高效液相色譜－電感耦合等離子體質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定海產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物

陸奕娜，魏建華，許 慨，張林田，陳建偉

（汕頭出入境檢驗(yàn)檢疫局，汕頭515031）

海洋生物中砷化合物的含量較高，是人體攝入砷的重要來(lái)源［1］。常見(jiàn)的砷化合物有亞砷酸［As（Ⅲ）］、砷酸［As（Ⅴ）］、一甲基砷酸（MMA）、二甲基 砷 酸 （DMA）、砷 甜 菜 堿 （AsB）、砷 膽 堿（AsC）［2］、洛 克 沙 砷 （ROX）、4－氨 基 苯 砷 酸 （p－ASA）、2－氨基苯砷酸（o－ASA）［3］等。不同形態(tài)的砷毒性差異很大［4］，其中無(wú)機(jī)砷 As（Ⅲ）和As（Ⅴ）毒性最大［5］，甲基胂酸（MMA）和二甲基胂酸（DMA）等有機(jī)胂的毒性較小，而砷甜菜堿（AsB）、砷膽堿（AsC）通常被認(rèn)為無(wú)毒［6－7］。

有機(jī)胂劑（洛克沙胂、阿散酸）具有抗寄生蟲(chóng)病、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)［8］、改善動(dòng)物生產(chǎn)品質(zhì)等多重作用，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)中被大量使用。這些含砷的排泄物或以有機(jī)肥料進(jìn)入農(nóng)田，或直接排至魚(yú)塘、河流、海洋［9］。2004年，在中國(guó)則有6×106kg的砷進(jìn)入環(huán)境中［10］，并隨著食物鏈進(jìn)入水產(chǎn)品中。

目前，砷形態(tài)分析大多采用高效液相色譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)［11］。本工作利用高效液相色譜和電感耦合等離子體質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立同時(shí)快速測(cè)定海產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物的分析方法，以期為海產(chǎn)品的質(zhì)量控制提供技術(shù)支持。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1100型高效液相色譜儀，配四元泵及自動(dòng)進(jìn)樣器；Agilent 7700X型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀；CBL C9860A型超聲波萃取儀；Hettich型高速離心機(jī)；BUCHI型多平行樣品蒸發(fā)儀；Milliplus 2150型超純水處理系統(tǒng)。

砷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：As（Ⅲ）［GBW 0866，（124.3±2.0）mg·L－1］、As（Ⅴ）［GBW 08667，（32.4±0.7）mg·L－1］、MMA［GBW 08668，（46.2±1.5）mg·L－1］、DMA［GBW 08669，（97.4±3.3）mg· L－1］、AsB［GBW 08670，（92.2±2.7）mg·L－1］、AsC［GBW 08671，（91.6±3.7）mg· L－1］、ROX （16820200）、p－ASA（10300250）、o－ASA（F58WD－HK），均購(gòu)于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心，使用前用水配制成1.00mg·L－1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于0～5℃避光保存。

乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）溶液：200mmol·L－1，稱取EDTA 7.444 8g溶于100mL水中。

1.2 儀器工作條件

1）ICP－MS條件 射頻功率1 450W，測(cè)質(zhì)量數(shù)75（As），采樣周期為0.8s，采集時(shí)間為1 200s，載氣為高純氬氣，同心霧化器，載氣流量為1.00L·min－1。

2）HPLC條件 Hamilton PRP－X100陰離子分析柱（250mm×4mm，10μm）；流動(dòng)相 A 為0.5mmol·L－1（NH4）2CO3溶液－甲醇（99＋1），用氨水調(diào)pH 至8.5，流動(dòng)相B為50mmol·L－1（NH4）2CO3溶液－甲醇（99＋1），用甲酸調(diào)pH 至8.5；進(jìn)樣量25μL。梯度洗脫程序：0min時(shí)，A為100%，流量為1.0mL·min－1；1～8min，B 為100%，流量為1.0mL·min－1；9～18min時(shí)，B為100%，流量為1.1mL·min－1；19～20min時(shí)，A為100%，流量為1.0mL·min－1。

1.3 試驗(yàn)方法

稱取均質(zhì)后的樣品1.000 0g于50mL離心管中，加入流動(dòng)相A 38mL混勻，超聲萃取2h，再加乙酸2mL，加水定容至50mL，混勻。于4℃冰箱中靜止10min后，取清液以14 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心15min，吸取上清液過(guò)0.22μm濾膜至進(jìn)樣小瓶供HPLC－ICP－MS測(cè)定。如果離心后的溶液出現(xiàn)渾濁現(xiàn)象，則將離心機(jī)溫度設(shè)置為6℃重新離心，樣品中的油脂分層凝固在離心管上層，用小勺小心去除；或離心完成后將離心管置于冰箱冷藏保存2～3h以上，取出后去除上層油脂層，取1mL溶液再過(guò)0.22μm 濾膜至進(jìn)樣小瓶供 HPLC－ICP－MS測(cè)定，上機(jī)前加入200mmol·L－1的EDTA溶液50μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)考察了淋洗液流量為0.8～1.3mL·min－1對(duì)保留時(shí)間和分離度的影響。結(jié)果表明：隨淋洗液流量的增加，保留時(shí)間縮短，流量為0.8mL·min－1時(shí)，9種砷形態(tài)化合物的完全出峰時(shí)間太長(zhǎng)，需要25min才能洗脫完畢；流量為1.0mL·min－1時(shí)，23min內(nèi)完全出峰。由于前7種砷形態(tài)化合物的出峰時(shí)間比較短，流量不用設(shè)置太大，前期流量設(shè)置為1.0mL·min－1。后兩種砷形態(tài)化合物的出峰時(shí)間較長(zhǎng)，因此將后期的流量加快，分別設(shè)置為1.1mL·min－1、1.3mL·min－1、1.5mL·min－1，對(duì)應(yīng)的色譜圖見(jiàn)圖1。

由圖1可知：加快流量能加快后兩種砷形態(tài)化合物的出峰，1.1mL·min－1流量比1.0mL·min－1流量能明顯加快后兩種砷化合物的出峰，但是當(dāng)流量提高至1.3mL·min－1及1.5mL·min－1時(shí)，出峰時(shí)間加快效果不明顯，從保護(hù)色譜柱及色譜儀的角度出發(fā)，試驗(yàn)將流量設(shè)置為前期的1.0mL·min－1及后期的1.1mL·min－1。最終9種砷形態(tài)化合物在20min內(nèi)達(dá)到基線完全分離。

圖1 不同流量下9種砷形態(tài)化合物的色譜圖Fig.1 Chromatograms of nine arsenic species under different flow rates

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 射頻功率

試驗(yàn)考察了射頻功率分別為 1 000，1 050，1 100，1 150，1 200，1 250，1 300，1 350，1 400，1 450，1 500，1 550，1 600W 對(duì)靈敏度及氧化物、雙電荷的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2，圖3。

圖2 射頻功率對(duì)靈敏度的影響Fig.2 Effects of radio frequency power on sensitivity

由圖2可知：Y89的計(jì)數(shù)即靈敏度隨著射頻功率的增加呈現(xiàn)先增后略減的趨勢(shì)，當(dāng)射頻功率在1 450～1 500W 時(shí)，Y89的靈敏度最高。從圖3可以看出：隨著射頻功率的增加，氧化物急劇減少而雙電荷先減后增，其原因是隨著射頻功率的增加，矩管中心溫度升高，導(dǎo)致氧化物解離和雙電荷形成。射頻功率為1 450～1 600W 時(shí)，靈敏度、氧化物和雙電荷都能滿足調(diào)諧要求。為了減少質(zhì)譜干擾，試驗(yàn)選擇射頻功率為1 450W。

圖3 射頻功率對(duì)氧化物、雙電荷的影響Fig.3 Effects of radio frequency power on oxides and double－charges

2.2.2 載氣流量

試驗(yàn)考察了載氣流量分別為0.80，0.85，0.90，0.95，1.00，1.05，1.10，1.15，1.20mL·min－1對(duì)靈敏度及氧化物、雙電荷的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4，圖5。

由圖4可知：隨著載氣流量的增加，靈敏度呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，當(dāng)流量在1.00～1.05mL·min－1時(shí)靈敏度最大。由圖5可知：載氣對(duì)雙電荷的干擾呈現(xiàn)先略少后增加的趨勢(shì)，氧化物的干擾則也是先略少后急劇增加。載氣流量設(shè)置在1.00～1.05mL·min－1時(shí)，儀器靈敏度、氧化物、雙電荷均最佳。為了在提高靈敏度的同時(shí)減少氧化物的干擾，試驗(yàn)選擇載氣流量為1.00mL·min－1。

2.2.3 輔助氣流量

試驗(yàn)考察了輔助氣流量對(duì)靈敏度及氧化物、雙電荷的影響，結(jié)果見(jiàn)圖6，圖7。

圖4 載氣流量對(duì)靈敏度的影響Fig.4 Effects of gas flow rate on sensitivity

圖5 載氣流量對(duì)氧化物、雙電荷的影響Fig.5 Effects of carrier gas flow on oxides and double charges

圖6 輔助氣流量對(duì)靈敏度的影響Fig.6 Effects of auxiliary gas flow rate on sensitivity

由圖6可知：隨著輔助氣流量的增加，靈敏度呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，輔助氣流量為0的情況下，靈敏度最大。由圖7可知，輔助氣對(duì)雙電荷及氧化物的干擾隨著流量的增加而增加。因此，試驗(yàn)不使用輔助氣。

圖7 輔助氣流量對(duì)氧化物、雙電荷的影響Fig.7 Effects of auxiliary gas flow rate on oxides and double charges

2.3 前處理的優(yōu)化

2.3.1 萃取時(shí)間

對(duì)萃取時(shí)間做單因素試驗(yàn)，取藍(lán)圓鲹及方斑東風(fēng)螺樣品，按萃取時(shí)間分別為 30，60，90，120，150min進(jìn)行萃取，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖8和圖9，由于As（Ⅲ）、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX及o－ASA不同萃取時(shí)間的測(cè)定結(jié)果均小于檢出限，圖中只對(duì)檢出項(xiàng)目AsC、AsB、DMA、p－ASA（方斑東方螺檢出）進(jìn)行對(duì)比。由試驗(yàn)結(jié)果可知：120min為萃取的最佳時(shí)間，既可保證最大提取效率，又可節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間。

圖8 萃取時(shí)間對(duì)砷化合物提取效率的影響Fig.8 Effects of extraction time on extraction efficiency of arsenic species

2.3.2 萃取溫度

為了驗(yàn)證萃取溫度是否造成砷形態(tài)之間的轉(zhuǎn)化及損失，對(duì)萃取溫度做了單因素試驗(yàn)。在空白樣品（羅非魚(yú)）中添加40μg·kg－1的9種砷形態(tài)化合物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行超聲，通過(guò)加入冰塊將萃取溫度控制在20，30，40，50℃及不加入冰塊不控制溫度（實(shí)測(cè)最高55℃）進(jìn)行120min萃取，與不超聲直接上機(jī)測(cè)定的結(jié)果作比較，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 超聲萃取溫度對(duì)砷形態(tài)化合物測(cè)定結(jié)果的影響Tab.1 Effects of ultrasonic extraction temperatures on determination results of arsenic species μg·kg－1

由表1可知：萃取溫度在2h內(nèi)對(duì)9種砷形態(tài)化合物的測(cè)定沒(méi)有明顯的影響，不會(huì)造成砷形態(tài)之間的互相轉(zhuǎn)化。

2.3.3 萃取次數(shù)

在萃取過(guò)程中，萃取次數(shù)對(duì)回收率有著重要影響，萃取次數(shù)如不夠，萃取不完全，目標(biāo)物損失較多，而萃取次數(shù)過(guò)多，既造成試劑浪費(fèi)又造成檢測(cè)時(shí)間太長(zhǎng)，工作效率低。以檢出砷形態(tài)化合物種類較多的三疣梭子蟹為研究對(duì)象，按試驗(yàn)方法萃取3次，比較3次提取液中各砷形態(tài)化合物的測(cè)定值，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 萃取次數(shù)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響Tab.2 Effects of extraction times on determination results μg·kg－1

由表2可知：按照2h超聲萃取一次，被測(cè)物基本已經(jīng)萃取完全，有很少一部分被測(cè)物殘留在殘?jiān)?，比例不?%，主要是萃取后的殘?jiān)鼪](méi)有瀝干，殘?jiān)降囊后w中含有極少的砷化合物。第三次提取液中9種砷形態(tài)化合物均為未檢出?？紤]到試驗(yàn)時(shí)間及萃取效率，且第二次萃取的殘留量極低，試驗(yàn)確定的萃取次數(shù)為一次。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及測(cè)定下限

移取 0，1.0，5.0，10，20，40，80，100mL 的AsC、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX、o－ASA（AsB 再添加 200，400mL）質(zhì)量濃 度為1.00mg·L－1的各標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，用水定容至1L，配制成0，1.0，5.0，10，20，40，80，100μg·L－1（AsB增加200，400μg·L－1兩個(gè)級(jí)別）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，上機(jī)前加入200mmol·L－1的EDTA溶液50μL，按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積對(duì)各砷形態(tài)化合物的質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，9種砷形態(tài)化合物的質(zhì)量濃度在100μg·L－1內(nèi)與對(duì)應(yīng)峰面積呈線性關(guān)系，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。

采用 1.0μg·L－1的 AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA 及2.0μg·L－1的ROX、o－ASA共9種砷形態(tài)化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖，選取一段噪聲，以峰對(duì)峰計(jì)算信噪比。以10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限。確定 HPLC－ICP－MS聯(lián)用技術(shù)檢測(cè)魚(yú)類、蝦類、貝類、蟹類等水產(chǎn)品中AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA的測(cè)定下限為50μg·kg－1，ROX、o－ASA的測(cè)定下限為100μg·kg－1。

2.5 精密度與回收試驗(yàn)

試驗(yàn)同時(shí)選擇羅非魚(yú)陰性樣品在測(cè)定下限的1，2，10倍添加標(biāo)準(zhǔn)溶液，按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定，回收率在74.0%～109%之間，6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.4%～13%之間。

表3 線性參數(shù)與測(cè)定下限Tab.3 Linearity parameters and lower limits of determination

2.6 樣品分析

按試驗(yàn)方法同時(shí)測(cè)定汕頭市海域附近的魚(yú)、蝦、蟹類等海產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 海產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物測(cè)定結(jié)果Tab.4 Determination results of 9arsenic species in marine products μg·kg－1

由表4可知：樣品中的砷主要以砷甜菜堿（AsB）形式存在，較多的樣品含有少量的 AsC，DMA及 MMA檢出較少，毒性較大的As（Ⅲ）、As（Ⅴ）含量較低，且無(wú)機(jī)砷含量即 As（Ⅲ）與As（Ⅴ）總和均小于GB 2762－2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》［12］中無(wú)機(jī)砷的限量要求，樣品基本不含有有機(jī)胂制劑p－ASA、ROX、o－ASA。

本工作通過(guò)對(duì)質(zhì)譜、色譜條件的優(yōu)化，使AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）、p－ASA、ROX及o－ASA等9種砷形態(tài)化合物在20min內(nèi)得以分離，基線平穩(wěn)，是目前文獻(xiàn)分離項(xiàng)目較多的方法之一。其中AsC、AsB、As（Ⅲ）、DMA、MMA、As（Ⅴ）在8min內(nèi)得以完全分離，是目前文獻(xiàn)中出峰速率最快的。同時(shí)采用適當(dāng)簡(jiǎn)便的前處理技術(shù)提取樣品中9種砷形態(tài)化合物，該方法能快速地分析水產(chǎn)品中9種砷形態(tài)化合物。試驗(yàn)收集到的樣品中，所有樣品均檢出AsB，且含量占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，即采集到的樣品中砷主要以無(wú)毒的AsB形式存在，與文獻(xiàn)［13－17］報(bào)道相符；較多的樣品含有AsC；毒性較大的As（Ⅲ）、As（Ⅴ）較少檢出且含量比較低；MMA及DMA檢出同樣較少；基本不含有有機(jī)胂制劑p－ASA、ROX、o－ASA。

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