基于四氧化三鈷-石墨烯納米復(fù)合材料的電化學(xué)DNA傳感器

甄 超，牛學(xué)良，沈青鳳，蒙澤慧，閆麗君，何博琳，門永玲，孫 偉,2*

(1.海南師范大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，海南 ?？冢?71158；2.海口市功能材料與光電化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口，571158)

電化學(xué)DNA生物傳感器是將DNA雜交反應(yīng)與電化學(xué)分析相偶合的一種新方法，具有靈敏度高、選擇性好、操作快速、樣品用量少等特點(diǎn)，并且可以對(duì)特定目標(biāo)序列進(jìn)行快速檢測(cè)，在臨床檢測(cè)、食品分析等很多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[1-4].

石墨烯是一種只有一個(gè)碳原子厚度的二維納米材料，表現(xiàn)出獨(dú)特的光學(xué)、熱學(xué)、電子和機(jī)械性能等理化性質(zhì)，使其成為各領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[5-8].石墨烯因其具有電化學(xué)窗口寬、比表面積大和導(dǎo)電性好等優(yōu)點(diǎn)，在電化學(xué)分析和納米傳感方向表現(xiàn)出重要的應(yīng)用前景[9].利用石墨烯及其復(fù)合材料構(gòu)建電化學(xué)DNA生物傳感器，可以充分發(fā)揮石墨烯復(fù)合材料的表面積大、穩(wěn)定性好、導(dǎo)電性高等優(yōu)點(diǎn)，有效增加界面的導(dǎo)電性以及探針ssDNA在材料表面的負(fù)載量，達(dá)到提高靈敏度的目的[10].

本文將四氧化三鈷-石墨烯(Co3O4-GR)納米復(fù)合材料固定于工作電極表面得到相應(yīng)的石墨烯納米復(fù)合材料修飾電極，優(yōu)化修飾材料的濃度，進(jìn)一步將探針ssDNA固定在電極表面制備電化學(xué)DNA生物傳感器.以鐵氰化鉀為電化學(xué)探針，通過雜交前后電化學(xué)信號(hào)的差異來檢測(cè)目標(biāo)ssDNA序列，并對(duì)副溶血弧菌tlh特征序列進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，獲得了滿意的結(jié)果.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

電化學(xué)實(shí)驗(yàn)如循環(huán)伏安(CV)、差分脈沖伏安(DPV)和交流阻抗(EIS)均在CHI 660E型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器公司)上完成.采用常規(guī)三電極系統(tǒng)，以修飾電極為工作電極，飽和甘汞電極(SCE)為參比電極，鉑絲為輔助電極.JSM-7100F掃描電子顯微鏡(SEM，日本電子公司).

石墨粉(上海膠體化學(xué)廠，顆粒度≤ 30 μm)；1-己基吡啶六氟磷酸鹽(HPPF6，蘭州雨陸精細(xì)化工有限公司)；鐵氰化鉀(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司)；殼聚糖(0.5% CTS)；Co3O4-GR納米復(fù)合材料(南京先豐納米材料有限公司)；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水.

由上海生工生物技術(shù)有限公司提供的與副溶血弧菌tlh基因相關(guān)的23個(gè)堿基序列如下：

探針序列：5′-GAT GAC ACT GCC AGA TGC GAC GA-3′；目標(biāo)序列：5′-TCG TCG CAT CTG GCA GTG TCA TC-3′；單堿基錯(cuò)配序列：5′-TCG TCG CAT CTA GCA GTG TCA TC-3′；三堿基錯(cuò)配序列：5′-TAG TCG CAT CTA GCA GTG TCA GC-3′；非互補(bǔ)序列：5′-ATC CTT TGC AAT TGC CCA GTC GG-3′.

1.2 CTS/Co3O4-GR/CILE的制備

按照質(zhì)量比為2:1分別稱取石墨粉和離子液體于研缽中，充分混合研磨后裝入玻璃電極管中，壓實(shí)后內(nèi)插銅線作為電極導(dǎo)線，即制得離子液體碳糊電極(CILE)，使用前在稱量紙上打磨至鏡面[11].

將8 μL 1.0 mg/mL的Co3O4-GR溶液均勻涂布在CILE表面，室溫晾干后再滴涂6 μL 0.5% CTS，自然晾干后即制得所需的工作電極(CTS/Co3O4-GR/CILE).

1.3 電化學(xué)DNA傳感器的制備

在CTS/Co3O4-GR/CILE表面均勻滴涂10.0 μL含有1.0×10-6mol/L探針ssDNA序列的PBS溶液，自然干燥后為了除去未吸附的探針ssDNA，用水沖洗修飾電極即得到ssDNA/CTS/Co3O4-GR/CILE.帶正電性的CTS聚陽(yáng)離子膜可以靜電吸附帶負(fù)電性DNA磷酸骨架，進(jìn)而將探針ssDNA固定在修飾電極表面.

利用滴涂法完成DNA雜交反應(yīng)[12]，將10.0 μL含有目標(biāo)ssDNA序列的PBS緩沖溶液滴涂在ssDNA/CTS/Co3O4-GR/CILE表面，晾干后用水洗滌，即得到dsDNA/CTS/Co3O4-GR/CILE.

1.4 電化學(xué)檢測(cè)

DPV實(shí)驗(yàn)在10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)參數(shù)為電位增量0.008 mV，脈沖寬度0.05 s，脈沖周期0.2 s.CV實(shí)驗(yàn)在1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5 mol/L KCl混合溶液中進(jìn)行，掃速為0.1 V/s；EIS實(shí)驗(yàn)在10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中進(jìn)行，頻率范圍為0.1～105Hz.

2 結(jié)果與分析

2.1 修飾電極的制備優(yōu)化

以1.0 mmol/L鐵氰化鉀溶液研究電極表面Co3O4-GR用量對(duì)修飾電極性能的影響，結(jié)果如圖1所示.不同濃度Co3O4-GR納米復(fù)合材料的存在對(duì)電極表面電子的傳導(dǎo)具有不同的影響，當(dāng)其濃度從0.3 mg/mL增加到1.0 mg/mL時(shí),峰電流逐漸增大，而濃度繼續(xù)增大時(shí)峰電流卻逐漸減小，在1.0 mg/mL時(shí)峰電流最大，所以選擇1.0 mg/mL為Co3O4-GR修飾電極的最佳濃度.電極表面納米材料的濃度太大會(huì)使修飾層過厚而阻礙電子的轉(zhuǎn)移.

圖1 Co3O4-GR納米復(fù)合材料濃度與峰電流的關(guān)系曲線，溶液為1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.5 mol/L KCl的混合液，掃速100 mV/s

Fig. 1 Relationship of Co3O4-GR concentration and the peak current in 1.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] and 0.5 mol/L KCl mixture solution with scan rate as 100 mV/s

圖2 Co3O4-GR/CILE的掃描電鏡圖

Fig. 2 SEM image of Co3O4-GR/CILE

2.2 SEM結(jié)果分析

Co3O4-GR/CILE的SEM結(jié)果如圖2所示.從圖2中可以看出Co3O4納米顆粒均勻的分散在GR表面.Co3O4-GR復(fù)合材料的存在增大了電極的有效面積，進(jìn)而可以增加探針ssDNA在電極表面的負(fù)載量，同時(shí)Co3O4-GR復(fù)合材料較高的導(dǎo)電性有利于電極表面電子的傳輸.

圖3 不同電極在10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的EIS圖(電極從a到c依次為CILE，CTS/Co3O4-GR/CILE和Co3O4-GR/CILE)Fig. 3 EIS results of (a) CILE, (b) CTS/Co3O4-GR/CILE, (c)Co3O4-GR/CILE in 10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]and 0.1 mol/L KCl mixture solution

2.3 交流阻抗分析

圖3為不同修飾電極的交流阻抗圖，電解質(zhì)溶液為10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl的混合溶液.由圖可知Co3O4-GR/CILE(曲線c)的阻抗值小于裸電極CILE(曲線a)的阻抗值，說明高導(dǎo)電性的Co3O4-GR降低了界面電阻.而在CTS/Co3O4-GR/CILE(曲線b)上阻抗值增大，是因?yàn)镃TS為非導(dǎo)電高分子材料，會(huì)阻礙電極表面的電子傳遞.

2.4 選擇性研究

對(duì)所制備的電化學(xué)DNA傳感器的選擇性進(jìn)行了研究，圖4是ssDNA修飾電極與1.0×10-6mol/L不同錯(cuò)配序列雜交后的DPV曲線.從圖4可以看出在ssDNA/CTS/Co3O4-GR/CILE上的電流響應(yīng)最大(曲線e).當(dāng)與完全互補(bǔ)的目標(biāo)序列DNA雜交后電流降低最大(曲線a)，這是因?yàn)殡姌O表面上探針ssDNA與目標(biāo)ssDNA序列雜交后的堿基配對(duì)作用會(huì)在電極表面形成dsDNA，使電極表面的負(fù)電荷量最大，對(duì)鐵氰化鉀的阻礙作用最大，導(dǎo)致電流最小.非互補(bǔ)序列(曲線d)，三堿基錯(cuò)配序列(曲線c)和單堿基錯(cuò)配序列(曲線b)與探針序列發(fā)生分子雜交反應(yīng)后，峰電流值低于雜交前而高于完全雜交的峰電流值.這是由于雜交反應(yīng)會(huì)使電極表面部分形成dsDNA，導(dǎo)致電極表面的帶電荷量有差異，因此電流會(huì)發(fā)生變化.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器對(duì)不同序列的檢測(cè)具有良好的選擇性.

圖4 ssDNA/CTS/Co3O4-GR/CILE與不同目標(biāo)序列雜交后在10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L KCl混合溶液中的差分脈沖伏安曲線.(a)與目標(biāo)序列雜交后；(b)與單堿基錯(cuò)配序列雜交后；(c)與三堿基錯(cuò)配序列雜交后；(d)與非互補(bǔ)堿基序列雜交后；(e)雜交前Fig. 4 Differential pulse voltammograms of ssDNA/CTS/Co3O4-GR/CILE hybridizated with the complementary ssDNA sequence (a), one-base mismatched sequence (b), three-base mismatched sequence (c), the noncomplementary sequence (d) and before hybridization (e) in 10.0 mmol/L K3[Fe(CN)6] and 0.1 mol/L KCl

2.5 工作曲線

在優(yōu)化的條件下，將電化學(xué)DNA傳感器用于不同濃度的目標(biāo)基因tlh序列的檢測(cè)，在10.0 mol/L K3[Fe(CN)6]和0.1 mol/L的KCl溶液中進(jìn)行DPV測(cè)試.如圖5A所示，隨著目標(biāo)序列濃度的增加，峰電流的值逐漸減小.這是因?yàn)槟繕?biāo)ssDNA濃度的增加使電極表面形成的dsDNA數(shù)量增加，所帶電荷量也增大，所以鐵氰化鉀的峰電流逐漸減小.如圖5B所示，還原峰電流(Ip)與目標(biāo)序列濃度的對(duì)數(shù)在1.0×10-14～1.0×10-6mol/L濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出線性關(guān)系，線性回歸方程為Ipa(μA) = 134.31-5.78 logC (mol/L) (γ = 0.981)，檢測(cè)限為3.3×10-15mol/L (3σ).表1匯總了對(duì)一些文獻(xiàn)報(bào)道的電化學(xué)DNA傳感器的分析參數(shù)，從表1中可以看出，本方法具有較寬的線性范圍和較低的檢測(cè)限.

圖5 (A)與不同濃度的目標(biāo)序列雜交后的DPV曲線(從a到j(luò)濃度依次為1.0×10-6, 1.0×10-7, 1.0×10-8，1.0×10-9，1.0×10-10，1.0×10-11，1.0×10-12，1.0×10-13，1.0×10-14，0 mol/L),(B)目標(biāo)ssDNA序列濃度的對(duì)數(shù)與峰電流值的線性關(guān)系曲線Fig. 5 (A) Differential pulse voltammograms of probe ssDNA modified electrode reacted with different concentrations target ssDNA sequence (From a to j: 1.0×10-6, 1.0×10-7, 1.0×10-8, 1.0×10-9, 1.0×10-10, 1.0×10-11, 1.0×10-12, 1.0×10-13, 1.0×10-14, 0 mol/L), (B) Linear relationship of I versus log C

電極線性范圍/(mol/L)檢測(cè)限/(mol/L)參考文獻(xiàn)rGO/SPE7.5×10-12～2.5×10-91.5×10-1213CS/TiO2/ERGO/CILE1.0×10-12～1.0×10-63.17×10-1314DNA-nsZnO/ITO/GP1.0×10-12～1.0×10-61.0×10-1315ACNTS/probel1/targetDNA/CdTe-ssDNA1.0×10-12～1.0×10-84.0×10-1316CTS/Co3O4-GR/CILE1.0×10-14～1.0×10-63.33×10-15本文

注：rGO，還原氧化石墨烯；SPE，絲網(wǎng)印刷電極；ERGO，電化學(xué)還原氧化石墨烯；CS，殼聚糖；CILE，離子液體碳糊電極；ITO，銦錫氧化物導(dǎo)電玻璃；nsZnO，納米氧化鋅；CdTe-ssDNA，CdTe量子點(diǎn)修飾的DNA探針；ACNTS，直立碳納米管列陣；GR，石墨烯

3 結(jié)論

制備了Co3O4-GR納米復(fù)合材料修飾的離子液體碳糊電極，并通過滴涂法固定探針ssDNA序列構(gòu)建無(wú)指示劑的電化學(xué)DNA傳感器.GR和Co3O4兩者之間存在良好的協(xié)同作用，能夠加快電子的轉(zhuǎn)移速率.同時(shí)Co3O4-GR納米復(fù)合材料增加了電極界面的有效面積，進(jìn)而增加了探針DNA序列的負(fù)載量.將構(gòu)建的電化學(xué)DNA生物傳感器用于副溶血弧菌tlh特征序列的檢測(cè)，可以實(shí)現(xiàn)單堿基和三堿基錯(cuò)配DNA序列的識(shí)別測(cè)定，提高了所構(gòu)建的電化學(xué)DNA傳感器的靈敏度，具有較好的應(yīng)用前景.

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