘草酸質(zhì)量＝甘草酸銨質(zhì)量/1.020 7）。

2.2.3 含量測定 分別參照“2.2.1”“2.2.2”項下方法測定甘草中甘草多糖、甘草苷和甘草酸的含量，結(jié)果分別為（188.88±9.52）、（6.08±0.06）、（21.23±0.37）mg/g（＝6）。

基于甘草中3種主要成分的含量測定結(jié)果，開展吳茱萸與甘草中3種主要成分的配伍研究。

2.3 吳茱萸與甘草中3種主要成分的配伍研究

2.3.1 色譜條件 色譜條件及方法學(xué)考察參照“2.1.1”及“2.1.4”項下相關(guān)操作。

2.3.2 溶液的制備 單味中藥供試品溶液的制備參照“2.1.3”項下相關(guān)操作。

（1）吳茱萸與甘草多糖配伍溶液的制備：稱取吳茱萸藥材約2 g，甘草多糖約400 mg（以“2.2.3”項下甘草多糖的測定結(jié)果為參考），料液比為1∶10，按“2.1.3”項下制備供試品溶液。

（2）吳茱萸與甘草苷配伍溶液的制備：稱取吳茱萸藥材約2 g，甘草苷約13 mg（以“2.2.3”項下甘草苷的測定結(jié)果為參考），料液比為1∶10，按“2.1.3”項下制備供試品溶液。

（3）吳茱萸與甘草酸配伍溶液的制備：稱取吳茱萸藥材約2 g，甘草酸約45 mg（以“2.2.3”項下甘草酸的測定結(jié)果為參考），料液比為1∶10，按“2.1.3”項下制備供試品溶液。

2.3.3 吳茱萸-甘草多糖配伍研究 本實驗從9批吳茱萸中隨機(jī)抽取2批（S1、S3）作為樣本分別與甘草多糖進(jìn)行配伍，每批樣品平行9份。以共有峰的峰面積作為分析變量，采用PCA評價甘草多糖配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響，結(jié)果如圖7所示。提取7個主成分建立PCA模型，2cum為0.933，2cum為0.689，吳茱萸單煎液與吳茱萸-甘草多糖溶液可得到明顯區(qū)分，表明甘草多糖配伍吳茱萸對吳茱萸中化學(xué)成分具有顯著作用。

圖7 吳茱萸及吳茱萸-甘草多糖PCA 2D得分圖

正交偏最小二乘法-判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）是在PLS-DA基礎(chǔ)上發(fā)展的一種算法，用于建立表達(dá)量與樣品類別間的關(guān)系模型。與PLS-DA相比，OPLS-DA利用正交信號矯正過濾原理，濾過掉不相關(guān)信息，從正交預(yù)測變量中收集出對預(yù)測有用的變量，更好地區(qū)分組間差異并尋找差異性化合物，提高模型的預(yù)測結(jié)果[19-21]。

根據(jù)PCA聚類結(jié)果，按照配伍與否將吳茱萸樣本分為2類，建立OPLS-DA模型。在OPLS-DA模型中，1個預(yù)測主成分和2個正交主成分對模型解釋能力貢獻(xiàn)率為69.2%，2cum為0.987，2cum為0.979，說明所建立模型性能良好。圖8-a為第1主成分（t[1]）、第1正交主成分（to[1]）和第2正交主成分（to[2]）的三維得分圖，分別解釋變量的31%、27.2%和10.9%。36個吳茱萸樣本可分為2類，與PCA分析結(jié)果一致，模型可靠。為尋找分類過程中的潛在化學(xué)標(biāo)記物，對34個變量進(jìn)行分析并生成VIP圖和Loadings圖。圖8-b選取VIP值大于1的變量作為潛在化學(xué)標(biāo)記物，可得到變量1～3、5、4、26（去氫吳茱萸堿）、10、8、28、24、18、32（吳茱萸堿）、34（吳茱萸次堿）、13，說明這些變量在吳茱萸與甘草的配伍過程中變化明顯，對吳茱萸的分類起主要作用。圖8-c中每個代表1個變量，虛擬變量代表樣品組別，圖中SM2.DA(1)為吳茱萸單煎液樣品組，SM2.DA(2)為吳茱萸-甘草多糖樣品組，靠近虛擬變量并且距離載荷圖原點越遠(yuǎn)的變量，對于分類過程中的累積貢獻(xiàn)率越大，在分類中起的作用越大。變量5、8、3、2、10、4靠近SM2.DA(1)且遠(yuǎn)離原點，說明這些變量在吳茱萸單煎液樣品組中具有重要影響；變量1、26（去氫吳茱萸堿）、28、24、32（吳茱萸堿）、34（吳茱萸次堿）靠近SM2.DA(2)且遠(yuǎn)離遠(yuǎn)點，說明這些變量在吳茱萸-甘草多糖樣品組中具有重要影響。綜上，在配伍過程中甘草多糖主要影響吳茱萸中變量1、26（去氫吳茱萸堿）、28、24、32（吳茱萸堿）、34（吳茱萸次堿）。

2.3.4 吳茱萸-甘草酸配伍研究 以共有峰的峰面積作為分析變量，采用PCA對2批吳茱萸單煎液及吳茱萸-甘草酸提取液中化學(xué)成分進(jìn)行分析，評價甘草酸配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響，結(jié)果如圖9所示。提取5個主成分建立PCA模型，2cum＝0.887，2cum＝0.710，吳茱萸單煎液與吳茱萸-甘草酸配伍提取液可得到明顯地區(qū)分，表明甘草酸配伍吳茱萸對吳茱萸中化學(xué)成分具有顯著影響。

圖9 吳茱萸及吳茱萸-甘草酸PCA 2D得分圖

根據(jù)PCA聚類結(jié)果，按照配伍與否將吳茱萸樣本分為2類，建立OPLS-DA模型。在OPLS-DA模型中，1個預(yù)測主成分和2個正交主成分對模型解釋能力貢獻(xiàn)率為64.2%，2cum為0.981，2cum為0.967，說明所建立模型性能良好。圖10-a為第1主成分（［t1］）、第1正交主成分（［to1］）和第2正交主成分（［to2］）的三維得分圖，分別解釋變量的29.6%、24.2%和10.4%。36個吳茱萸樣本在空間模型中可分為2類。為尋找分類過程中的潛在化學(xué)標(biāo)記物，對34個變量進(jìn)行分析并生成VIP圖和Loadings圖。圖10-b為VIP圖，選取VIP值大于1的變量作為分類過程中的重要化學(xué)標(biāo)記物，可得到變量3、2、4、20、12、26（去氫吳茱萸堿）、17、25、16（咖啡酸）、11、5、28、1，說明這些變量在吳茱萸甘草酸的配伍過程中變化明顯，對分類起主要作用。圖10-c為Loadings圖，圖中SM2.DA(1)為吳茱萸單煎液樣品組，SM2.DA(2)為吳茱萸-甘草酸樣品組，變量20、12、17、25靠近SM2.DA(1)且遠(yuǎn)離原點，說明這些變量在吳茱萸單煎液樣品組中具有重要影響；變量3、2、4、26（去氫吳茱萸堿）、11靠近SM2.DA(2)且遠(yuǎn)離原點，說明這些變量在吳茱萸-甘草酸樣品組中具有重要影響。

2.3.5 吳茱萸-甘草苷配伍研究 以共有峰的峰面積作為分析變量，采用PCA對2批吳茱萸及吳茱萸-甘草苷樣品進(jìn)行分析，評價配伍前后吳茱萸的成分變化，結(jié)果如圖11所示。雖然吳茱萸單煎液樣品組和吳茱萸-甘草苷樣品組存在著差異，但是吳茱萸樣品之間的差異明顯大于配伍前后的差異。結(jié)果表明，甘草苷在配伍過程中對吳茱萸的影響較小。

圖11 吳茱萸及吳茱萸-甘草苷PCA 2D得分圖

綜上所述，甘草中3種主要成分配伍吳茱萸，均可對吳茱萸中化學(xué)成分產(chǎn)生不同程度的影響，其中甘草多糖、甘草酸對吳茱萸中化學(xué)成分的作用較顯著。

3 討論

本實驗采用HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)分析，研究吳茱萸甘草配伍減毒的物質(zhì)基礎(chǔ)，實現(xiàn)了配伍前后的差異性分析，獲取了影響差異的重要化學(xué)成分。結(jié)果表明，吳茱萸中活性成分吳茱萸堿和吳茱萸次堿與甘草配伍后呈含量降低的趨勢。進(jìn)一步采用層次遞進(jìn)法，基于對甘草中甘草多糖、甘草酸和甘草苷3種主要有效成分的定量結(jié)果，研究甘草組分配伍對吳茱萸中化學(xué)成分的影響，結(jié)果顯示，甘草中3種主要成分對吳茱萸的化學(xué)成分均具有不同程度的影響，其中發(fā)揮作用的主要甘草組分為甘草多糖、甘草酸；甘草苷對吳茱萸中化學(xué)成分的作用較小。

甘草多糖[22-23]主要由葡萄糖、阿拉伯糖和半乳糖組成，至少有3種主要的核心結(jié)構(gòu)，分別是以葡萄糖為主鏈，完全由-葡萄糖單位通過α-(1,4)鍵連接的單一葡萄糖結(jié)構(gòu)；以β-1,3--半乳糖組成1個主鏈，支鏈由β-1,6--半乳糖殘基組成的結(jié)構(gòu)；由β-1,3--半乳糖組成1個主鏈，在主鏈所有半乳糖單元的6位帶有1個由α-1,5-連接的-阿拉伯糖殘基側(cè)鏈的結(jié)構(gòu)。甘草酸[17]屬于齊五環(huán)三萜的酸性皂苷，是由苷元上C3-OH與吡喃糖醛酸的端基C原子縮合而成，結(jié)構(gòu)上具有兩親性。甘草苷是甘草中含量較高的黃酮類成分之一。推測可能是吳茱萸中的生物堿與甘草化學(xué)成分中的羥基等極性基團(tuán)結(jié)合，緩和了吳茱萸的毒性，進(jìn)而發(fā)揮“甘”緩之性以達(dá)到減毒的作用。本實驗從配伍方面探討了甘草對吳茱萸的作用規(guī)律，初步探討了甘味中藥緩急、佐制的作用，但具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步加以驗證。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典[S]. 一部. 2020: 178.

[2] 龔慕辛, 王智民, 張啟偉, 等. 吳茱萸有效成分的藥理研究進(jìn)展 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2009, 20(2): 183-187.

[3] 戰(zhàn)光緒, 吳大正, 胡之璧. 吳茱萸有效成分的藥理研究進(jìn)展 [J]. 上海中醫(yī)藥雜志, 2006, 40(2): 62-64.

[4] Zhang T, Qu S N, Shi Q,. Evodiamine induces apoptosis and enhances TRAIL-induced apoptosis in human bladder cancer cells through mTOR/S6K1-mediated downregulation of Mcl-1 [J]., 2014, 15(2): 3154-3171.

[5] 龍明立, 張毅民, 賀麗平, 等. 吳茱萸次堿的藥理學(xué)研究進(jìn)展 [J]. 解放軍藥學(xué)學(xué)報, 2008, 24(6): 528-531.

[6] 黃偉, 趙燕, 孫蓉. 吳茱萸不同組分對小鼠急性毒性試驗比較研究 [J]. 中國藥物警戒, 2010, 7(3): 129-134.

[7] 羅丹, 顏行. 吳茱萸次堿: 一種多靶點天然化合物的藥理學(xué)作用研究進(jìn)展 [J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2018, 30(12): 2207-2213.

[8] 余奇, 郭澄, 程澤能. 吳茱萸次堿的研究進(jìn)展 [J]. 藥學(xué)實踐雜志, 2007, 25(6): 353-357.

[9] 蔡雪映, 孟楠, 楊冰. 服用吳茱萸過量致中毒1例分析 [J]. 北京中醫(yī), 2006, 25(3): 171-172.

[10] Wen B, Roongta V, Liu L L,. Metabolic activation of the indoloquinazoline alkaloids evodiamine and rutaecarpine by human liver microsomes: Dehydrogenation and inactivation of cytochrome P450 3A4 [J]., 2014, 42(6): 1044-1054.

[11] 張智華, 韓晗, 吳曉豐, 等. 吳茱萸常用藥對及其配伍增效減毒 [J]. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報, 2018, 20(3): 51-54.

[12] 姜雪, 孫森鳳, 王悅, 等. 甘草藥理作用研究進(jìn)展 [J]. 化工時刊, 2017, 31(7): 25-28.

[13] 李媛媛, 司國民, 曲夷. 經(jīng)方中吳茱萸配伍應(yīng)用規(guī)律探析 [J]. 吉林中醫(yī)藥, 2019, 39(9): 1229-1232.

[14] 孫子洲, 曹蘭秀. 吳茱萸常用對藥配伍探析 [J]. 環(huán)球中醫(yī)藥, 2020, 13(1): 64-66.

[15] 趙娟, 謝世靜, 趙興華, 等. 中藥指紋圖譜質(zhì)控方法研究進(jìn)展 [J]. 云南中醫(yī)中藥雜志, 2020, 41(1): 82-86.

[16] 張雪, 楊雨婷, 董艷紅, 等. 中藥配伍減毒增效的研究概況 [J]. 中國民族民間醫(yī)藥, 2015, 24(21): 19-20.

[17] 孫立麗, 王萌, 任曉亮. 化學(xué)模式識別方法在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用進(jìn)展 [J]. 中草藥, 2017, 48(20): 4339-4345.

[18] 于洋, 李軍, 李寶國. 化學(xué)計量學(xué)在中藥質(zhì)量控制研究中的應(yīng)用 [J]. 中成藥, 2018, 40(5): 1139-1142.

[19] 吳勝鴻, 黃圓圓, 周欣, 等. 痔炎消顆粒HPLC指紋圖譜研究 [J]. 中藥新藥與臨床藥理, 2020, 31(1): 90-95.

[20] 周欣, 張琳, 毛嬋, 等. 基于化學(xué)計量學(xué)方法結(jié)合正交偏最小二乘判別分析的陳皮飲片HPLC指紋圖譜研究 [J]. 中草藥, 2019, 50(9): 2194-2200.

[21] Máquina A D V, Sitoe B V, de Oliveira Cruz W,. Analysis of1H NMR spectra of diesel andbiodiesel mixtures using chemometrics tools to evaluate the authenticity of a Brazilian standard biodiesel blend [J]., 2020, 209: 120590.

[22] 馬鴻雁, 鄧雨嬌, 馬倩, 等. 甘草的研究概況 [J]. 中藥與臨床, 2018, 9(1): 59-62.

[23] 孫琛. 甘草的化學(xué)成分研究進(jìn)展 [J]. 科技資訊, 2020, 18(2): 64-65.

Study on attenuating chemical compositions of-etcompatibility based on fingerprints coupled with chemometrics

LI Huan-huan, ZHANG Guo-qin, QIU Zi-ying, LI Li, REN Xiao-liang, LIU Ya-nan, DOU Zhi-ying

School of Chinese Materia Medica, Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China

To study the changes in chemical composition of reducing toxicity of Wuzhuyu (, EF) through compatibility with Gancao (et, GRR).HPLC fingerprint combined with chemometric methods were used to study the effects of GRR compatibility on the chemical components of EF, then the hierarchical progressive method was used to further study the influence of the three main components of GRR on the chemical composition of EF.The stoichiometric results showed that the single decoction of EF and the decoction of EF-GRR were clustered into one group respectively. The content of most chemical components in EF was significantly reduced after compatibility (< 0.05), which realized the difference analysis before and after the compatibility of EF with GRR and obtained the important chemical components that affect the difference. The effect of the three main components of GRR on the chemical components of EF showed that they had different degrees of influence, among which glycyrrhiza polysaccharide and glycyrrhizic acid had obvious effects, while glycyrrhizin had little effect.The established fingerprint combined with chemometric methods can realize the differentiation before and after the compatibility of EF with GRR, discuss the material basis of the EF-GRR compatibility, and provide reference for studying the rationality of the EF-GRR compatibility.

;et; compatibility; detoxification; fingerprint; chemometrics; glycyrrhiza polysaccharide; glycyrrhizin; glycyrrhizic acid

R283.1

A

0253 - 2670(2022)06 - 1730 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.06.015

2021-09-14

國家自然科學(xué)基金青年基金項目（81803955）

栗煥煥（1990—），女，博士，研究方向為中藥分析。Tel: 18526063647 E-mail: lihuanhuan9282@163.com

劉亞男，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制及中藥分析研究。E-mail: tianyinan2007@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]