人卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞關(guān)系的研究進(jìn)展

毛曉燕 綜述， 丘 瑾 審校

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200072； 2. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬同仁醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 200050)

哺乳動(dòng)物的卵母細(xì)胞與相鄰的體細(xì)胞之間以相互依賴的方式生長(zhǎng)發(fā)育。卵巢顆粒細(xì)胞是卵泡中圍繞在卵母細(xì)胞周圍的體細(xì)胞，當(dāng)卵泡形成竇腔時(shí)，顆粒細(xì)胞會(huì)分化成兩種解剖學(xué)和功能學(xué)不同的細(xì)胞譜系： 壁顆粒細(xì)胞(mural granulose cell, MGC),排列在毛囊壁上,主要功能是合成類固醇激素并促進(jìn)卵泡壁破裂；卵丘細(xì)胞(cumulus cell, CC),卵丘細(xì)胞具有高度特異性的跨細(xì)胞質(zhì)突起，其尖端通過(guò)透明帶突出，通過(guò)間隙連接與卵母細(xì)胞膜直接接觸，形成卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(cumulus-oocyte complex, COC)。一般而言，卵丘細(xì)胞負(fù)責(zé)收集細(xì)胞增殖與代謝相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物，而顆粒細(xì)胞則負(fù)責(zé)細(xì)胞分化和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄物。與顆粒細(xì)胞相比，卵丘細(xì)胞表現(xiàn)出更高的細(xì)胞增殖率，更高的抗繆勒氏激素(AMH)表達(dá)水平，并且具有分泌透明質(zhì)酸用于卵丘擴(kuò)展的高能力。

在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，卵丘細(xì)胞發(fā)揮著重要的作用，主要包括以下三個(gè)方面： (1) 維持卵母細(xì)胞減數(shù)分裂停滯狀態(tài)；(2) 幫助誘導(dǎo)減數(shù)分裂恢復(fù)；(3) 促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)的成熟。卵丘細(xì)胞的上述關(guān)鍵作用歸因于COC間精細(xì)的縫隙連接網(wǎng)絡(luò)和它們之間特定的代謝能力。葡萄糖是COC的關(guān)鍵代謝物，通過(guò)糖酵解途徑、磷酸戊糖途徑(PPP)、己糖胺生物合成途徑(HBP)和多元醇途徑進(jìn)行代謝。另一方面，卵母細(xì)胞通過(guò)分泌可溶性生長(zhǎng)因子(OSF)作用于鄰近的濾泡細(xì)胞，將旁分泌信號(hào)傳導(dǎo)至卵丘細(xì)胞指導(dǎo)卵丘分化，從而調(diào)控自身的微環(huán)境，這也是近幾年的研究熱點(diǎn)。

1 卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的重要代謝途徑

在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中，葡萄糖是COC的關(guān)鍵代謝物。無(wú)氧糖酵解是哺乳動(dòng)物卵泡中葡萄糖代謝的主要途徑，隨著卵泡發(fā)生黃素化，葡萄糖消耗產(chǎn)生ATP或形成容易被卵母細(xì)胞利用的代謝物如丙酮酸、乳酸從而產(chǎn)生能量。然而，卵母細(xì)胞由于磷酸果糖激酶活性低，因而其葡萄糖代謝能力低。相反，卵丘細(xì)胞具有高糖分解活性，能將葡萄糖代謝成丙酮酸，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞作為能量來(lái)源。在卵母細(xì)胞內(nèi)，丙酮酸在線粒體中轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A(CoA)，后者進(jìn)入三羧酸(TCA)循環(huán)和電子傳遞鏈產(chǎn)生ATP。卵母細(xì)胞又通過(guò)上調(diào)卵丘細(xì)胞中的糖酵解基因確保其自身遞送丙酮酸。

磷酸戊糖途徑(PPP)在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中也是重要的葡萄糖代謝途徑，其可分為氧化階段和非氧化階段，葡萄糖可在任一階段進(jìn)入PPP。通過(guò)葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PDH)將葡萄糖-6-磷酸氧化成6-磷酸葡糖酸內(nèi)酯導(dǎo)致NADPH的產(chǎn)生，NADPH通過(guò)還原谷胱甘肽來(lái)保持細(xì)胞質(zhì)的完整性和氧化還原狀態(tài)。Cetica等發(fā)現(xiàn)，與牛卵丘細(xì)胞相比，卵母細(xì)胞具有相對(duì)較高的G6PDH(氧化階段的限速酶)活性，暗示了卵母細(xì)胞中磷酸戊糖活性較卵丘細(xì)胞中高。

HBP主要用于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的合成，調(diào)控卵丘細(xì)胞擴(kuò)展。HBP將葡萄糖-6-磷酸代謝成果糖-6-磷酸，其被葡糖胺(果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶GFPT)轉(zhuǎn)化成葡糖胺-6-磷酸，最終生成UDP-N-乙酰葡糖胺。在卵丘細(xì)胞中，大多數(shù)UDP-N-乙酰葡糖胺將被透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)轉(zhuǎn)化為透明質(zhì)酸。透明質(zhì)酸是卵丘細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)的主要結(jié)構(gòu)骨架。Sato等研究發(fā)現(xiàn)透明質(zhì)酸受體CD44 mRNA在豬卵丘細(xì)胞中表達(dá)，并且其表達(dá)隨著卵丘擴(kuò)展程度的增加而增加。此外，還發(fā)現(xiàn)在卵丘擴(kuò)展期間，透明質(zhì)酸受體CD44系統(tǒng)能激活一些成熟因子，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的生發(fā)泡破裂以及連接蛋白43(Cx43)中酪氨酸磷酸化。研究表明，卵丘擴(kuò)展的主要成分為透明質(zhì)酸，透明質(zhì)酸CD44系統(tǒng)將調(diào)節(jié)COC縫隙連接的破壞，同時(shí)控制豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂恢復(fù)的發(fā)生率。

多元醇途徑則涉及醛糖還原酶(AR)和山梨醇脫氫酶(SDH)將葡萄糖氧化為山梨醇和果糖。在正常血糖條件下，多元醇途徑占體細(xì)胞總葡萄糖代謝的非常少，主要是因?yàn)槿┨沁€原酶對(duì)葡萄糖具有較低的親和力。Kaneko等發(fā)現(xiàn)醛糖還原酶(AR)在大鼠卵巢顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中表達(dá)，且山梨醇脫氫酶(SDH)在卵母細(xì)胞中高度表達(dá)。雖然卵丘細(xì)胞具有高水平的糖酵解活性以向卵母細(xì)胞提供用于氧化磷酸化的代謝物，但兩種酶的定位表明卵巢顆粒細(xì)胞將葡萄糖轉(zhuǎn)化為山梨糖醇，為卵母細(xì)胞提供用于能量生產(chǎn)的替代底物，即果糖。迄今為止，COC中的山梨糖醇和果糖水平仍尚未被測(cè)定。

2 卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的重要分泌因子

卵母細(xì)胞從根本上是依賴于卵丘細(xì)胞來(lái)執(zhí)行多種功能。卵母細(xì)胞通過(guò)局部分泌強(qiáng)效生長(zhǎng)因子(OSF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)來(lái)決定卵丘細(xì)胞的分化和作用，并且充當(dāng)鄰近濾泡細(xì)胞的中心調(diào)節(jié)器。OSF主要包括生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(BMP15)，還包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白6(BMP6)以及一些成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)在內(nèi)的其他成分。

生長(zhǎng)因子參與的一些重要過(guò)程包括調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞向性腺嵴遷移[10]，協(xié)助顆粒和/或卵丘細(xì)胞分化、增殖、凋亡和黃素化的調(diào)節(jié)以及卵泡生長(zhǎng)速率的調(diào)節(jié)；還能促進(jìn)卵母細(xì)胞代謝所需的卵丘細(xì)胞糖酵解，如BMP15和FGF8在小鼠卵丘細(xì)胞中能促進(jìn)編碼糖酵解酶的基因表達(dá)[11]；此外還包括協(xié)助COC識(shí)別排卵所需的卵丘細(xì)胞表皮生長(zhǎng)因子(EGF)家族信號(hào)傳導(dǎo)，控制排卵所需的卵丘擴(kuò)展。研究發(fā)現(xiàn)，雌二醇(E2)和卵母細(xì)胞生長(zhǎng)分化因子9(GDF9)及BMP15之間具有協(xié)調(diào)作用，雌二醇(E2)能促進(jìn)卵丘細(xì)胞的發(fā)育并保持其擴(kuò)展能力[12]。事實(shí)上，卵丘擴(kuò)展是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，需要從卵泡中選出最佳的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合團(tuán)。卵丘擴(kuò)展的開始取決于兩個(gè)關(guān)鍵信號(hào)事件： 促性腺激素或EGF樣肽的刺激；卵母細(xì)胞產(chǎn)生的旁分泌信號(hào)，即位于卵丘細(xì)胞上的卵丘促進(jìn)因子(CEEF)，使其能夠響應(yīng)促性腺激素/表皮生長(zhǎng)因子(EGF)信號(hào)如透明質(zhì)酸合成酶2(HAS2)、腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白6(TNFαIP6)、正五聚蛋白3(PTX3)和前列腺素-過(guò)氧化物合成酶2(PTGS2)]以合成細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分子。由于不能合成卵丘基質(zhì)的成分會(huì)導(dǎo)致生育力降低或不育[13]，因此卵母細(xì)胞的排卵和卵丘擴(kuò)展對(duì)于維持女性生育力都是絕對(duì)必要的。

在卵泡形成過(guò)程中，GDF9和BMP15作為轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族的兩個(gè)關(guān)系密切的成員，已被認(rèn)為是卵泡發(fā)育所必需的。GDF9和BMP15能參與原始卵泡向初級(jí)卵泡進(jìn)化，在卵泡發(fā)育和成熟的后期階段均發(fā)揮了重要作用。GDF9缺陷的雌性小鼠，由于初級(jí)卵泡形成阻滯而不育，這表明卵母細(xì)胞產(chǎn)生的GDF9是原始卵泡到初級(jí)卵泡發(fā)育轉(zhuǎn)變所必需的。更有趣的是，編碼抑制素α(Inha)轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)水平在GDF9缺陷型的小鼠卵巢中顯著上調(diào)，并且在GDF9/Inha雙重敲除的小鼠中未觀察到初級(jí)卵泡形成受阻，這表明Inha的異常表達(dá)是導(dǎo)致GDF9缺陷型卵巢卵泡發(fā)育阻滯的主要原因[14]。而在BMP15基因敲除的雌性小鼠模型中則發(fā)現(xiàn)排卵和受精率均降低。在目前的臨床研究中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)GDF9和Bmp15基因突變與卵巢早衰有關(guān)以及GDF9的異常表達(dá)可能與多囊卵巢綜合征也相關(guān)[15]。目前在卵巢早衰和/或多囊卵巢綜合征的分子機(jī)制研究中，BMP15和GDF9已被認(rèn)為是良好的候選基因，且這兩種分泌蛋白已被確定為評(píng)估卵巢儲(chǔ)備的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。在多囊卵巢綜合征患者的卵巢中發(fā)現(xiàn)GDF9蛋白的表達(dá)水平相對(duì)較低，這可能導(dǎo)致卵巢過(guò)早黃體化，引起黃體功能障礙，進(jìn)一步增加流產(chǎn)率。這些研究結(jié)果為卵母細(xì)胞生長(zhǎng)分化因子在卵泡微環(huán)境中調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞成熟提供了有力證據(jù)。

在結(jié)構(gòu)上，GDF9和BMP15最具特征性的是這兩個(gè)分子缺乏轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族最常見的第四個(gè)半胱氨酸殘基，使得它們無(wú)法形成二硫鍵穩(wěn)定的二聚體，而是形成GDF9/BMP15異源二聚體。與同源二聚體不同的是，異源二聚體結(jié)合蛋白是細(xì)胞內(nèi)SMAD途徑(SMAD2/3和SMAD1/5/8)的有效激活劑，這可能是GDF9和BMP15發(fā)揮有效生物活性的主要原因[16]。SMAD是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF-β超家族細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和調(diào)節(jié)分子，可以將TGF-β信號(hào)直接由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)。

近年來(lái)，已有研究顯示GDF9和BMP15通過(guò)已知的TGF-β超家族受體發(fā)出信號(hào)以激活細(xì)胞內(nèi)SMAD途徑[17]。并且已有研究確定，通過(guò)卵母細(xì)胞激活顆粒/卵丘細(xì)胞中的SMAD2/3途徑是調(diào)控顆粒/卵丘細(xì)胞功能的主要核心。TGF-β超家族成員通過(guò)不同組的跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體(Ⅰ型和Ⅱ型受體)發(fā)出信號(hào)，其通過(guò)磷酸化SMAD轉(zhuǎn)錄因子(SMAD1-8)來(lái)進(jìn)一步調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)。迄今為止，已經(jīng)在哺乳動(dòng)物中鑒定了7種Ⅰ型受體(也稱為活化素受體樣激酶；ALK1-7)和5種不同的Ⅱ型受體(BMPR2，ACVR2A，ACVR2B，TβR2和AMHR2)[18]。BMP15使用經(jīng)典的BMP途徑在顆粒細(xì)胞中發(fā)出信號(hào)，即BMP15結(jié)合BMP-Ⅱ型受體(BMPR2)和活化素受體樣激酶6(ALK6)，進(jìn)一步激活SMAD1/5/8細(xì)胞內(nèi)途徑。而GDF9則利用兩種TGF-β超家族信號(hào)系統(tǒng)的雜交組合，即GDF9結(jié)合BMP-Ⅱ受體(BMPR2)，和利用TGF-βⅠ型受體活化素受體樣激酶5(ALK5)，導(dǎo)致SMAD2/3信號(hào)通路的激活[19]。

3 卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中的重要通訊結(jié)構(gòu)

卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的相互作用除了上文概述的旁分泌信號(hào)因子，還存在一種不可或缺的關(guān)系，即： 縫隙連接。在女性卵泡發(fā)育的過(guò)程中，生長(zhǎng)的卵母細(xì)胞正是通過(guò)縫隙連接與其周圍的體細(xì)胞發(fā)生偶聯(lián)。COC中的縫隙連接有助于卵母細(xì)胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育。縫隙連接是由六個(gè)連接蛋白(Cx)組成的一種跨膜蛋白結(jié)構(gòu)，Cx家族有20多個(gè)成員。所有的連接蛋白均具有相同的基本結(jié)構(gòu)，即4個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)胞外環(huán)，一個(gè)細(xì)胞質(zhì)環(huán)和細(xì)胞質(zhì)N-和C-末端。縫隙連接通常與親水分子的轉(zhuǎn)移有關(guān)，相對(duì)分子質(zhì)量小于1000。使用放射性同位素與小鼠COC的典型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一系列分子能夠穿越卵丘細(xì)胞的縫隙連接到卵母細(xì)胞[20]，特別是卵母細(xì)胞生長(zhǎng)所必需的離子、核苷酸、氨基酸和控制卵母細(xì)胞核成熟的小分子，如環(huán)磷酸腺苷(cAMP)?？p隙連接允許小分子量分子在卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的葡萄糖代謝物和離子的交換。

目前的研究認(rèn)為，人卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物中縫隙連接的主要貢獻(xiàn)者是Cx43蛋白，它對(duì)于影響人卵母細(xì)胞的發(fā)育能力是至關(guān)重要的[21]。Cx43蛋白具有較長(zhǎng)的胞質(zhì)C-末端受到廣泛的翻譯后修飾，其能調(diào)節(jié)胞內(nèi)運(yùn)輸和縫隙連接通道門控[22]。并且，已有研究表明缺乏Cx43蛋白的小鼠表現(xiàn)出胎兒性腺中生殖細(xì)胞數(shù)量減少，卵母細(xì)胞生長(zhǎng)受阻導(dǎo)致卵泡發(fā)育停滯和受精失敗。此外，Winterhager等[23]發(fā)現(xiàn)，連接蛋白43(Cx43)也在人的卵丘細(xì)胞中表達(dá)，在IVF情況下，該鏈接蛋白與女性妊娠結(jié)局相關(guān)，提示Cx43可能是評(píng)估女性卵母細(xì)胞和胚胎質(zhì)量的決定因素之一。不僅如此，該研究還發(fā)現(xiàn)，在女性的胎盤中，Cx43是從細(xì)胞滋養(yǎng)層到合體滋養(yǎng)層融合途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，發(fā)揮了促進(jìn)胎盤生長(zhǎng)的重要作用。有研究使用微陣列的方法證實(shí)了在卵丘細(xì)胞中不僅存在Cx43基因(GJA1)，還存在Cx37(GJA4)和Cx40(GJA5)等與縫隙連接有關(guān)的其他基因。目前認(rèn)為在人類的生長(zhǎng)濾泡中，連接蛋白43(Cx43)主要促成卵丘細(xì)胞/顆粒細(xì)胞之間縫隙連接的形成，而卵母細(xì)胞和周圍卵丘細(xì)胞之間的縫隙連接則主要由連接蛋白37(Cx37)組成，敲除Cx37將導(dǎo)致卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的細(xì)胞間偶聯(lián)破壞，卵泡發(fā)育受阻，抑制卵母細(xì)胞成熟和造成排卵功能障礙。因此Cx43和Cx37是與卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞之間的縫隙連接通訊最為密切兩個(gè)相關(guān)蛋白。

4 展 望

近年來(lái)，在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域越來(lái)越多的研究者認(rèn)識(shí)到卵母細(xì)胞質(zhì)量是評(píng)估女性生育能力的一個(gè)關(guān)鍵因素[24]。眾所周知，隨著母體年齡的增加，卵母細(xì)胞支持早期胚胎發(fā)育的能力將逐步下降[25]。卵母細(xì)胞的質(zhì)量反映在其內(nèi)在發(fā)育潛力上，卵母細(xì)胞的成熟水平受到其與體細(xì)胞之間雙向溝通的顯著調(diào)控，這些細(xì)胞之間的分子運(yùn)輸能力將進(jìn)一步改善卵母細(xì)胞代謝狀態(tài)及調(diào)節(jié)成熟能力。優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞通過(guò)特異性生長(zhǎng)因子調(diào)節(jié)自身的內(nèi)環(huán)境，且進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)育成熟并成功受精形成良好的胚胎。相反，卵母細(xì)胞質(zhì)量不佳則會(huì)導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯或自然流產(chǎn)。目前，人們對(duì)卵母細(xì)胞-體細(xì)胞通訊軸的性質(zhì)有了新的認(rèn)識(shí)，卵母細(xì)胞在卵泡中不是被動(dòng)的，而是充當(dāng)體細(xì)胞分化和作用的基本調(diào)節(jié)因子，并且在卵泡發(fā)育過(guò)程中起到核心作用。研究卵母細(xì)胞質(zhì)量的決定因素的一個(gè)重要意義是為了提高卵母細(xì)胞體外成熟(IVM)的臨床實(shí)施，影響IVM妊娠率的一個(gè)關(guān)鍵因素即為卵母細(xì)胞質(zhì)量，因此任何關(guān)于調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞質(zhì)量的新知識(shí)都可以用以幫助提高臨床IVM的妊娠率，從而為改善和治療不孕癥帶來(lái)新的希望。