雞足山水生絲孢菌資源調(diào)查

趙 娜，保丹鳳 ，李文麗，羅宗龍，蘇鴻雁*

（1.大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000；2.大理市血吸蟲病防治站，云南大理 671000；3.大理大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，云南大理 671003）

水生真菌是指整個(gè)生活史或部分生活史依賴于淡水環(huán)境的真菌，它們是一個(gè)生態(tài)復(fù)合群，具有豐富的多樣性〔1〕。1942年Ingold第一個(gè)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道水生真菌〔2〕，隨后引起了科學(xué)家的廣泛關(guān)注，許多新屬、新種相繼被報(bào)道。為了紀(jì)念I(lǐng)ngold對(duì)水生真菌做出的貢獻(xiàn)特將此類真菌命名為Ingoldian真菌。子囊菌（Ascomycetes）及其無性型是水生真菌中種類最多的類群，子囊菌的無性型包括絲孢菌（Hyphomycetes）和腔孢菌（Coelomycetes）〔3〕。

水生真菌在自然水體或部分人工水體中都能生存。Wong等〔4〕將水生真菌生存的淡水環(huán)境分為3類：①靜態(tài)水體，如：湖泊、池塘、濕地、樹洞等；②動(dòng)態(tài)水體，如：河流，溪流等；③人工水體，如：水塔，水渠等。Raja等〔5〕通過比較美國弗羅里達(dá)州大量動(dòng)態(tài)水和靜態(tài)水中的水生真菌群落，認(rèn)為水生真菌在動(dòng)態(tài)水體和靜態(tài)水體中真菌群落結(jié)構(gòu)并無顯著差異。水生真菌是一個(gè)可供人類開發(fā)利用的資源寶庫，它能分解木質(zhì)素、半木質(zhì)素及纖維素，并且能產(chǎn)生多種生物活性物質(zhì)，如：抗生素、殺蟲劑、多糖等〔3〕。

研究顯示，地理氣候條件〔6〕、植被〔7〕、生長基質(zhì)〔8〕、水質(zhì)〔9〕等多種因素都會(huì)影響水生真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。云南物種資源豐富，滇西北更是全球生物多樣性的熱點(diǎn)地區(qū)之一。20世紀(jì)80年代楊發(fā)蓉等對(duì)滇池〔10〕、洱?！?1〕、長湖〔12〕等地的水生真菌進(jìn)行研究，從此拉開了云南地區(qū)水生真菌研究的序幕。2000年，云南大學(xué)研究人員對(duì)云南不同地域水生真菌群落多樣性及其生態(tài)方面進(jìn)行了系統(tǒng)性研究〔13-14〕。Hu等〔15〕統(tǒng)計(jì)，中國內(nèi)陸已記錄的水生絲孢菌有416種，占已報(bào)道總數(shù)的48.8%。Su等〔16〕、Luo等〔17〕等開始對(duì)瀾滄江〔18〕、獨(dú)龍江〔19〕、怒江、金沙江、蒼山〔20-21〕、洱?！?2〕等地的水生真菌進(jìn)行系統(tǒng)性研究。

雞足山地處滇西高原，橫斷山脈東側(cè)，位于東經(jīng)100°20′～100°25′，北緯25°56′～26°00′之間，山體相對(duì)高差1 500 m左右，干濕季分明，全年降水極不均勻，5～10月為雨季，降水量占全年降水量的89%〔23〕。得天獨(dú)厚的地理環(huán)境及氣候使得雞足山植被多樣、物種資源豐富，但至目前為止，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)雞足山水生真菌資源的研究報(bào)道。本次研究對(duì)雞足山水生絲孢菌資源進(jìn)行調(diào)查，目的是了解雞足山水生絲孢菌資源狀況及多樣性特征，為以后雞足山水生真菌的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 方法

1.1 樣品采集2016年10月，在雞足山海拔2 196～2 449 m的山間溪流中采集沉水腐木。腐木一般選擇浸泡時(shí)間長，腐爛充分（用指甲能掐出凹陷），直徑1～5 cm，長20～30 cm的腐木，共采集120份，將采集好的腐木裝入自封塑料袋中，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行保濕培養(yǎng)，并記錄采集樣品地點(diǎn)的海拔、水溫及pH值。

1.2 培養(yǎng)基配制WA培養(yǎng)基（水-瓊脂培養(yǎng)基）：瓊脂條18 g，蒸餾水1 000 mL〔20〕；PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）：瓊脂條18 g，去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蒸餾水1 000 mL〔20〕；MEA培養(yǎng)基（麥芽浸粉瓊脂培養(yǎng)基）：瓊脂條18 g，大豆蛋白胨3 g，麥芽浸膏 30 g，蒸餾水1 000 mL〔24〕。以上培養(yǎng)基需經(jīng)高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min），冷卻至45℃時(shí)加入終濃度為0.5 mg∕mL的阿莫西林混勻，倒入平板冷卻備用。

1.3 樣品培養(yǎng)將吸水紙、塑料吸管用高壓蒸汽滅菌（121℃，20 min），烘干備用。用75%的酒精擦拭保鮮盒，晾干備用。將吸水紙放入保鮮盒中，再在吸水紙上放置3～4根塑料吸管以作為支撐以避免樣品與底部接觸，倒入無菌水使吸水紙充分濕潤，然后將采集回來的腐木放入保鮮盒中，每盒放10根腐木，寫上編號(hào)，將保鮮盒置于室溫下無陽光直射的地方培養(yǎng)，培養(yǎng)期間需不定期打開保鮮盒適當(dāng)通氣，且需適當(dāng)添加無菌水以保持樣品濕潤。

1.4 形態(tài)觀察樣品保濕培養(yǎng)1周后，在GL-99BI連續(xù)變倍體視鏡下觀察樣品，找到目的菌株后先用Nikon-SMZ 1000體視顯微鏡拍攝其外部形態(tài)，再用無菌針頭將鎖定的菌株挑下，以無菌水作為浮載劑制成水封片，在OLYMPUS BX51生物顯微鏡下觀察并進(jìn)行微觀拍照。

1.5 樣品拍照及拼圖每個(gè)菌種要求拍攝10～20個(gè)完整的分生孢子梗及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)，至少30個(gè)分生孢子的形態(tài)以及其他完整的特征。將真菌的外部形態(tài)、分生孢子、分生孢子梗、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及其他特征，萌發(fā)的分生孢子及純培養(yǎng)的照片，用軟件Photoshop CS5拼成完整的圖版。

1.6 樣品分離與純化在GL-99BI連續(xù)變倍體視鏡下用無菌牙簽將鎖定的分生孢子挑下，轉(zhuǎn)移至事先備好的PDA或WA培養(yǎng)基內(nèi)，要求每個(gè)培養(yǎng)基內(nèi)至少有5～7個(gè)獨(dú)立的分生孢子。將培養(yǎng)基放置于室溫下培養(yǎng)。24 h后在體視鏡下觀察，挑取1～2個(gè)已萌發(fā)的孢子制成封片后置于OLYMPUS BX51生物顯微鏡下拍攝其萌發(fā)照片，將已萌發(fā)的孢子轉(zhuǎn)移至備好的PDA培養(yǎng)基內(nèi)，用封口膜將平板封住后置于室溫下培養(yǎng)，定期檢查菌落的生長狀況。以上整個(gè)過程均要求無菌操作，避免污染。

1.7 菌種及干標(biāo)本保存用MEA斜面試管保存菌種。切下長有真菌子實(shí)體的木片風(fēng)干后，放入信封并放入1粒樟腦丸，采用此種方法可長期保存。

1.8 菌株鑒定根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)〔24-32〕，通過比較分生孢子梗及產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的形態(tài)特征，分生孢子的著生方式、大小、形狀、顏色、有無分隔以及附屬物的不同，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.9 數(shù)據(jù)分析

檢出率（%）=（某個(gè)種出現(xiàn)的次數(shù)∕樣品總數(shù)）×100%

采用香農(nóng)-維納指數(shù)（H′）分析雞足山水生絲孢菌的多樣性〔3〕。香農(nóng)-維納指數(shù)為：

其中，Ni為第i個(gè)菌種的檢出次數(shù)，N為所有菌種的檢出次數(shù)，Pi是某種菌種數(shù)量占所有菌種數(shù)量的百分比，S是所有菌種的種數(shù)。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對(duì)120份沉水腐木進(jìn)行鏡檢，分離、純化，通過形態(tài)學(xué)進(jìn)行鑒定，鑒定出水生絲孢菌20屬，40種。其中檢出率最高的屬為：Helicosporium（23.08%），其次是Dactylaria（18.46%）、Ellisembia（10.77%），最低的是Arachnophora（1.54%）、Beltrania（1.54%）等12個(gè)屬。見表1。雞足山水生絲孢菌的多樣性指數(shù)為2.49。各樣品采集地點(diǎn)的海拔、溫度、pH值和水生絲孢菌多樣性指數(shù)見表2。

表1 雞足山水生絲孢菌屬級(jí)檢出率

表2 雞足山各樣本采集地點(diǎn)的地理信息及水生絲孢菌的多樣性

3 討論

本研究共鑒定出水生絲孢菌20屬40種，其中檢出率最高的是Helicosporium（23.08%），其次是Dactylaria（18.46%）、Ellisembia（10.77%），最低的是Arachnophora（1.54%）、Beltrania（1.54%）等12個(gè)屬，共獲得雞足山水生絲孢菌純培養(yǎng)23株，香農(nóng)-維納指數(shù)為2.49，2015年劉曉英等〔20〕報(bào)道的蒼山萬花溪和黑龍溪水生絲孢菌多樣性分別為2.22和3.67，與之相比，雞足山水生絲孢菌多樣性高于蒼山萬花溪水生絲孢菌多樣性，但低于蒼山黑龍溪水生絲孢菌多樣性，說明雞足山水生絲孢菌物種豐富。分析原因有以下幾點(diǎn)：第一，此次研究地點(diǎn)為大理州賓川縣雞足山，其地理位置特殊，立體氣候顯著，植被多樣〔33〕，為水生真菌提供了不同的生存溫度及生長基質(zhì)，這些因素都會(huì)影響水生真菌的多樣性〔34〕；第二，可能與樣本采集時(shí)間、采集方法及樣本量有關(guān)，本研究樣本采集時(shí)間在10月份為雨季，蒼山萬花溪和黑龍溪的樣本采集時(shí)間在3月份為旱季〔20〕，楊發(fā)蓉等〔10-11〕研究指出旱季水生真菌的類群和數(shù)量明顯多于雨季；第三，可能與其他環(huán)境因素有關(guān)，已有研究證明環(huán)境因素會(huì)影響微生物的分布〔35-37〕，如地理距離〔38〕、海拔〔39〕、溫度〔40〕、植被〔34〕、化學(xué)因子〔41〕及環(huán)境污染〔42〕。Geml等〔39〕對(duì)阿根廷安第斯山脈的土壤真菌進(jìn)行研究后得出：真菌群落的物種組成與海拔高度密切相關(guān)。Wu等〔43〕研究發(fā)現(xiàn)在1 000～4 000 m海拔范圍內(nèi)，淡水真菌多樣性的變化主要受地理位置和海拔的影響。在此次調(diào)查中，各樣品采集地點(diǎn)的海拔依次為2 196、2 351、2 387和2 449 m，溫度分別為13.7、13.1、13.0和13.1℃，各地點(diǎn)對(duì)應(yīng)的pH值分別為7.57、7.45、7.32和7.50，香農(nóng)-維納指數(shù)依次為1.64、2.16、2.43和1.56，可看出多樣性與海拔關(guān)系不密切，這可能是由各采樣地點(diǎn)間海拔梯度、溫度及pH三者的變化不大且樣本量不統(tǒng)一所致，根據(jù)以上數(shù)據(jù)無法分析雞足山水生真菌多樣性變化與海拔、溫度及pH之間的關(guān)系。Sheare等〔44〕預(yù)測淡水中有大量水生真菌有待研究發(fā)現(xiàn)，并指出中國是調(diào)查報(bào)道最少的地區(qū)之一，此次研究結(jié)果彌補(bǔ)雞足山水生真菌研究的空白，為以后水生真菌資源的研究、開發(fā)利用奠定了菌種資源基礎(chǔ)。

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