基于樹(shù)突狀細(xì)胞激活建立皮膚致敏的體外方法

陳 健，柯逸暉，陳 彧，談偉君，程樹(shù)軍*(1.廣州市華代生物科技有限公司，廣州 5106； .廣東檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心， 廣州 5106； .廣東藥科大學(xué)，廣州 510006)

接觸性過(guò)敏性皮炎(allergy contact dermatitis，ACD)是由T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗原特異性皮膚過(guò)敏反應(yīng)，以抗原刺激后局部皮膚出現(xiàn)一系列的皮膚炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、炎癥介質(zhì)釋放為特征，屬于遲發(fā)IV型變態(tài)反應(yīng)。臨床主要表現(xiàn)為瘙癢、紅斑、紅腫等癥狀，對(duì)患者的正常生活和工作影響較大。日常生活中能引起ACD的物質(zhì)繁多，如化妝品、香精香料等，因此對(duì)這些物質(zhì)的致敏性檢測(cè)也顯得至關(guān)重要。法規(guī)認(rèn)可的皮膚致敏檢測(cè)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方法是豚鼠最大值試驗(yàn)(guinea pig maximinatim test，GPMT)和封閉涂皮法(buchler test，BT)，后來(lái)，開(kāi)發(fā)了小鼠局部淋巴結(jié)試驗(yàn)(local lymph note assay，LLNA)，這些試驗(yàn)需要大量動(dòng)物，耗時(shí)長(zhǎng)、成本高。隨著替代方法的興起，ACD發(fā)生過(guò)程與角質(zhì)細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和T細(xì)胞之間關(guān)系逐漸清晰，在有害結(jié)局通路(adverse outcome pathway，AOP)理論指導(dǎo)下，皮膚致敏替代方法研究取得了顯著的進(jìn)步[1]，其中對(duì)于樹(shù)突狀細(xì)胞激活這一關(guān)鍵事件的研究最為活躍。

1 皮膚致敏的AOP理論與樹(shù)突狀細(xì)胞的關(guān)鍵作用

基于AOP理論，皮膚致敏的AOP通路可分為一個(gè)起始事件和三個(gè)關(guān)鍵事件(key event，KE)。分子起始事件(molecular initiating event，MIE)：具有親電作用的化學(xué)物質(zhì)與表皮蛋白質(zhì)的親核位點(diǎn)共價(jià)結(jié)合，形成半抗原。角質(zhì)細(xì)胞激活(KE1)：角質(zhì)細(xì)胞對(duì)半抗原-蛋白質(zhì)復(fù)合物的攝取，誘導(dǎo)炎性因子生成。樹(shù)突狀細(xì)胞(dendritic cell，DC)激活(KE2)，DC攝取和呈遞抗原，未成熟的表皮DC識(shí)別半抗原蛋白復(fù)合物，表面特征性標(biāo)志物表達(dá)上升，同時(shí)釋放細(xì)胞因子，遷移至淋巴結(jié)，通過(guò)主要組織相容性復(fù)合物(major histocompatibility complex，MHC)分子將半抗原-蛋白質(zhì)復(fù)合物呈遞給T細(xì)胞。T細(xì)胞活化/增殖(KE3)：T細(xì)胞識(shí)別細(xì)胞表面的MHC呈遞的抗原肽被激活形成記憶T細(xì)胞，當(dāng)皮膚再次接觸致敏原時(shí)，這些記憶T細(xì)胞就會(huì)增殖，誘發(fā)ACD。針對(duì)這些關(guān)鍵事件開(kāi)發(fā)出不同機(jī)制的皮膚致敏的替代方法，其中直接肽鏈反應(yīng)分析(direct peptide reaction assay，DPRA)、KeratinoSens、U-SENSTM和人細(xì)胞系活化試驗(yàn)(human cell line activation test，h-CLAT)已經(jīng)通過(guò)驗(yàn)證，被經(jīng)濟(jì)合作和開(kāi)發(fā)組織(Organization for Economic Co-operation and Development，OECD)接受為測(cè)試指南442C、442D和442E[2]。

在AOP通路中，DC作為機(jī)體功能最強(qiáng)的專(zhuān)職抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APC)，向上可以攝取呈遞抗原，向下可以活化T細(xì)胞，激活過(guò)敏免疫反應(yīng)，在AOP通路中作為關(guān)鍵事件2起到承上啟下的作用。其中，表皮和胃腸上皮中的DC又稱(chēng)為朗格漢斯細(xì)胞(Langerhans cell，LC)，LC在活化成熟時(shí)，Ⅱ型MHC、共刺激分子(CD86、CD54、CD80和CD40)等表達(dá)上調(diào)。但由于原代樹(shù)突狀細(xì)胞在誘導(dǎo)分化和提純方面存在很大困難，因此有研究選用具有相同性質(zhì)的類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞如THP-1細(xì)胞、U937細(xì)胞等來(lái)開(kāi)發(fā)替代方法。

2 基于KE2的體外方法

2.1 h-CLAT體外致敏檢測(cè)方法

THP-1細(xì)胞是一類(lèi)單核細(xì)胞，與LC功能相似，實(shí)驗(yàn)中不需要誘導(dǎo)分化就能準(zhǔn)確判斷出化合物的致敏性，大量研究發(fā)現(xiàn)THP-1細(xì)胞相比其他單核細(xì)胞更穩(wěn)定，準(zhǔn)確率更高。使用THP-1細(xì)胞構(gòu)建的h-CLAT方法于2016年被OECD列為測(cè)試指南442E。實(shí)驗(yàn)時(shí)先測(cè)定受試物的細(xì)胞毒性，確定75%細(xì)胞活率濃度，再將THP-1細(xì)胞暴露受試物24 h，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD86和CD54的表達(dá)，對(duì)受試物致敏性進(jìn)行判斷。陳彧等[3]采用h-CLAT方法，對(duì)11種已知成分化學(xué)物質(zhì)和9種未知植物樣品和日用產(chǎn)品進(jìn)行預(yù)測(cè)，準(zhǔn)確區(qū)分了11種已知參考物質(zhì)的皮膚致敏性，對(duì)9種未知樣品的分類(lèi)結(jié)果與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。Sakaguchi等[4]也使用同樣的方法對(duì)8種防腐劑的皮膚致敏性進(jìn)行了評(píng)價(jià)。Parise等[5]在分析23種物質(zhì)致敏性時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86表達(dá)情況和細(xì)胞炎性因子白介素8(interleukin-8，IL-8)釋放量之間存在正相關(guān)，說(shuō)明IL-8也可以作為鑒別化學(xué)物質(zhì)致敏性的指標(biāo)。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)白介素1β(interleukin-1β，IL-1β)釋放量與受試物致敏性之間存在關(guān)聯(lián)。Ashikaga等[6]研究發(fā)現(xiàn)在THP-1細(xì)胞，能觀察到致敏暴露組CD86與MHC Ⅱ類(lèi)分子的表達(dá)較非致敏組明顯上升，提示CD86、MHC Ⅱ類(lèi)分子可能是區(qū)分致敏物與刺激物的敏感指標(biāo)。研究表明，h-CLAT在預(yù)測(cè)親脂性物質(zhì)致敏性時(shí)靈敏度和準(zhǔn)確度分別為95%和88%[7]。

2.2 U-SENSTM體外致敏檢測(cè)方法

U937細(xì)胞是來(lái)源于人體骨髓系的單核細(xì)胞，在細(xì)胞被活化后其表面標(biāo)志物CD86會(huì)特異性上升，因此該細(xì)胞也可用于模擬DC細(xì)胞激活引起T細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟。U-SENSTM就是基于該細(xì)胞系建立的體外致敏檢測(cè)方法，將受試物與U937細(xì)胞共孵育后，定量檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86表達(dá)的變化，從而對(duì)受試物致敏性進(jìn)行判斷。Alépée等[8]報(bào)道4個(gè)實(shí)驗(yàn)室使用U-SENSTM方法對(duì)24種物質(zhì)的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該方法的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)可重復(fù)性約為90%，實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性為84%。對(duì)24種受試物進(jìn)行預(yù)測(cè)的敏感性、特異性和準(zhǔn)確度均高于93.8%。Piroird等[9]通過(guò)將175種物質(zhì)的U-SENSTM評(píng)價(jià)結(jié)果與人體數(shù)據(jù)和LLNA試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)U-SENSTM的特異性為79%，靈敏度為90%，準(zhǔn)確度為85%。與h-CLAT方法相比，檢測(cè)參數(shù)只有CD86，可以作為組合測(cè)試策略的一部分。該方法在2017年作為補(bǔ)充方法列入OECD測(cè)試指南OECD442E。

2.3 外周血單核細(xì)胞試驗(yàn)

外周血單核細(xì)胞(peripheral blood monocyte-derived cell，PBMDC)是從新鮮血沉棕黃層中分離得到的單核細(xì)胞，使用粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)和白介素4(interleukin-4，IL-4)誘導(dǎo)分化形成CD1a-/CD14+單核細(xì)胞。在暴露于受試物48 h后，根據(jù)細(xì)胞表面CD86的表達(dá)情況判斷受試物致敏性。Karschuk等[10]使用誘導(dǎo)的CD1a-/CD14+單核細(xì)胞對(duì)受試物的致敏性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)相比于刺激性化學(xué)物和非致敏性化學(xué)物質(zhì)，致敏性化學(xué)物會(huì)特異性使細(xì)胞CD86表達(dá)增加，而CD83與人白細(xì)胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)則不明顯，提示在PBMDC實(shí)驗(yàn)中，同樣選擇了CD86作為評(píng)價(jià)受試物致敏性的特異性指標(biāo)。但細(xì)胞供體來(lái)源不穩(wěn)定，細(xì)胞需要誘導(dǎo)分化。

2.4 VITOSENS?試驗(yàn)

VITOSENS?試驗(yàn)使用來(lái)自人臍帶血分化的CD34+祖細(xì)胞來(lái)對(duì)受試物致敏性進(jìn)行檢測(cè)，在與受試物共孵育后，通過(guò)比較暴露組與溶劑組中趨化因子2型受體(chemokine receptor type 2，CCR2)和cAMP應(yīng)答元件調(diào)節(jié)因子(camp responsive element modulator，CREM)的表達(dá)來(lái)判斷受試物致敏性。將細(xì)胞暴露于受試物24 h后，使用流式細(xì)胞儀測(cè)定受試物的IC20值。然后以測(cè)定的IC20為最低暴露劑量，孵育6 h取部分細(xì)胞通過(guò)qPCR分析相關(guān)基因的表達(dá)，孵育24 h后收集全部細(xì)胞，使用qPCR測(cè)定細(xì)胞CCR2和CREM表達(dá)情況。Hooyberghs等[11]通過(guò)對(duì)10種致敏物和11種非致敏物進(jìn)行檢測(cè)，使用RT-PCR分析基因表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)致敏組基因CREM和CCR2的表達(dá)均顯著高于非致敏組(P< 0.05)。Lambrechts等[12]使用該方法對(duì)15種已知致敏性化學(xué)物進(jìn)行預(yù)測(cè)。實(shí)驗(yàn)中需要使用qPCR技術(shù)，實(shí)驗(yàn)成本相對(duì)其他體外替代方法較高，且不同來(lái)源的CD34+祖細(xì)胞也會(huì)影響到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性。

2.5 基因組過(guò)敏原快速檢測(cè)方法

MUTZ-3是人類(lèi)急性骨髓單核細(xì)胞白血病細(xì)胞系，其在免疫反應(yīng)中具有激活特異性T細(xì)胞的能力，并且在成熟過(guò)程中也其細(xì)胞相關(guān)表型變化也與DC相似，能夠表達(dá)CD1a、HLA-DR和CD54，同時(shí)還能低表達(dá)CD80和CD86。利用MUTZ-3細(xì)胞在免疫反應(yīng)中的特性建立了體外致敏預(yù)測(cè)的基因組過(guò)敏原快速檢測(cè)方法(genomic allergen rapid detection，GARD)。Johansson等[13]在研究使用20種非致敏物和20種致敏物刺激MUTZ-3，共孵育24 h后，通過(guò)對(duì)MUTZ-3細(xì)胞的基因表型進(jìn)行分析，確定了200個(gè)相關(guān)基因的表達(dá)與受試物致敏性存在相關(guān)性，也提示該方法在有能力對(duì)受試物的致敏性進(jìn)行預(yù)測(cè)。但該方法與VITOSENS?相似，檢測(cè)成本比較高。

3 以KE2為核心建立組合模型和方法

類(lèi)樹(shù)突狀細(xì)胞作為免疫細(xì)胞能夠單獨(dú)用來(lái)檢測(cè)化學(xué)物質(zhì)致敏性，但作為體外系統(tǒng)的單細(xì)胞體系，在評(píng)價(jià)化合物致敏性時(shí)會(huì)因?yàn)橄到y(tǒng)代謝機(jī)能不足，對(duì)于一些小分子物質(zhì)或者半抗原類(lèi)物質(zhì)還存在缺陷。同時(shí)，細(xì)胞活率對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)有很大影響，為了改善這種情況，基于單細(xì)胞體系的致敏檢測(cè)系統(tǒng)做出了改良。

3.1 THP-1細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)模型

角質(zhì)形成細(xì)胞除了構(gòu)成皮膚的屏障功能，還能通過(guò)代謝功能對(duì)外源受試物進(jìn)行處理，并產(chǎn)生和釋放炎性因子，同時(shí)也可對(duì)半抗原或半抗原前體物進(jìn)行修飾、活化和蛋白結(jié)合。在皮膚致敏感的AOP理論中，角質(zhì)形成細(xì)胞激活是KE1?；诮琴|(zhì)細(xì)胞活化的方法可用于篩選致敏物，但由于其并非專(zhuān)職的抗原提呈細(xì)胞，因此使用正常角質(zhì)細(xì)胞的測(cè)試方法通常預(yù)測(cè)能力較弱，可以通過(guò)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行基因修飾轉(zhuǎn)染抗氧化元件(如KeratinoSens方法)以提高其敏感性，或者與其它方法組合使用。

Hennen等[14]通過(guò)將HaCaT與THP-1細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)來(lái)探討共培養(yǎng)體系在預(yù)測(cè)化學(xué)物致敏性中的優(yōu)勢(shì)。單獨(dú)培養(yǎng)HaCaT 48 h后，加入受試物和THP-1細(xì)胞共培養(yǎng)24 h，分析細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86、CD40和CD54的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)體系中THP-1細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)量顯著增加。并且在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測(cè)化學(xué)物致敏性時(shí)，THP-1細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)不受細(xì)胞活率影響。使用CD86作為生物標(biāo)志物時(shí)，共培養(yǎng)體系還可以用來(lái)區(qū)分半抗原物質(zhì)和半抗原前體物質(zhì)。這些研究成果對(duì)體外致敏評(píng)價(jià)技術(shù)的發(fā)展提供了很好的基礎(chǔ)。近來(lái)，Hennen等[15]使用共培養(yǎng)方法正確區(qū)分了14種致敏物和9種非致敏物，說(shuō)明共培養(yǎng)體系能提高致敏檢測(cè)的靈敏度和特異性。采用靜態(tài)的兩種細(xì)胞的共培養(yǎng)模型不僅可用于研究角質(zhì)細(xì)胞與THP-1細(xì)胞產(chǎn)生致敏反應(yīng)的機(jī)制，還有助于探討細(xì)胞間的相互作用。

3.2 THP-1細(xì)胞與皮膚模型共培養(yǎng)模型

盡管共培養(yǎng)體系能夠提升體外致敏檢測(cè)試驗(yàn)的靈敏度和特異度，但在處理難溶或不溶性物質(zhì)時(shí)，仍然存在很大的缺陷。隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，組織工程皮膚也逐漸被應(yīng)用到化學(xué)品的安全評(píng)價(jià)中，如普遍使用的商品化皮膚模型EpiskinTM、EpidermTM和SkinEthie RHE。皮膚模型經(jīng)刺激物或變應(yīng)原處理后會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞活力改變、組織學(xué)改變以及細(xì)胞因子釋放等，可通過(guò)有效手段進(jìn)行檢測(cè)，但是單獨(dú)皮膚模型不能模擬復(fù)雜的生物代謝過(guò)程，并且沒(méi)有免疫細(xì)胞參與，可能無(wú)法對(duì)待測(cè)物進(jìn)行有效預(yù)測(cè)。Cao等[16]使用分離的原代角質(zhì)形成細(xì)胞，經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后分化形成組織工程表皮，將THP-1細(xì)胞與組織工程表皮共培養(yǎng)24 h后，將質(zhì)量濃度2 g/L DNFB和10 g/L SDS分別取5 μL均勻涂抹于構(gòu)建的組織工程表皮表面，孵育24 h。孵育完成后使用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和CD54的活化情況，使用ELISA試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液中白細(xì)胞介素1β的水平。結(jié)果DNFB處理組中，THP-1細(xì)胞表面標(biāo)志物CD86和CD54表達(dá)量顯著增加，而在SDS處理組中則未觀察到此現(xiàn)象，提示該檢測(cè)模型能用來(lái)預(yù)測(cè)化學(xué)物致敏性。

3.3 含LC的皮膚模型

含免疫細(xì)胞的皮膚模型的構(gòu)建有一定的技術(shù)難度，文獻(xiàn)報(bào)道了一種含有功能性LC細(xì)胞的皮膚模型，采用MUTZ-3來(lái)源的LC細(xì)胞，以模擬人體皮膚的方式局部接觸抗原或刺激物，可以啟動(dòng)固有的免疫應(yīng)答[17]。模型開(kāi)發(fā)的下一步是引入T細(xì)胞，用于研究獲得性免疫反應(yīng)。把含LC細(xì)胞的皮膚模型與T細(xì)胞共培養(yǎng)，可以實(shí)現(xiàn)把AOP通路中三個(gè)關(guān)鍵事件的整合成一個(gè)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。

3.4 皮膚致敏芯片

THP-1細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞，或者與皮膚模型的共培養(yǎng)模型，是一種靜態(tài)水平的研究?jī)煞N或多種細(xì)胞間相互作用的模型。隨著微流控技術(shù)的發(fā)展，小型化、高通量的模擬人體皮膚血液流動(dòng)的動(dòng)態(tài)環(huán)境的裝置被開(kāi)發(fā)出來(lái)，利用這種皮膚致敏感芯片系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)將THP-1細(xì)胞與角質(zhì)細(xì)胞或者皮膚模型動(dòng)態(tài)連接起來(lái)，使用計(jì)算機(jī)進(jìn)行精確控制、微量加樣和實(shí)時(shí)檢測(cè)相關(guān)參數(shù)。對(duì)于精確研究低致敏物質(zhì)的量效關(guān)系、模擬生理狀態(tài)下細(xì)胞之間的交叉對(duì)話(huà)(cross-talking)，深入了解細(xì)胞表面標(biāo)志物、炎性因子釋放和基因組的調(diào)控提供了理想的模型。目前，使用皮膚模型與皮膚附屬器或機(jī)體其它細(xì)胞組合的人體芯片研究已經(jīng)開(kāi)始[18]。

4 結(jié)論與展望

隨著ACD機(jī)制的逐漸被闡明，基于AOP通路中KE2開(kāi)展的研究和建立的體外致敏檢測(cè)方法越來(lái)越多，更多的方法經(jīng)過(guò)驗(yàn)證被用于指導(dǎo)化學(xué)品、藥品或其它物質(zhì)皮膚致敏的檢測(cè)。目前，基于樹(shù)突狀細(xì)胞的方法在研發(fā)和使用時(shí)應(yīng)注意以下幾個(gè)問(wèn)題：①選擇接近體內(nèi)樹(shù)突細(xì)胞的細(xì)胞系：目前用于KE2檢測(cè)的細(xì)胞種類(lèi)較多，要根據(jù)研究需要尋找和選用不同的細(xì)胞；②了解檢測(cè)方法所依賴(lài)的細(xì)胞系的局限性和適用性：如THP-1與U-973的細(xì)胞表面標(biāo)志物類(lèi)型和強(qiáng)弱不同，使用時(shí)應(yīng)記錄其表型特征，并建立細(xì)胞質(zhì)量控制檔案；③使用組合方法：實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立AOP通路中的至少3個(gè)方法，并根據(jù)整合測(cè)試策略(integrated approaches to testing assessment，IATA)的原則建立整合模型，以提高致敏預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性；④建立體外數(shù)據(jù)庫(kù)：皮膚致敏體外方法的開(kāi)發(fā)處于推廣和數(shù)據(jù)積累階段，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)積累不同化學(xué)品原料的測(cè)試數(shù)據(jù)，反過(guò)來(lái)對(duì)方法進(jìn)行優(yōu)化；⑤合理推廣應(yīng)用范圍：體外方法的開(kāi)發(fā)主要是根據(jù)單一化學(xué)品的測(cè)試建立模型，實(shí)際應(yīng)用中可能用于醫(yī)療器械浸提物、植物提取物、混合物等復(fù)雜樣品的測(cè)試，應(yīng)在使用中積累經(jīng)驗(yàn)，合理推廣替代方法的使用范圍，必要時(shí)與其它方法互相驗(yàn)證[19]。相信，在AOP通路的指導(dǎo)下，皮膚致敏的體外方法開(kāi)發(fā)將朝著進(jìn)一步降低實(shí)驗(yàn)成本、提高預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性、使用組合模型和提高檢測(cè)通量的方向發(fā)展。成套和標(biāo)準(zhǔn)化替代方法的開(kāi)發(fā)，在豐富毒性測(cè)試檢測(cè)工具箱的同時(shí)，進(jìn)一步減少了動(dòng)物的使用，也起到了提高消費(fèi)品安全的作用。

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