高效液相色譜－三重四極桿／復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜法測定血液中唑吡坦和扎萊普隆的含量

時巧翠，朱 斌

（浙江警察學(xué)院 刑事科學(xué)技術(shù)系，杭州310053）

樣品前處理是法庭科學(xué)中毒物分析的關(guān)鍵步驟，直接影響毒物的檢出率［4］。傳統(tǒng)的樣品前處理方法如固相萃取、液液萃取等，存在操作繁瑣費時、提取率低、需要使用大量對人體和環(huán)境有毒害作用的有機溶劑等問題［5－6］。介質(zhì)液液萃取（SLE）是1997年由Johnson提出的一種新型的樣品前處理技術(shù)［7］。與傳統(tǒng)萃取技術(shù)相比，SLE具有操作簡便，能大大縮短樣品提取時間，回收率高，基質(zhì)干擾小，可以應(yīng)用于以96孔板結(jié)構(gòu)為代表的高通量體系等特點。SLE已被廣泛應(yīng)用于環(huán)境分析，食品安全等方面［8－10］，但在法庭科學(xué)中的應(yīng)用鮮有報道［11］。

目前，測定血液中唑吡坦和扎萊普隆的方法主要有氣相色譜法［12］、液相色譜法［13］、氣相色譜－質(zhì)譜法［14］及液相色譜－質(zhì)譜法［15］等。但這些方法均存在靈敏度較低，分析時間略長等缺點。本工作建立了介質(zhì)液液萃?。咝б合嗌V－三重四極桿／復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜（SLE－HPLC QTRAP－MS／MS）測定血液中唑吡坦和扎萊普隆含量的方法。

1 試驗部分

1．1 儀器與試劑

Biotage ISOLUTE SLE 1mL 介質(zhì)液液萃取柱；Shimazu LC 20A／AB Sciex Qtrap 6500型高效液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用儀。

唑吡坦標(biāo)準儲備溶液：1．000g·L－1，使用時用甲醇稀釋至所需質(zhì)量濃度。

扎萊普隆標(biāo)準儲備溶液：1．000g·L－1。

緩沖溶液：pH 7的緩沖溶液以飽和氯化鈉溶液代替；用0．2mol·L－1氨水和0．2mol·L－1氯化銨溶液按比例配制成pH 9的緩沖溶液；0．2mol·L－1乙酸銨溶液作為pH 10的標(biāo)準緩沖溶液；用0．2mol·L－1氫氧化鈉溶液和0．2mol·L－1氯化鉀溶液按比例配制成pH 12和pH 13的緩沖溶液。

乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷均為分析純；甲酸、乙酸銨、乙腈均為色譜純。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 Kinetex C18色譜柱（50mm×3．0mm，2．6μm），柱溫40℃；進樣量5μL；流量0．5mL·min－1；流動相 A為含5mmol·L－1乙酸銨的0．1%（體積分數(shù)，下同）甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0．0～4．0min時，B為10%；4．0～4．1min時，B由10%升至90%，保持2min；6．0～6．1min時，B由90%降至10%，保持3min。

2）質(zhì)譜條件 電噴霧離子（ESI）源，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式；輔助加熱氣溫度500℃；離子化電壓5 500V；氣簾氣壓力275．8kPa；碰撞氣為氮氣，壓力選擇 Medium；噴霧氣壓力344．7kPa；輔助加熱氣壓力344．7kPa。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1，其中“＊”為定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters

1．3 試驗方法

移取含有唑吡坦與扎萊普隆的血液0．50mL，加入pH 10的緩沖溶液0．3mL?；靹蚝髮悠芳尤虢橘|(zhì)液液萃取柱中，施加壓力，使樣品全部均勻分散在填料上后，靜置2min。用二氯甲烷8mL洗脫，控制其流量在1mL·min－1左右，最后施加壓力將柱中殘余的二氯甲烷擠出。洗脫液用氮氣吹干后，用初始流動相溶解并定容至0．50mL，在儀器工作條件下進行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

唑吡坦和扎萊普隆的總離子流色譜圖見圖1。

圖1 唑吡坦和扎萊普隆的總離子流色譜圖Fig．1 TIC chromatogram of zolpidem and zaleplon

2．2 SLE萃取條件的選擇

以空白血液為基質(zhì)，分別配制含有1．0μg·L－1唑吡坦與10μg·L－1扎萊普隆的標(biāo)準溶液，按儀器工作條件進行測定。

2．2．1 萃取劑

選用pH 10的緩沖溶液、平衡時間2min、溶劑使用量6mL，試驗分別考察了乙酸乙酯、三氯甲烷、乙醚、二氯甲烷等萃取劑的萃取效果。結(jié)果表明：二氯甲烷作為萃取劑時，效果較好，這可能是因為唑吡坦與扎萊普隆在二氯甲烷中有較好的溶解度。試驗選擇二氯甲烷為萃取劑。

2．2．2 萃取劑用量

選用pH 10的緩沖溶液、平衡時間2min，試驗考察了二氯甲烷用量分別為4，6，8，10mL時唑吡坦與扎萊普隆的回收率。結(jié)果表明：隨著二氯甲烷用量的增加，唑吡坦和扎萊普隆的回收率也逐漸提高，但當(dāng)二氯甲烷的用量為8，10mL時，兩種藥物回收率趨于穩(wěn)定。試驗選擇二氯甲烷的用量為8mL。

2．2．3 緩沖溶液酸度

固定平衡時間2min、萃取劑二氯甲烷6mL，試驗考察了緩沖溶液pH 分別為7，9，10，12，13時唑吡坦和扎萊普隆的萃取回收率。結(jié)果表明：隨著緩沖溶液pH的增大，唑吡坦和扎萊普隆的回收率也逐漸提高。但當(dāng)緩沖溶液的pH由10增大至13時，兩種藥物的回收率相差很小?？紤]到堿性太強，血液容易凝固而堵塞SLE萃取柱，試驗選擇pH為10的緩沖溶液。

2．2．4 平衡時間

在緩沖溶液pH為10、萃取劑二氯甲烷6mL的條件下，樣品均勻分散在介質(zhì)液液萃取柱填料上以后，試驗考察了靜置時間分別為2，5，8，10min時唑吡坦和扎萊普隆的萃取回收率。結(jié)果表明：平衡時間對目標(biāo)物回收率的影響較小。試驗選擇平衡時間為2min。

2．3 色譜條件的選擇

試驗分別比較了0．1%甲酸－甲醇、0．1%甲酸－乙腈、0．1%甲醇－乙腈和水－乙腈4種流動相體系對分析結(jié)果的影響。結(jié)果表明：流動相選用0．1%甲酸－乙腈體系時峰形更好，分離效果更優(yōu)，因此流動相選擇0．1%甲酸－乙腈體系進行梯度洗脫。添加不同體積分數(shù)的甲酸（0．1‰，0．5‰，1‰）、乙酸（0．1‰，0．2‰，0．5‰），不同濃度的乙酸銨（0．5，1，5mmol·L－1），結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn) 在 流 動 相 中 加 入5mmol·L－1乙酸銨不僅可以改善待測化合物的峰形，同時還可以增加待測物質(zhì)的響應(yīng)值。試驗選擇在0．1%甲酸的流動相中加入了5mmol·L－1乙酸銨，以提高方法的靈敏度。優(yōu)化的色譜條件見1．2節(jié)。

2．4 質(zhì)譜條件的選擇

試驗采用ESI正離子模式作為其離子化方式。取質(zhì)量濃度均為0．100g·L－1的吡唑坦、扎萊普隆標(biāo)準溶液，采用微量蠕動泵連續(xù)進樣，一級質(zhì)譜全掃描，確定準分子離子。結(jié)果顯示唑吡坦與扎萊普隆均在正離子模式下獲得準分子離子峰。唑吡坦與扎萊普隆的準分子離子峰分別為m／z308．1，306．1。以唑吡坦與扎萊普隆的準分子離子峰為母離子進行二級質(zhì)譜掃描，選豐度最高的兩個特征碎片離子作為定性定量離子，并優(yōu)化相應(yīng)離子對的去簇電壓、碰撞能量、碰撞室出口電壓和入口電壓。主要質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2．5 標(biāo)準曲線和檢出限

以空白血液為基質(zhì)，分別配制唑吡坦的質(zhì)量濃度為 0．10，0．20，0．50，1．00，2．00，5．00，10．00μg·L－1，扎萊普隆的質(zhì)量濃度為 1．00，2．00，5．00，10．00，20．00，50．00，100．0μg·L－1的標(biāo)準混合溶液系列，按儀器工作條件進行測定。以藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線，唑吡坦和扎萊普隆的線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表2。

按3倍信噪比計算方法的檢出限（3S／N），其結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)及檢出限Tab．2 Linearity parameters and detection limits

2．6 精密度和回收試驗

取空白血液，在線性范圍內(nèi)分別加入質(zhì)量濃度為0．20，2．00，10．00μg·L－1的唑吡坦和2．00，10．00，25．00μg·L－1的扎萊普隆，按試驗方法平行測定6次，其加標(biāo)回收率和測定值的相對標(biāo)準偏差（RSD）見表3。

由表3可知：兩種目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率在85．0%～103%之間，RSD在3．5%～8．5%之間。

2．7 樣品分析

案例1：某女46歲，長期受失眠困擾。一天其被發(fā)現(xiàn)在家中自殺身亡。抽取該女子心臟內(nèi)血液按照試驗方法進行檢測分析，結(jié)果在其血液中檢出唑吡坦的質(zhì)量濃度為1．26mg·L－1，其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2（a）。

表3 精密度和回收試驗結(jié)果（n＝6）Tab．3 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

案例2：某女38歲，因與其丈夫吵架而吞服大量Sonata自殺身亡。抽取其心臟內(nèi)血液按照試驗方法進行測定，結(jié)果在其血液中檢出扎萊普隆的質(zhì)量濃度為46．7μg·L－1，其多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖見圖2（b）。

圖2 樣品的多反應(yīng)監(jiān)測色譜圖Fig．2 MRM chromatograms of samples

本工作建立了高效液相色譜－三重四極桿／復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜結(jié)合介質(zhì)液液萃取技術(shù)測定血液中的唑吡坦和扎萊普隆的分析方法，優(yōu)化了介質(zhì)液液萃取試驗條件及高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法的儀器條件，對血液中的這兩種藥物進行了定性與定量分析。方法具有較高的靈敏度、回收率和精密度，能有效測定血液中唑吡坦與扎萊普隆的含量，可滿足偵查、訴訟及醫(yī)療急救的檢測要求。

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