酰胺－亞胺醇互變誘導(dǎo)的分子內(nèi)1，3－羥基遷移裂解反應(yīng)研究

許楊潔，曹小吉，2＊

（1．浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，杭州310014； 2．浙江工業(yè)大學(xué) 分析測(cè)試中心，杭州310014）

酰胺鍵是構(gòu)成多肽和蛋白質(zhì)的基本骨架結(jié)構(gòu)［1］。在25%的藥物分子中都含有酰胺鍵片段。酰胺－亞胺醇互變類似于酮－烯醇互變，區(qū)別在于其C＝N雙鍵代替了烯醇式中的C＝C雙鍵。盡管酰胺的亞胺醇構(gòu)型在通常情況下是不穩(wěn)定的，但是其作為一類特殊的反應(yīng)中間體日益得到人們的關(guān)注。文獻(xiàn)［2］報(bào)道采用量子化學(xué)理論計(jì)算證實(shí)了天冬氨酸殘基的C－端肽鍵在兩個(gè)水分子輔助下可以發(fā)生亞胺醇異構(gòu)化，進(jìn)而觸發(fā)了天冬氨酸殘基向其β構(gòu)型轉(zhuǎn)化。文獻(xiàn)［3］報(bào)道采用紅外多光子解離譜研究了二價(jià)金屬離子誘導(dǎo)的酰胺－亞胺醇異構(gòu)化反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氣相中金屬離子可與亞胺醇上的氮原子形成穩(wěn)定的配位鍵。此外，研究還發(fā)現(xiàn)O－（3，5－二硝基苯甲酰）苯甲羥肟酸酯與二甲亞砜共結(jié)晶，其酰胺鍵以亞胺醇式存在［4］。

N－吡啶基苯甲酰胺類化合物具有抗菌、抗腫瘤等生物活性［5］。截至目前，其質(zhì)子化離子碰撞誘導(dǎo)解離產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子的反應(yīng)機(jī)理研究還未見(jiàn)報(bào)道。碰撞誘導(dǎo)解離（CID）的原理是讓具有一定動(dòng)能的母離子與質(zhì)譜儀中的惰性氣體發(fā)生碰撞，動(dòng)能轉(zhuǎn)化為內(nèi)能，當(dāng)內(nèi)能超過(guò)了母離子的解離能時(shí)，會(huì)發(fā)生碎裂。高能碰撞解離（HCD）技術(shù)是一種新型的質(zhì)譜裂解技術(shù)，與CID技術(shù)相比，HCD技術(shù)具有穩(wěn)定的高能量裂解方式，可產(chǎn)生更多的碎片離子以及無(wú)低質(zhì)量端歧視效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)，與靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)量分析器結(jié)合使用還可以獲得高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確定碎片離子的元素組成［6－7］。

本工作采用高分辨的電噴霧電離－高能碰撞解離質(zhì)譜（ESI－HCD－MS／MS）技術(shù)，結(jié)合同位素標(biāo)記試驗(yàn)和量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算，系統(tǒng)探討了酰胺－亞胺醇互變誘導(dǎo)的分子內(nèi)羥基遷移解離產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子的反應(yīng)機(jī)理。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Thermo Fisher LCQ Deca XP MAX離子阱質(zhì)譜儀，配電噴霧電離源（ESI）及Xcalibur 2．1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；Thermo Fisher Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜儀（分辨率大于7 000，F(xiàn)WHM），配H－ESI II源及 Xcalibur 2．2數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、N－（6－溴吡 啶－2－基）苯甲酰胺、N－（6－氯吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－甲基－N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－溴－N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－甲氧基－N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺、4－甲基－N－（6－甲基吡啶－2－基）苯甲酰胺等7個(gè)N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺類化合物純度均大于95%。

甲醇為色譜純。

1．2 儀器工作條件

1）LCQ Deca XP MAX離子阱質(zhì)譜條件 電噴霧正離子（ESI＋）掃描模式，掃描范圍m／z50～800，流量5μL·min－1；霧化氣為氮?dú)?，流?L·min－1；噴霧電壓4．0kV；金屬毛細(xì)管溫度300℃；碰撞氣為氦氣，碰撞能量為32%。

2）Q Exactive組合型四極桿Orbitrap質(zhì)譜條件 正離子模式，流量為3μL·min－1；霧化氣為氮?dú)猓髁?L·min－1；噴霧電壓3．0kV；金屬毛細(xì)管溫度240℃；碰撞氣為氮?dú)猓鲎材芰繛?5%；采用標(biāo) 準(zhǔn) 校 正 液 （caffenine，MRFA and Ultramark 1621）對(duì)質(zhì)量軸進(jìn)行校正。

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品制備

稱取樣品2～3μg溶于1mL甲醇中，過(guò)0．45μm濾膜，用注射泵輸送至質(zhì)譜儀分析。

1．3．2 計(jì)算條件

采用Gaussian 03軟件，密度泛函理論（DFT），在B3LYP／6－31G（d）水平上對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬和優(yōu)化。在構(gòu)型優(yōu)化過(guò)程中，忽略對(duì)稱性限制。對(duì)所有的優(yōu)化結(jié)構(gòu)進(jìn)行振動(dòng)頻率分析，其中過(guò)渡態(tài)有且僅有一個(gè)虛頻。計(jì)算所得的能量為電子能和內(nèi)能之和。過(guò)渡態(tài)結(jié)構(gòu)優(yōu)化完成后通過(guò)反應(yīng)內(nèi)稟坐標(biāo)（IRC）進(jìn)行驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2．1 N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺的ESI－MS／MS分析

7個(gè)N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺類化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)表1。

表1 N－吡啶基苯甲酰胺類化合物的結(jié)構(gòu)式Tab．1 Structural formulae of the N－pyridinyl benzamides

在ESI＋下，表1中的化合物均產(chǎn)生質(zhì)子化離子［M＋H］＋，其質(zhì)子化離子碰撞誘導(dǎo)解離（CID－MS／MS）裂解所產(chǎn)生的主要碎片離子見(jiàn)表2。

由表2可知：這類化合物的質(zhì)子化離子碰撞誘導(dǎo)解離，裂解模式相同。

化合物1～7的質(zhì)子化離子及碎片離子的高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)見(jiàn)表3。

由表3可知：高分辨ESI－HCD－MS／MS得到的碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)的誤差均小于4×10－6，確證主要生成了取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子a、取代苯甲酰陽(yáng)離子b以及中性丟失一分子水產(chǎn)生的碎片離子c，它們的豐度隨著取代基的變化而變化。

表2 N－吡啶基苯甲酰胺類化合物質(zhì)子化離子CID－MS／MS產(chǎn)生的主要碎片離子數(shù)據(jù)Tab．2 CID－MS／MS data of major fragement ions from protonated N－pyridinyl benzamides

表3 化合物1～7的高分辨HCD－MS／MS數(shù)據(jù)Tab．3 High－resolution HCD－MS／MS data of compounds 1－7

2．2 酰胺－亞胺醇互變誘導(dǎo)的1，3－OH－遷移裂解反應(yīng)

試驗(yàn)以化合物7為例探討碎片離子a的具體形成機(jī)理。

化合物7的高能碰撞解離二級(jí)質(zhì)譜（HCD－MS／MS）圖見(jiàn)圖1（a），化合物7的［M＋H］＋離子（m／z227．117 9）碰撞解離產(chǎn)生6－甲基－2－羥基－吡啶陽(yáng)離子am／z110．060 4（元素組成C6H8NO＋，理論m／z110．060 0，相對(duì)誤差3．63×10－6）；活潑氫完全氘代的化合物7的［M－d1＋D］＋離子（m／z229．2）碰撞誘導(dǎo)解離則產(chǎn)生活潑氫完全氘代的a－d2碎片離子（m／z112．2）見(jiàn)圖1（b），表明酰胺上的活潑氫參與了6－甲基－2－羥基吡啶陽(yáng)離子的生成；為了推導(dǎo)碎片離子a中氧原子的來(lái)源，試驗(yàn)還研究分析了18O標(biāo)記的化合物1的質(zhì)子化離子（m／z201．090 8）的HCD－MS／MS圖，圖1（c）中m／z98．048 5的信號(hào)（元素組成C5H6N18O＋，相對(duì)誤差為－1．04×10－6）為18O標(biāo)記的2－羥基吡啶陽(yáng)離子，說(shuō)明2－羥基吡啶陽(yáng)離子中的氧原子來(lái)自于苯甲?；系孽；?。以上數(shù)據(jù)表明：化合物7的質(zhì)子化離子必須通過(guò)分子內(nèi)的骨架重排反應(yīng)，將酰胺鍵上的氧原子和活潑氫原子遷移到吡啶環(huán)上才能裂解產(chǎn)生碎片離子a。

圖1 ESI－MS／MS質(zhì)譜圖Fig．1 ESI－MS／MS spectra

酰胺鍵的酰胺－亞胺醇互變與酮的酮－烯醇互變類似，其亞胺醇式比酰胺式不穩(wěn)定。試驗(yàn)和量子化學(xué)理論計(jì)算已經(jīng)證實(shí)在氣相肽鍵的互變異構(gòu)化過(guò)程中存在亞胺醇構(gòu)型［8－9］。由量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算可知，當(dāng)外加質(zhì)子加合到化合物7的N1原子上時(shí)，吡啶環(huán)上的N1原子和酰胺鍵上的氧原子通過(guò)氫鍵螯合，產(chǎn)生質(zhì)子化離子MH1，其能量比加合在C2、N3、C4、C5原子上產(chǎn)生的質(zhì)子化離子 MH2、MH3、MH4、MH5的能量分別低89．58，139．96，208．22，203．82kJ·mol－1，由此可以確定吡啶環(huán)上的N1原子是該化合物熱力學(xué)上最穩(wěn)定的質(zhì)子化位點(diǎn)。MH1（0kJ·mol－1）經(jīng)碰撞活化，外加質(zhì)子誘導(dǎo)，發(fā)生酰胺－亞胺醇異構(gòu)化反應(yīng)，產(chǎn)生亞胺醇式中間體 M（56．21kJ·mol－1），亞胺醇上的羥基經(jīng)過(guò)過(guò)渡態(tài) TS（377．85kJ·mol－1），發(fā)生1，3－OH－遷移重排到吡啶環(huán)的C2位上，正電荷誘導(dǎo)C2－N3鍵異裂，中性丟失一分子4－甲基苯腈（e）產(chǎn)生6－甲基－2－羥基吡啶陽(yáng)離子（a），推測(cè)的具體裂解途徑見(jiàn)圖2，勢(shì)能圖見(jiàn)圖3。

圖2 推導(dǎo)的化合物7質(zhì)子化離子產(chǎn)生離子a的裂解機(jī)理Fig．2 Proposed fragmentation mechanism of protonated compound 7to produce ion a

圖3 化合物7生成離子a的反應(yīng)勢(shì)能圖Fig．3 Potential energy diagram for fragmentation of compound 7to produce ion a

為了更準(zhǔn)確地考察整個(gè)裂解反應(yīng)的路徑，試驗(yàn)對(duì)化合物1～7進(jìn)行量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算，數(shù)據(jù)見(jiàn)表4。

表4 化合物1～7的各階段相對(duì)勢(shì)能量Tab．4 Relative potential energies at various stages of compounds 1－7 kJ·mol－1

此外，試驗(yàn)還研究了取代基對(duì)該裂解反應(yīng)的影響。結(jié)果表明：當(dāng)吡啶環(huán)上有吸電子取代基或者苯環(huán)上有推電子取代基時(shí)，不利于該裂解反應(yīng)發(fā)生，產(chǎn)物離子a的豐度減小。

本工作采用高分辨電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，結(jié)合同位素標(biāo)記試驗(yàn)以及量子化學(xué)密度泛函理論計(jì)算，探討了N－（吡啶－2－基）苯甲酰胺類化合物的質(zhì)子化離子解離產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子的反應(yīng)機(jī)理。研究發(fā)現(xiàn)，外加質(zhì)子首先加合在吡啶環(huán)的氮原子上，隨后誘導(dǎo)酰胺鍵發(fā)生酰胺－亞胺醇異構(gòu)化轉(zhuǎn)變?yōu)閬啺反际?，接著發(fā)生分子內(nèi)的1，3－OH－重排，正電荷誘導(dǎo)異裂產(chǎn)生取代2－羥基吡啶陽(yáng)離子。吡啶環(huán)上有吸電子取代基或苯環(huán)上有推電子取代基不利于該裂解反應(yīng)的發(fā)生。本工作的研究結(jié)果對(duì)多肽以及蛋白質(zhì)中肽鍵的酰胺－亞胺醇互變異構(gòu)化機(jī)理的系統(tǒng)深入研究具有一定的理論指導(dǎo)意義。

感謝萬(wàn)結(jié)平副教授提供研究樣品！

［1］ 柴云峰．大氣壓電離質(zhì)譜中含氮有機(jī)化合物質(zhì)子化離子的產(chǎn)生及裂解反應(yīng)研究［D］．杭州：浙江大學(xué)，2013．

［2］ OHGI T，AKIFUMI O．Tyrosine and aspartic acid［M］．New York：Nova Science Publishers，Inc，2012．

［3］ DUNBAR R C，STEILL J D，POLFER N C，et al．Peptide bond tautomerization induced by divalent metal ions：Characterization of the iminol configuration［J］．Angewandte Chemie International Edition，2012，124（19）：4669－4671．

［4］ ALBRIGHT A L，COLLINS L，LI J，et al．Crystal structures of the amide and iminol tautomers o－（3，5－dinitrobenzoyloxy）benzohydroxamate．A case of a disappearing solvate？［J］．Australian Journal of Chemistry，2016，69（10）：1193－1197．

［5］ PREMKUMAR S，REKHA T N，ASATH R M，et al．Vibrational spectroscopic，structural and quantum chemical studies on N－phenyl－3－pyridinecarboxamide［J］．Journal of Molecular Structure，2016，1107：254－265．

［6］ CHI H，SUN R X，YANG B，et al．pNovo：de novo peptide sequencing and identification using HCD spectra［J］．Journal of Proteome Research，2010，9（5）：2713－2724．

［7］ ZUZANA S，JOHN O，F(xiàn)RANK N，et al．Food contaminant analysis at ultra－h(huán)igh mass resolution：Application of hybrid linear ion trap－orbitrap mass spectrometry for the determination of the polyether toxins，azaspiracids，in shellfish［J］．Rapid Communications in Mass Spectrometry，2010，24（20）：2966－2974．

［8］ RACZYNSKA E D，HALLMANN M，DUCZMAL K．Quantum－chemical studies of amide－iminol tautomerism for inhibitor of lactate dehydrogenase：Oxamic acid［J］．Computational and Theoretical Chemistry，2011，964（1／2／3）：310－317．

［9］ FAIRLIE D P，TAI C W，WICKRAMASINGHE W A，et al．Amide－iminol tautomerism：Effect of metalation［J］．Inorganic Chemistry，1994，33（26）：6425－6428．