高效液相色譜法測(cè)定營養(yǎng)品中的蟲草素

鄭國建，李 珊

（雅培貿(mào)易（上海）有限公司，上海200233）

營養(yǎng)品中含有人體欠缺及損失的營養(yǎng)成分，這些成分是保持身體健康的必要物質(zhì)。隨著人們生活水平的提高，健康意識(shí)越來越強(qiáng)，我國營養(yǎng)品市場(chǎng)存在較大發(fā)展空間。

蟲草素的化學(xué)名稱為3′－脫氧腺苷，是冬蟲夏草和蛹蟲草的主要活性成分之一［1］。有研究表明蟲草素可改善缺血小鼠的學(xué)習(xí)能力，促進(jìn)海馬神經(jīng)元的修復(fù)［2］，可抑制肺癌細(xì)胞株的增值和遷移過程［3］，具有消炎［4］、抗腫瘤［5］、調(diào)節(jié)人體免疫功能等顯著作用?；谙x草素的上述功能，將蟲草素添加到營養(yǎng)品中可極大地提高產(chǎn)品附加值，可調(diào)節(jié)人體的生理機(jī)能，為消費(fèi)者提供營養(yǎng)支持。

目前測(cè)定蟲草素的方法主要用于測(cè)定冬蟲夏草、蛹蟲草及其發(fā)酵液中的蟲草素含量［6－9］，但是沒有用于測(cè)定營養(yǎng)品中蟲草素的方法。營養(yǎng)品基質(zhì)復(fù)雜，含有淀粉、麥芽糊精、多種營養(yǎng)素和礦物質(zhì)，容易對(duì)測(cè)定結(jié)果造成干擾。本工作采用高效液相色譜法測(cè)定營養(yǎng)品中蟲草素的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1260型高效液相色譜儀，配二元泵、在線真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、進(jìn)樣器溫控、柱溫箱、多波長檢測(cè)器（MWD）；Milli－Q型純水系統(tǒng)。

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液：200.0mg·L－1，稱取標(biāo)準(zhǔn)品20.00mg于100mL容量瓶中，用水溶解并定容，在－20℃冰箱中保存，備用。

偏磷酸溶液：30.0g·L－1，稱取偏磷酸30.00g于裝有約600mL水的1L燒杯中，在磁力攪拌器上溶解，轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中，用水定容。

偏磷酸為分析純，乙腈為色譜純，試驗(yàn)用水為純水。

1.2 色譜條件

Phenomenex Gemini C18色 譜 柱 （250mm×4.6mm，5μm）；柱溫35℃；流量1.0mL·min－1；進(jìn)樣量20μL；流動(dòng)相A為水，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～16.0min時(shí)，A 為95%；16.0～16.1min時(shí)，A由95%線性降至10%；16.1～23.0min時(shí)，A為10%；23.0～23.1min時(shí)，A 由10%線性升至95%；23.1～30.0min時(shí)，A 為95%。紫外檢測(cè)波長為260nm。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取營養(yǎng)品樣品10.00g，加水至50.00g，加入磁力攪拌子，在磁力攪拌器上攪拌10min，使其充分溶解。從稀釋好的樣品里稱取2.50g溶液至50mL容量瓶中，加水30mL，混勻，超聲10min，加入30.0g·L－1偏磷酸溶液1.0mL，輕輕振蕩，加水稀釋至刻度，樣品經(jīng)0.22μm濾膜過濾后進(jìn)液相色譜分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品預(yù)處理?xiàng)l件的選擇

試驗(yàn)使用速溶蟲草素作為營養(yǎng)品的原料，采用干法工藝的方式進(jìn)行添加，所以在樣品處理過程中要對(duì)樣品進(jìn)行復(fù)溶，以盡可能減少由于樣品不均勻造成的測(cè)定值波動(dòng)。

農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) NY／T 2116－2012［10］中使用水直接提取樣品中的蟲草素。但是在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)如果只加水溶解提取營養(yǎng)品中的蟲草素，得不到澄清的液體，不利于后續(xù)的液相色譜分析。所以樣品處理過程中應(yīng)加入適當(dāng)?shù)某恋韯?/p>

沉淀樣品中干擾物質(zhì)的方法主要包括有機(jī)溶劑沉淀法［11］、鹽沉淀法［12］及酸堿沉淀法［11］。鑒于對(duì)操作人員的身體健康及沉淀效果的考慮，試驗(yàn)使用30.0g·L－1偏磷酸溶液。

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)偏磷酸溶液用量會(huì)改變蟲草素的出峰時(shí)間，其出峰時(shí)間隨偏磷酸溶液用量的增加而減少。這會(huì)導(dǎo)致蟲草素不能和雜質(zhì)分離，且在后續(xù)的色譜圖定量過程中造成處理軟件找不到對(duì)應(yīng)的目標(biāo)峰。試驗(yàn)確定30.0g·L－1磷酸溶液1.0mL已可沉淀樣品，且不對(duì)蟲草素的出峰時(shí)間和分離造成影響。

2.2 色譜條件的選擇

試驗(yàn)考察了SB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）、XDB C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）和 Gemini C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）對(duì)目標(biāo)物的分離效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Gemini C18色譜柱可以很好地將蟲草素和雜質(zhì)分離，其他兩種色譜柱會(huì)存在基質(zhì)干擾。所以試驗(yàn)選擇Gemini C18色譜柱。

在最佳色譜條件下對(duì)空白基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液及陽性樣品進(jìn)行分析，其色譜圖見圖1。

圖1 空白基質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)溶液和陽性樣品的色譜圖Fig.1 Chromatograms of blank matrix，standard solution and positive sample

由圖1可知，目標(biāo)物得到了很好的分離，沒有基質(zhì)干擾。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

按試驗(yàn)方法對(duì)0.05，0.10，0.20，0.40，0.60，1.00mg·L－1的蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明：蟲草素的質(zhì)量濃度在0.05～1.00mg·L－1內(nèi)與其峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程為y＝57.7 x，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)物的方法，以10倍信噪比計(jì)算得到蟲草素的測(cè)定下限（10S／N）為5.0mg·kg－1。

2.4 精密度與回收試驗(yàn)

取空白營養(yǎng)品樣品若干份，分別加入蟲草素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中蟲草素的質(zhì)量比分別為5.0，40.0，60.0mg·kg－1，按試驗(yàn)方法平行測(cè)定6次，計(jì)算回收率及測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見表1。

表1 精密度與回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.1 Results of tests for precision and recovery（n＝6）

由表1可知：加標(biāo)回收率在100%～102%之間，測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.5%～3.4%之間。

2.5 方法準(zhǔn)確性

使用NY／T 2116－2012中描述的方法對(duì)蟲草素原料進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)使用本方法分析添加了該蟲草素原料的營養(yǎng)品，其中每54.8g營養(yǎng)品中含1g蟲草素原料。

分別測(cè)定原料和營養(yǎng)品各6次，取平均值。原料中蟲草素的質(zhì)量比為1.97mg·g－1，所以營養(yǎng)品中蟲草素質(zhì)量比的理論值為35.95mg·kg－1。使用本方法實(shí)際測(cè)得營養(yǎng)品中蟲草素的質(zhì)量比為35.32mg·kg－1。測(cè)定值和理論值的相對(duì)誤差為1.8%。

本工作建立了測(cè)定營養(yǎng)品中蟲草素含量的方法，對(duì)樣品前處理中的沉淀劑進(jìn)行了優(yōu)化，最終選擇30.0g·L－1偏磷酸溶液1.0mL作為沉淀劑。該方法穩(wěn)定、可靠、準(zhǔn)確，適用于營養(yǎng)品中蟲草素的測(cè)定。

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