超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶粉中16種苯并咪唑類藥物殘留量

趙超群，劉 柱，徐瀟穎，羅金文

（浙江省食品藥品檢驗(yàn)研究院，杭州310052）

苯并咪唑是一種含有2個(gè)氮原子的苯并雜環(huán)化合物，這種特殊的結(jié)構(gòu)使得苯并咪唑類化合物具有良好的生物活性［1］，可用作組胺受體拮抗劑、質(zhì)子泵抑制劑，還有抗高血壓、抗寄生蟲的治療作用［2］。苯并咪唑類化合物在獸醫(yī)臨床上也應(yīng)用廣泛，是許多寄生蠕蟲疾病的首選藥物，療效明顯［3］。由于一些苯并咪唑類藥物及其代謝物在動物和靶動物安全評價(jià)試驗(yàn)中表現(xiàn)出致畸和致突變的作用，雖然其在體內(nèi)很快代謝，但一些代謝物，如亞砜化物、羥化產(chǎn)物等仍具有胚胎毒性，因此許多國家已將苯并咪唑類藥物及其代謝物同時(shí)作為限用物質(zhì)進(jìn)行監(jiān)控。歐盟規(guī)定阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑和奧芬達(dá)唑在牛奶中的殘留限量分別為100，10，10μg·kg－1；我國農(nóng)業(yè)部公告第235號令規(guī)定阿苯達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑、噻苯咪唑在牛奶中的殘留限量均為100μg·kg－1。但目前使用的標(biāo)準(zhǔn)方法及文獻(xiàn)報(bào)道基本是針對動物源性食品中的苯并咪唑類藥物殘留的檢測［4］，對奶粉中的苯并咪唑類藥物殘留檢測方法報(bào)道較少。在質(zhì)量安全意識淡薄和經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，對泌乳牛用藥不當(dāng)或不注意停藥時(shí)間均會造成牛奶中苯并咪唑等獸藥的超標(biāo)殘留，攝入人體后，同樣會影響人體健康。國內(nèi)外報(bào)道的測定苯并咪唑類藥物的方法主要有液相色譜法［5－8］、液相 色譜－質(zhì)譜聯(lián) 用法［9－11］、熒光光譜法［12］、免疫測定法［13］和高效毛細(xì)管電泳法［14］等，但同時(shí)測定奶粉中16種苯并咪唑類藥物殘留的方法鮮見報(bào)道。本工作采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測定奶粉中的16種苯并咪唑類藥物殘留量，可為建立高效靈敏的方法用于日常檢測提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Waters T－QS型液相色譜－質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀；Milli－Q型超純水儀；Waters Oasis MCX固相萃取柱（6cc，500mg）。

單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：0．500g·L－1，分別稱取奧芬達(dá)唑、芬苯達(dá)唑、奧芬達(dá)唑砜、阿苯達(dá)唑、阿苯達(dá)唑－2－氨基砜、阿苯達(dá)唑亞砜、阿苯達(dá)唑砜、甲苯咪唑、氨基甲苯咪唑、羥基甲苯咪唑、噻苯咪唑、5－羥基噻苯咪唑、氟苯咪唑、2－氨基氟苯咪唑、噻苯咪唑酯、丙氧苯咪唑各10．0mg，用甲醇溶解，并定容至20mL，于4℃保存。使用時(shí)，取各單標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液適量，混合后用乙腈稀釋至所需質(zhì)量濃度，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

甲醇、乙腈、甲酸均為色譜純，其他所用試劑均為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1）色譜條件 Waters ACQUITY UPLC BEH色譜柱（2．1mm×50mm，1．7μm）；柱溫35℃；流量0．35mL·min－1；進(jìn)樣量2μL；流動相 A 為0．02%（體積分?jǐn)?shù)，下同）甲酸溶液，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～6．0min時(shí)，B由12%升至55%；6．0～6．1min時(shí)，B由55%降至12%，保持2min。

2）質(zhì)譜條件 電噴霧正離子源（ESI＋），離子源溫度500℃；電離電壓3．5kV；碰撞氣流量800L·h－1；多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）模式。16種藥物的監(jiān)測離子對及相關(guān)參數(shù)見表1，其中“＊”表示定量離子。

表1 質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters

1．3 試驗(yàn)方法

1．3．1 樣品提取

稱取樣品2．000 0g至50mL高速離心管中，加入0．1mol·L－1鹽酸溶液8mL溶解，加入乙腈7mL，渦旋混合，超聲提取5min，以4 000r·min－1轉(zhuǎn)速離心5min。

1．3．2 凈化

MCX固相萃取柱（6cc，500mg）經(jīng)甲醇5mL活化，0．1mol·L－1鹽酸溶液5mL平衡后，將樣品上清液全部過柱，控制流量每秒1～2滴，然后依次使用0．1mol·L－1鹽酸溶液5mL、甲醇5mL淋洗，氨水－乙腈（1＋9）溶液15mL洗脫。收集全部洗脫液，于38℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入乙腈0．5mL，超聲振蕩5min，加入0．025mol·L－1乙酸銨溶液1．5mL，漩渦混勻。取上述溶液0．5mL，加入乙腈（2＋8）溶液4．5mL，經(jīng)0．22μm有機(jī)微孔濾膜過濾后轉(zhuǎn)移至進(jìn)樣瓶中，按儀器工作條件進(jìn)行測定。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜行為

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子流色譜圖見圖1，16種化合物的提取離子流圖見圖2。

圖1 總離子流色譜圖Fig．1 TIC chromatogram

圖2 16種化合物的提取離子流圖Fig．2 Extraction ion chromatograms of 16compounds

2．2 提取條件的選擇

苯并咪唑類藥物屬于弱堿性化合物，中等極性，易溶于極性有機(jī)溶劑，在水中溶解度較小。但奶粉中含有大量蛋白質(zhì)及脂肪等基質(zhì)，直接用有機(jī)溶劑提取會沉淀蛋白質(zhì)，影響目標(biāo)化合物的提取。試驗(yàn)分別考察了0．1mol·L－1鹽酸溶液－乙腈提取和乙酸乙酯萃取兩種方式對目標(biāo)物的提取效果。

當(dāng)溶液呈酸性時(shí)，弱堿性的苯并咪唑類藥物的溶解度增大。試驗(yàn)中先用0．1mol·L－1鹽酸溶液8mL溶解奶粉，再加入乙腈7mL，渦旋混勻，奶粉能在溶液中混合均勻，超聲提取離心后即可上固相萃取柱凈化。

水溶液的酸度對苯并咪唑類藥物的影響較大，當(dāng)調(diào)節(jié)水溶液為堿性時(shí)，苯并咪唑類藥物為分子狀態(tài)，溶解度減小，更易被有機(jī)溶劑萃取。將奶粉先溶于1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）氫氧化鉀溶液中，加入氯化鈉2g，再用乙酸乙酯萃取2次，合并上清液于38℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，殘?jiān)扔靡译?．5mL超聲溶解，再加入0．1mol·L－1鹽酸溶液1．5mL，避免乙腈與正己烷液液分配脫脂時(shí)產(chǎn)生乳化現(xiàn)象，渦旋混勻，加入正己烷重復(fù)洗滌去脂，脫脂后的樣品加入0．1mol·L－1鹽酸溶液3mL渦旋混勻，上固相萃取柱凈化。

結(jié)果表明：兩種方式的回收率均較高，但基于經(jīng)濟(jì)效益及操作便利性的考慮，試驗(yàn)選擇0．1mol·L－1鹽酸溶液－乙腈提取，具體的提取條件見1．3．1節(jié)。

2．3 凈化條件的選擇

奶粉中的基質(zhì)較為復(fù)雜，包括蛋白質(zhì)、脂肪、糖類、礦物質(zhì)和維生素等，提取后需凈化才能上機(jī)分析，否則會污染離子源。苯并咪唑類藥物為弱堿性，試驗(yàn)選擇適合于堿性化合物吸附的 Waters Oasis MCX固相萃取柱，對復(fù)雜的樣品基質(zhì)凈化效果較好。同時(shí)需考慮固相萃取柱的飽和載量，試驗(yàn)選用了（6cc，500mg）、（3cc，60mg）等兩種大小的固相萃取柱。結(jié)果表明：當(dāng)使用純對照品上柱分析時(shí)，二者保留能力相同。

試驗(yàn)進(jìn)一步分別考察了4，10，20μg·L－1等3個(gè)基質(zhì)加標(biāo)提取液上柱分析時(shí)兩種固相萃取柱保留能力的差別。結(jié)果表明：當(dāng)加標(biāo)質(zhì)量濃度為4μg·L－1時(shí)，小體積容量柱的保留為大體積容量柱的90%以上；當(dāng)加標(biāo)質(zhì)量濃度為10μg·L－1時(shí)，小體積容量柱的保留約為大體積容量柱的50%；當(dāng)加標(biāo)質(zhì)量濃度為20μg·L－1時(shí)，小體積容量柱的保留為大體積容量柱的40%以上。說明當(dāng)使用基質(zhì)加標(biāo)提取液上柱分析時(shí)，MCX固相萃取柱（3cc，60mg）會產(chǎn)生過載現(xiàn)象。綜上所述，試驗(yàn)選擇Waters Oasis MCX固相萃取柱（6cc，500mg）為凈化柱。

2．4 色譜條件的選擇

2．4．1 色譜柱

16種苯并咪唑類藥物在C18色譜柱上均有較強(qiáng)的保留，在相同的流動相比例下分別考察了幾種C18色譜柱對16種苯并咪唑類藥物的分離效果。試驗(yàn)結(jié)果表明：Waters ACQUITY UPLC BEH 色譜柱（2．1mm×50mm，1．7μm）的分離效果較好，除噻苯咪唑與阿苯達(dá)唑－2－氨基砜、2－氨基氟苯咪唑與阿苯達(dá)唑砜、羥基甲苯咪唑與氨基甲苯咪唑不能完全分離，其他各化合物均能很好地分離，且峰形良好，見圖1。試驗(yàn)選擇 Waters ACQUITY UPLC BEH色譜柱為分析柱。

2．4．2 流動相

試驗(yàn)分別用純水和0．02%甲酸溶液為水相，對分離效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：使用0．02%甲酸溶液響應(yīng)值更高，在ESI＋模式下，水相中加入甲酸有利于提高待測化合物的離子化效率。分別以甲醇、乙腈為有機(jī)相，對分離效果進(jìn)行了比較，結(jié)果表明：使用乙腈時(shí)，分離效果更好。試驗(yàn)選擇以0．02%甲酸溶液為水相，乙腈為有機(jī)相進(jìn)行梯度洗脫，梯度洗脫程序見1．2節(jié)。

2．5 質(zhì)譜條件的選擇

質(zhì)譜中最常用的離子源有大氣壓力化學(xué)電離源（APCI）和電噴霧離子源（ESI）兩種，APCI比較適合于中性或極性小的化合物的分析，而ESI則更適合于極性大的酸性或堿性化合物的分析。苯并咪唑類藥物屬于中等極性的弱堿性化合物，因此試驗(yàn)采用ESI。將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以蠕動泵注射的方式注入質(zhì)譜，分別在正負(fù)離子模式下進(jìn)行掃描，在正離子模式下均有較好響應(yīng)的準(zhǔn)分子離子峰，并在MRM模式下優(yōu)化儀器參數(shù)，使測定靈敏度更高。優(yōu)化的質(zhì)譜條件見1．2節(jié)。

苯并咪唑類藥物均有苯并咪唑雜環(huán)結(jié)構(gòu)，因此在質(zhì)譜圖中容易出現(xiàn)相同的碎片離子［15］，如阿苯達(dá)唑砜與羥基甲苯咪唑的相對分子質(zhì)量相近，在單標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，用子離子掃描模式確定監(jiān)測離子對時(shí)，阿苯達(dá)唑砜與羥基甲苯咪唑會產(chǎn)生相同的離子對m／z 298／159，298／266。為了使這兩種化合物分離，在保證靈敏度的條件下盡可能選擇各自特有的特征離子對，試驗(yàn)選擇阿苯達(dá)唑砜的監(jiān)測離子對為m／z298．17／224．00，298．17／190．80，羥基甲苯咪唑監(jiān) 測 離 子 對 為 m／z 298．00／265．90，298．00／107．20。優(yōu)化的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2．6 工作曲線和檢出限

稱取空白樣品2．000g置于50mL離心管中，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行前處理，作為檢出限及測定下限的基質(zhì)工作溶液。當(dāng)進(jìn)樣量為2μL時(shí)，根據(jù)3倍和10倍信噪比，分別確定檢出限（3S／N）以及測定下限（10S／N），結(jié)果見表2。對于前處理復(fù)雜的樣品，當(dāng)定量分析單個(gè)或少量幾個(gè)待測組分時(shí)，可采用同位素稀釋內(nèi)標(biāo)法，但當(dāng)分析種類較多的化合物組分時(shí)，需要多個(gè)內(nèi)標(biāo)，增加了方法的復(fù)雜性和成本。試驗(yàn)中基質(zhì)較單一，采用基質(zhì)加標(biāo)外標(biāo)法定量，以測定下限為最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)，20倍測定下限為最高質(zhì)量分?jǐn)?shù)，作系列質(zhì)量分?jǐn)?shù)基質(zhì)加標(biāo)工作曲線溶液，以峰面積對質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

表2 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab．2 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

2．7 精密度和回收試驗(yàn)

分別在低（2倍測定下限）、中（4倍測定下限）、高（20倍測定下限）等3個(gè)濃度水平下對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度水平平行測定6次，其加標(biāo)回收率和測定值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）見表3。

表3（續(xù)）

由表3可知：RSD（n＝6）均小于9．0%，表明方法具有較好的重復(fù)性。

2．8 樣品分析

將10批奶粉樣品，按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測定，通過比較樣品與對照品圖譜的保留時(shí)間以及監(jiān)測離子通道的豐度比，測定樣品中苯并咪唑類藥物的含量。結(jié)果表明：16種苯并咪唑類藥物在10批樣品中均未檢出。

本工作采用超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法測定奶粉中苯并咪唑類藥物殘留量。方法操作簡單、專屬性強(qiáng)、靈敏度高、準(zhǔn)確性好，可滿足奶粉中的苯并咪唑類藥物殘留量的測定要求。

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