糞樣保存方法對(duì)黑白仰鼻猴腸道結(jié)節(jié)線蟲監(jiān)測的影響

李延鵬，黃志旁，劉碩然，楊毅梅，鐘 泰，蘇錫鈞 ，崔亮偉，肖 文*

（1.大理大學(xué)東喜瑪拉雅研究院，云南大理 671003；2.云南省中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理 671003；3.白馬雪山國家自然保護(hù)區(qū)管理局，云南迪慶 674609；4.西南林業(yè)大學(xué)，昆明 650224）

寄生蟲病是危害人類、牲畜和家禽健康的主要疾病之一〔1-2〕。在占世界總?cè)丝跀?shù)量77%以上的廣大發(fā)展中國家，特別是在熱帶和亞熱帶地區(qū)的發(fā)展中國家寄生蟲病廣泛流行，威脅著兒童和成人的健康和生命〔3-4〕。因此，寄生蟲病的危害仍是普遍存在的公共衛(wèi)生問題〔5〕。作為發(fā)展中國家的人口大國，中國幅員遼闊，地跨寒、溫、熱三帶，自然條件差別很大，人民生活習(xí)慣復(fù)雜多樣，使我國成為寄生蟲病嚴(yán)重流行的國家之一，特別是在廣大農(nóng)村，寄生蟲病一直是危害人民健康的常見疾病。瘧疾、血吸蟲病、絲蟲病、黑熱病和鉤蟲病，曾被稱為“五大寄生蟲病”，奪去過成千上萬人的生命，嚴(yán)重阻礙農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展〔5〕。

從糞便中檢出寄生蟲蟲卵，是診斷腸道寄生蟲病的常用方法〔6-7〕，但是寄生蟲蟲卵的發(fā)育時(shí)間較短，故其鏡檢時(shí)都要求使用新鮮糞便樣品〔8〕。在人體寄生蟲檢測時(shí)糞便樣品可及時(shí)獲得，但是對(duì)于野生動(dòng)物而言，在檢測時(shí)及時(shí)獲得糞便樣品就存在較大難度，甚至是不可能實(shí)現(xiàn)的。為了保持糞便樣品中的原蟲形態(tài)及抑制蟲卵的發(fā)育，應(yīng)立即對(duì)糞便進(jìn)行固定保存。在寄生蟲診斷醫(yī)學(xué)中，有多種的糞便樣品保存方法，最常用保存方法可分為利用保存劑進(jìn)行保存和低溫保存兩種，常用的保存劑有福爾馬林、硫柳汞-碘-甲醛溶液（MIF）、肖氏固定液（Schaudinn's fluid）和聚乙烯醇〔9-11〕，低溫保存主要是冷凍保存。

針對(duì)野生動(dòng)物的寄生蟲研究，其主要介質(zhì)為血液、組織或糞便樣品〔12〕，而針對(duì)活體的野生動(dòng)物而言血液和組織樣品是很難獲得的，因此活體野生動(dòng)物的研究往往只能依托糞便介質(zhì)進(jìn)行。但目前尚沒有針對(duì)野生動(dòng)物糞便寄生蟲檢測的糞便樣品保存方法比較研究的報(bào)道，為此本文針對(duì)白馬雪山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)黑白仰鼻猴的寄生蟲感染現(xiàn)狀，進(jìn)行了糞便中結(jié)節(jié)線蟲（Oesophagostomumsp.）檢測樣品的保存方法對(duì)比研究。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)研究地點(diǎn)位于云南省西北部的白馬雪山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)境內(nèi)。白馬雪山國家級(jí)自然保護(hù)區(qū)在行政區(qū)上，地跨德欽縣的升平鎮(zhèn)、奔子欄鎮(zhèn)、霞若鄉(xiāng)和維西縣的巴迪鄉(xiāng)、葉枝鄉(xiāng)、康普鄉(xiāng)、白濟(jì)訊鄉(xiāng)、攀天閣鄉(xiāng)和塔城鎮(zhèn)。地處北緯27°24＇～28°36＇，東經(jīng)98°57＇～99°25＇之間，屬橫斷山脈東部云嶺的一部分，是“三江（金沙江、瀾滄江、怒江）并流”地區(qū)，也是青藏高原向云貴高原的過渡地帶，自然地理環(huán)境極為復(fù)雜。見圖1。

圖1 研究地點(diǎn)

1.2 實(shí)驗(yàn)材料福爾馬林保存液：在100 mL的甲醛（AR級(jí)）溶液中加入900 mL的0.85%的NaCl溶液，然后加入0.80 g的混合藥品（6.10 g的Na2HPO4和0.15 g的NaH2PO4充分混合）〔13-14〕。

糞便樣品：現(xiàn)場采集的黑白仰鼻猴新鮮糞便樣品18份，糞便樣品供體為保護(hù)區(qū)南片的塔城鎮(zhèn)響姑箐黑白仰鼻猴猴群，該群由8個(gè)OMU（one male unit繁殖單元，即一雄多雌單元）和1個(gè)AMU（all male unit，即全雄單元）組成，共90個(gè)個(gè)體，所有成年個(gè)體均能個(gè)體識(shí)別。糞便樣品采集時(shí)將同一個(gè)體的所有糞便顆粒進(jìn)行采集，記錄糞便樣品供體信息后放入自封袋中。

1.3 樣品保存將采集的樣品在1 h內(nèi)帶回野外基地實(shí)驗(yàn)室，每份樣品稱量后分成2份（每份30 g），分別放入樣品管內(nèi)進(jìn)行分兩組保存，其中A組加入福爾馬林保存液保存并將其放置實(shí)驗(yàn)室陰涼通風(fēng)處，B組直接放入-20 ℃冰箱保存〔8〕，A、B兩組各18個(gè)樣品。

1.4 糞便寄生蟲蟲卵鏡檢及計(jì)數(shù)在取樣當(dāng)天至第7天每天分別對(duì)A、B組取樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，之后第10天，第15、20、30天對(duì)A、B組分別取樣實(shí)驗(yàn)，如檢出強(qiáng)度下降至30%以下則停止檢測。

實(shí)驗(yàn)方法為飽和硫酸鋅漂浮法。A、B組分別稱取1 g（±5%）糞樣置于50 mL燒杯中，加至20 mL的無菌水?dāng)嚢杌靹蚝?，?jīng)50目網(wǎng)篩過濾，將濾液置20 mL的離心管中，1 500 r∕min，離心5 min，去上清液，加飽和硫酸鋅溶液至 5.0 mL，搖勻，待用〔8，11，15-16〕。用滴管吸取適量樣品至麥克馬斯特蟲卵計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)室內(nèi)，40倍物鏡下鏡檢計(jì)數(shù)，每樣重復(fù)計(jì)數(shù)4次后取平均值計(jì)算出檢出強(qiáng)度〔17-18〕，最后得出每克糞便的蟲卵數(shù)量。

檢出率=（檢驗(yàn)結(jié)果為陽性樣本數(shù)∕總樣本數(shù)）×100%

檢出強(qiáng)度（每克蟲卵數(shù)量）=計(jì)數(shù)室的蟲卵總數(shù)×（計(jì)數(shù)室容積0.10 mL ∕5.0 mL）

1.5 數(shù)據(jù)分析采用配對(duì)t檢驗(yàn)分析-20℃冷凍和福爾馬林保存液保存黑白仰鼻猴糞便的結(jié)節(jié)線蟲檢出強(qiáng)度差異；采用χ2檢驗(yàn)分析兩種保存方法對(duì)黑白仰鼻猴糞便結(jié)節(jié)線蟲檢出率的差異。所有數(shù)據(jù)用Excel軟件處理，利用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析顯著水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

兩種方法保存黑白仰鼻猴糞便樣品的結(jié)節(jié)線蟲蟲卵檢出率有差異，-20℃冷凍保存下結(jié)節(jié)線蟲蟲卵的檢出率高于福爾馬林保存液保存法（χ2=45.10，P＜0.01）。-20℃冷凍保存結(jié)節(jié)線蟲蟲卵的檢出率是88.89%（56∕63）；福爾馬林保存液保存下結(jié)節(jié)線蟲的檢出率是30.16%（19∕63）。

兩種方法保存的黑白仰鼻猴糞便樣品結(jié)節(jié)線蟲蟲卵的檢出強(qiáng)度存在差異，-20℃冷凍保存下糞便結(jié)節(jié)線蟲的檢出強(qiáng)度高于福爾馬林保存液保存（t=6.799，P＜0.001，df=62）。-20℃冷凍保存下結(jié)節(jié)線蟲的檢出強(qiáng)度為（919.69± 916.09）個(gè)∕g，福爾馬林保存液保存下結(jié)節(jié)線蟲的檢出強(qiáng)度為（106.62±212.46）個(gè)∕g。見圖2。

同時(shí)兩種方法保存糞樣的結(jié)節(jié)線蟲蟲卵檢出強(qiáng)度隨保存時(shí)間增加出現(xiàn)差異，在第4天，福爾馬林保存液保存的糞便樣品結(jié)節(jié)線蟲的檢出強(qiáng)度出現(xiàn)下降，而冷凍保存下的糞便樣品結(jié)節(jié)線蟲的檢出強(qiáng)度在1～10 d一直維持在較為穩(wěn)定的檢出強(qiáng)度。兩種保存方法下，前3 d的結(jié)節(jié)線蟲檢出強(qiáng)度無差異，第4～10天開始出現(xiàn)差異，差異在第5天達(dá)最大。見表1。

圖2 不同保存方法及保存時(shí)間下黑白仰鼻猴糞便樣品中結(jié)節(jié)線蟲檢出強(qiáng)度

表1 蟲卵檢出強(qiáng)度隨保存時(shí)間（1～10 d）的變化

在兩種方法保存效率出現(xiàn)顯著差異之后，繼續(xù)對(duì)-20℃冷凍保存條件下的樣品進(jìn)行了保存時(shí)間的驗(yàn)證，結(jié)果顯示，結(jié)節(jié)線蟲的檢出率1～30 d的保存時(shí)間內(nèi)沒有下降（88.89%），平均檢出強(qiáng)度維持在65%（973.89～633.03 個(gè)∕g）。見圖3。

圖3 -20℃冷凍保存1～30 d黑白仰鼻猴糞便樣品的結(jié)節(jié)線蟲蟲卵的檢出率和檢出強(qiáng)度

3 討論

本文首次以結(jié)節(jié)線蟲為例對(duì)黑白仰鼻猴糞便樣品在-20℃冷凍保存與福爾馬林保存液保存的保存效果進(jìn)行了對(duì)比研究，通過對(duì)兩種保存條件下不同保存時(shí)間內(nèi)糞便樣品中的結(jié)節(jié)線蟲的檢出強(qiáng)度及檢出率的比較，發(fā)現(xiàn)在-20℃冷凍保存條件下的糞便樣品保存效果明顯好于福爾馬林保存液。-20℃冷凍保存的檢出強(qiáng)度一直到第10天都維持在60%，30 d內(nèi)維持在50%；在福爾馬林保存液條件下的糞便樣品在保存第3天之后結(jié)節(jié)線蟲的檢出強(qiáng)度就下降至4.98%；檢出率上冷凍保存的樣品30 d內(nèi)并沒有下降，而福爾馬林保存液保存樣品檢出率最低下降至30.16%，因此針對(duì)結(jié)節(jié)線蟲的糞便樣品冷凍保存效果更好，可以維持較高的檢出率及檢出強(qiáng)度，同時(shí)保存時(shí)間更加長久〔19〕。針對(duì)研究野生動(dòng)物等不易及時(shí)獲得糞便樣品的對(duì)象時(shí)，糞便樣品的保存是一個(gè)極為重要的步驟，當(dāng)糞便樣品保存不當(dāng)將會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生較大的影響〔17〕。相對(duì)其他的液體保存劑而言，用福爾馬林保存液保存糞便樣品，固定后的樣品可以用于一些免疫學(xué)檢驗(yàn)，短時(shí)間內(nèi)對(duì)于鏡檢檢出率還是有一定的保證。但是相對(duì)于冷凍保存而言，福爾馬林溶液保存的糞便樣品在檢出強(qiáng)度上存在不穩(wěn)定性，因而對(duì)于定量的研究而言應(yīng)盡量選用低溫保存，且福爾馬林溶液保存糞便樣品在保存過程中會(huì)因?yàn)槿芤号c蟲卵內(nèi)的滲透壓差產(chǎn)生變形對(duì)后期的鏡檢結(jié)果產(chǎn)生很大的影響，同時(shí)福爾馬林溶液對(duì)保存滋養(yǎng)體而言效果也很不理想。

冷凍保存的時(shí)間一般也不建議過久，過久之后部分蟲卵也會(huì)因?yàn)槭畬?dǎo)致破裂，本研究低溫冷凍保存在30 d內(nèi)對(duì)結(jié)節(jié)線蟲蟲卵的檢出強(qiáng)度及檢出率影響都較小，故在針對(duì)野生動(dòng)物的糞便寄生蟲檢驗(yàn)研究中可以利用低溫保存法保存糞便樣品。近期車載冰箱已經(jīng)較為普遍，可以事先冷凍好冰袋置于便攜式車載冰箱內(nèi)，將獲取的野生動(dòng)物糞便用取樣管分裝好，置于有冰袋的便攜式車載冰箱內(nèi)，并帶回車上，盡快送回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢驗(yàn)，就可實(shí)現(xiàn)樣品的短期低溫保存，并能有效的抑制寄生蟲蟲卵的發(fā)育，經(jīng)過長期的野外試驗(yàn)作者已經(jīng)證實(shí)該方法的可行性。

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