超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定人體尿液中14種內(nèi)源性甾體激素含量

潘 虹

（齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，齊齊哈爾161006）

甾體激素，又稱(chēng)類(lèi)固醇激素，是一類(lèi)具有環(huán)戊烷多氫菲母核的四環(huán)脂肪烴化合物，對(duì)機(jī)體生長(zhǎng)、免疫調(diào)節(jié)、性器官發(fā)育和生殖控制等方面起關(guān)鍵作用［1－2］。外源性甾體激素是體外合成物質(zhì)，如丙酸睪酮、苯甲酸雌二醇和乙酸美侖孕酮等，對(duì)機(jī)體體能恢復(fù)、肌肉增長(zhǎng)、神經(jīng)興奮狀態(tài)有重要作用，被國(guó)際反興奮劑組織和國(guó)際奧林匹克委員會(huì)列為運(yùn)動(dòng)員禁用藥物［3］；內(nèi)源性甾體激素是由體內(nèi)內(nèi)腺生成的激素，如睪酮、表睪酮、雄酮、脫氫表雄酮、孕酮、孕二醇、β－雌二醇等［4］，在體內(nèi)作為化學(xué)信使。隨著國(guó)際競(jìng)技體育對(duì)興奮劑的禁用，部分運(yùn)動(dòng)員選擇使用隱蔽性更強(qiáng)的內(nèi)源性甾體激素興奮劑。因此，建立可靠有效的檢測(cè)方法以監(jiān)控內(nèi)源性甾體激素在人體尿液中殘留尤為必要。

目前關(guān)于甾體激素的測(cè)定方法主要有酶聯(lián)免疫吸附法［1－2］、液相色譜法［5］、氣相色譜－質(zhì)譜法［6－7］、液相色譜－質(zhì)譜法［8－10］等，其中酶聯(lián)免疫吸附法和液相色譜法靈敏度低、選擇性和特異性差；氣相色譜－質(zhì)譜法前處理需要衍生化，操作繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)；而液相色譜－質(zhì)譜法無(wú)需衍生化，且靈敏度、選擇性和特異性較高，已成為測(cè)定甾體激素殘留量的重要方法。本工作使用乙醚超聲萃取，經(jīng)Oasis HLB固相萃取柱凈化后，采用超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法（UPLC－QToF／MS）測(cè)定人體尿液中雌酮、17α－雌二醇、17β－雌二醇、雌三醇、丙酸睪酮、雄酮、本膽烷醇酮、表睪酮、脫氫表雄酮、睪酮、孕酮、孕二醇、孕三醇、氫化可的松等14種內(nèi)源性甾體激素殘留量，可為行政部門(mén)監(jiān)管內(nèi)源性甾體激素興奮劑濫用的判定提供檢測(cè)依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Waters Xevo G2－QToF型超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（UPLC－QToF／MS）；MS型分析天平（精度0．1mg）；Milli－Q型超純水器；JP－020S型超聲波清洗儀；3－18K型冷凍離心機(jī)；Waters－Oasis HLB固相萃取柱；TurboVap LV 型氮吹儀；0．22μm聚四氟乙烯膜針頭式過(guò)濾器。

雌酮、17α－雌二醇、17β－雌二醇、雌三醇、孕酮、孕三醇、丙酸睪酮、雄酮、本膽烷醇酮、脫氫表雄酮、睪酮、氫化可的松等標(biāo)準(zhǔn)品純度均不小于99．5%；孕二醇、表睪酮的純度均不小于98．0%；β－葡萄糖醛酸甙酶，5 000IU。

甾體激素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備溶液：1 000mg·L－1，分別稱(chēng)取10．0mg甾體激素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解并定容至10mL，于－20℃以下保存。

磷酸鹽緩沖溶液：稱(chēng)取十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）35．8g，二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）15．6g，用水溶解并定容至1L，用0．01mol·L－1氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)酸度為pH 6．8。

尿樣品由某醫(yī)院泌尿外科及志愿者提供；甲醇、乙腈、甲酸、乙酸銨均為色譜純，試驗(yàn)用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 ACQUITY UPLC?HSS T3色譜柱（2．1mm×100mm，1．8μm），柱溫45℃；進(jìn)樣量2μL；流量0．2mL·min－1；流動(dòng)相A為含0．1%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸的5mmol·L－1乙酸銨溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～6min時(shí)，B由95%降至90%；6～16min時(shí)，B由90%降至85%；16～20min時(shí)，B由85%降至60%。

2）質(zhì)譜條件 Xevo G2－QtoF質(zhì)譜系統(tǒng)，電噴霧離子源（ESI），正離子或負(fù)離子掃描模式，離子源溫度120℃；毛細(xì)管電壓2 500V；錐孔電壓35V，錐孔氣流量60L·h－1；霧化器溫度500℃，霧化氣流量800L·h－1；質(zhì)量掃描范圍m／z為50～500；全信息串聯(lián)質(zhì)譜（MSE）采集模式。其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters

表1（續(xù)）

1．3 試驗(yàn)方法

稱(chēng)取試樣5．000 0g于50mL離心管中，加入pH 6．8的磷酸緩沖溶液2．0mL、β－葡萄糖醛酸甙酶150μL混合，于55℃恒溫水浴中培養(yǎng)2h，取出后冷卻至室溫，再加入乙醚5mL，超聲萃取5min，以10 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心10min，取出有機(jī)相；水相中再加入乙醚5mL，超聲萃取5min，以10 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心10min，合并有機(jī)相，于45℃氮?dú)獯蹈?，加入甲醇?＋7）溶液5mL溶解殘?jiān)?，用Oasis HLB固相萃?。⊿PE）柱凈化，用甲醇－乙腈（1＋1）溶液5mL洗脫，于45℃氮?dú)獯蹈珊?，用乙腈?5＋5）溶液溶解并定容至1mL，經(jīng)0．22μm微孔濾膜過(guò)濾，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

14種甾體激素在不同離子模式下的總離子流色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 14種甾體激素在不同離子模式下的總離子流色譜圖Fig．1 TIC chromatograms of 14steroid hormones in different ion modes

2．2 提取劑的選擇

試驗(yàn)考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯、乙醚、異丙醇、正己烷、石油醚等有機(jī)溶劑對(duì)尿液中甾體激素的提取效果。結(jié)果表明：不同有機(jī)溶劑對(duì)尿液中14種甾體激素的提取效率不同，其中乙醚對(duì)甾體激素的提取率較高，最高值95．4%，平均值84．9%；其次石油醚對(duì)甾體激素的提取率平均值為80．4%；而甲醇對(duì)甾體激素的提取率較低，最低值56．1%，平均值為75．9%，這可能是由于尿液基質(zhì)中干擾物易溶于甲醇，從而降低了甲醇的提取效果。試驗(yàn)選擇乙醚作為提取劑。

2．3 SPE凈化柱的選擇

通過(guò)空白基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)，考察了不同SPE凈化柱（C18、MCX、HLB、MAX、WAX、WCX、SCX）對(duì)甾體激素（以雌酮為例）的凈化效果，見(jiàn)圖2。

由圖2可知：弱陽(yáng)離子交換柱（HLB、WCX）和C18柱對(duì)甾體激素具有較好的萃取、分離、濃縮效果，尤其是HLB柱回收率高達(dá)96．7%；強(qiáng)陽(yáng)離子交換柱（MCX和SCX）凈化效果適中；而弱陰離子交換柱（MAX和WAX）凈化效果較差，尤其是MAX柱回收率僅為41．2%。因此，試驗(yàn)選擇HLB固相萃取柱作為凈化柱。

圖2 SPE凈化柱對(duì)甾體激素回收率的影響Fig．2 Effect of SPE purification columns on recovery of steroids

2．4 色譜條件的選擇

2．4．1 色譜柱

試驗(yàn)考察了 HSS T3、BEH C18、BEH HILIC等不同型號(hào)色譜柱對(duì)甾體激素分離效果的影響，比較其分離度和靈敏度。結(jié)果表明：HSS T3和BEH C18可以有效分離14種甾體激素，尤其HSS T3色譜柱（2．1mm×100mm，1．8μm）分離的色譜峰，峰形較窄、對(duì)稱(chēng)且尖銳，分離度大于1．5，同時(shí)HSS T3色譜柱耐受酸度范圍較寬，能夠滿足酸性較強(qiáng)的流動(dòng)相環(huán)境。試驗(yàn)選用HSS T3型色譜柱。

2．4．2 流動(dòng)相

試驗(yàn)考察了不同比例的有機(jī)相（甲醇、乙腈）與水相（水、甲酸溶液、乙酸銨溶液）作為流動(dòng)相時(shí)甾體激素分離的效果。結(jié)果表明：當(dāng)有機(jī)相為甲醇，水相為水、甲酸溶液、乙酸銨溶液或含0．1%甲酸的乙酸銨溶液時(shí)，甾體激素分離度較差，峰寬且響應(yīng)值較低；而當(dāng)有機(jī)相為乙腈，水相為含0．1%甲酸的乙酸銨溶液時(shí)，甾體激素分離度較好，峰窄且尖銳，響應(yīng)值較高，這可能是由于流動(dòng)相中添加的甲酸，可以為甾體激素在電離過(guò)程中提供H＋和COO－，使其獲得較高豐度的［M＋H］＋或［M＋HCOO］－分子離子峰。試驗(yàn)選擇乙腈為有機(jī)相，含0．1%甲酸的乙酸銨溶液為水相。

2．5 質(zhì)譜條件的選擇

根據(jù)14種甾體激素的化學(xué)性質(zhì)，分別采用1．0mg·L－1單標(biāo)準(zhǔn)溶液流動(dòng)注射連續(xù)進(jìn)樣，流量為5．0μL·min－1，以正、負(fù)離子模式進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，確定準(zhǔn)分子離子峰后進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜掃描，獲得高豐度的特征碎片離子，結(jié)果見(jiàn)表1。除雌酮、17α－雌二醇、17β－雌二醇、雌三醇為負(fù)離子模式下獲得［M－H］－準(zhǔn)分子離子峰，其他10種甾體激素均為正離子模式下獲得準(zhǔn)分子離子峰，其中孕三醇獲得［M＋NH4］＋的準(zhǔn)分子離子峰，孕二醇因易脫水而獲得［M－2H2O＋H］＋的準(zhǔn)分子離子峰，其余為［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子峰。

2．6 基質(zhì)效應(yīng)

在乙腈、空白尿基質(zhì)溶液中加入一定量的甾體激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成低（2．50μg·kg－1）、中（50．0μg·kg－1）、高（100．0μg·kg－1）等3個(gè)濃度水平溶液，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定。比較乙腈和尿基質(zhì)溶液中被測(cè)組分的峰面積，計(jì)算基質(zhì)效應(yīng)（ME），ME＝Ap／As×100%，其中Ap指尿基質(zhì)溶液中被測(cè)組分的峰面積，As指純乙腈溶液中被測(cè)組分的峰面積，結(jié)果見(jiàn)表2。

由表2可知：被測(cè)組分的基質(zhì)效應(yīng)在80．3%～99．2%之間，沒(méi)有明顯的基質(zhì)效應(yīng)。

2．7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與檢出限

在空白尿液基質(zhì)中，分別加入適量的甾體激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制成甾體激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)依次為2．50，5．00，10．0，25．0，50．0，100．0μg·kg－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，按試驗(yàn)方法對(duì)其進(jìn)行測(cè)定。以甾體激素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。按3倍信噪比計(jì)算方法的檢出限（3S／N），見(jiàn)表3。由表3可知：14種甾體激素的相關(guān)系數(shù)均大于0．999 0，線性關(guān)系較好；檢出限在0．5～5．0μg·kg－1之間，說(shuō)明方法靈敏度較高。

表3 線性參數(shù)和檢出限Tab．3 Linearity parameters and detection limits

2．8 精密度和回收試驗(yàn)

在尿液空白基質(zhì)中添加一系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)的甾體激素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法平行測(cè)定6次，精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知：加標(biāo)回收率在80．6%～99．2%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在1．1%～7．9%之間，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度較高。

2．9 樣品分析

隨機(jī)選取某醫(yī)院泌尿外科待測(cè)實(shí)際尿液30份，按試驗(yàn)方法進(jìn)行內(nèi)源性甾體激素殘留量的測(cè)定。結(jié)果表明：2份試樣中檢出孕酮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為6．3，2．8μg·kg－1；3份試樣中檢出表睪酮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在1．8～3．4μg·kg－1之間；5份試樣中檢出17β－雌二醇，質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2．1～5．6μg·kg－1之間。說(shuō)明尿液中存在一定量的內(nèi)源性甾體激素殘留。

本工作采用超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法建立了人體尿液中14種內(nèi)源性甾體激素（雌酮、17α－雌二醇、17β－雌二醇、雌三醇、丙酸睪酮、雄酮、本膽烷醇酮、表睪酮、脫氫表雄酮、睪酮、孕酮、孕二醇、孕三醇、氫化可的松）殘留量的分析方法。方法準(zhǔn)確度高、精密度高、檢出限低，可為尿液中甾體激素的日常檢測(cè)提供分析方法。

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