PSGL-1通過(guò)炎癥反應(yīng)在小鼠鹽敏感性高血壓中的作用機(jī)制研究

付 慧，毛紅亞，姜曉亮，劉 星，劉 雪，楊志偉(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

高血壓是一種常見(jiàn)的機(jī)體病癥，威脅到世界20%～30%的人群健康，也是腦卒中、冠心病、心功能不全、腎病等人類重大疾病的主要危險(xiǎn)因素之一。在原發(fā)性高血壓群體中鹽敏感者占50%～60%[1 - 3]。研究表明，鹽敏感性高血壓病人并發(fā)心腦血管事件的風(fēng)險(xiǎn)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于鹽耐受性高血壓，鹽敏感性高血壓已成為威脅人類健康的重要病理因素之一[4]。鹽敏感性高血壓的病理機(jī)制比較復(fù)雜，一般認(rèn)為高鹽飲食導(dǎo)致動(dòng)脈血管收縮及腎臟鈉水代謝潴留是其主要發(fā)病機(jī)制[5 - 6]，但是通過(guò)舒張血管和利尿等藥物治療，仍有相當(dāng)比例的高血壓患者的血壓并沒(méi)能得到有效控制[7]。即使沒(méi)有導(dǎo)致血壓的變化，高鹽飲食仍然增加了心血管疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[4]。近年來(lái)，隨著慢性炎癥反應(yīng)在鹽敏感高血壓及其它心血管疾病發(fā)生發(fā)展中作用及其機(jī)制研究的進(jìn)展，炎癥反應(yīng)可能是高鹽飲食導(dǎo)致血壓升高及其靶器官損傷的重要作用機(jī)制[8]。

P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)是表達(dá)于白細(xì)胞表面的跨膜糖化蛋白，與白細(xì)胞活化密切相關(guān)。PSGL-1與選擇素(selectin)分子的相互作用在白細(xì)胞粘附起始階段起重要作用[9 - 12]，PSGL-1可以明顯提高血小板活化因子誘導(dǎo)的白細(xì)胞活化，與整合素等細(xì)胞因子共同作用促進(jìn)白細(xì)胞粘附[13]。研究表明，PSGL-1參與調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞分化過(guò)程，放大炎癥信號(hào)，是調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞參與免疫反應(yīng)的重要靶點(diǎn)[14]。白細(xì)胞釋放的TNF-α、IL-1等炎癥因子可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和血小板內(nèi)儲(chǔ)存的選擇素移位到細(xì)胞表面，與白細(xì)胞表面的PSGL-1結(jié)合，進(jìn)一步促進(jìn)白細(xì)胞粘附和炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展[15]。因此，PSGL-1在炎癥反應(yīng)發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要作用，但是否參與鹽敏感性高血壓的病理發(fā)展過(guò)程有待進(jìn)一步研究。

為了檢測(cè)PSGL-1在鹽敏感性高血壓發(fā)生發(fā)展中的作用及其相關(guān)機(jī)制，本研究利用PSGL-1基因敲除小鼠并通過(guò)高鹽喂養(yǎng)，檢測(cè)小鼠血壓變化及機(jī)體中炎癥反應(yīng)和腎臟靶器官損傷情況，以探索鹽敏感性高血壓及其靶器官損傷新的病理機(jī)制，為高血壓及其靶器官損傷的防治提供參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)PSGL-1基因敲除(PSGL-1-/-)小鼠及其野生型(PSGL-1+/+)對(duì)照小鼠由美國(guó)俄克拉荷馬大學(xué)健康科學(xué)中心夏利軍教授捐贈(zèng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所SPF級(jí)環(huán)境飼養(yǎng)[SYXK (京) 2015-0035]，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)(IACUC)的批準(zhǔn)[ILAS-PG-2014-006]。將8周齡、體重約20 g的雄性PSGL-1-/-和PSGL-1+/+小鼠各12只，分別給予高鹽(6% NaCl)和正常鹽(0.4% NaCl)喂養(yǎng)3個(gè)月[16]，然后，在麻醉(0.6%戊巴比妥)狀態(tài)下利用頸總動(dòng)脈插管法測(cè)量小鼠血壓，犧牲小鼠，取小鼠皮膚、腎臟等組織，用于炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和相關(guān)炎癥因子表達(dá)，以及靶器官損傷的檢測(cè)。

1.2 主要試劑與儀器

IL-6單克隆抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology(#12912)；TNF-α單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz(SC-52746)；IL-1β多克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz(SC-7884)；CD3單克隆抗體購(gòu)自Santa Cruz(SC-20047)；CD68單克隆抗體購(gòu)自Novus(NBP1-74570SS)；CTGF多克隆抗購(gòu)自Proteintech(23936-1-AP)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)購(gòu)自碧云天(P0010)；兔超敏二步法試劑盒購(gòu)自中杉金橋(PV9001)；小鼠超敏二步法試劑盒購(gòu)自中杉金橋(PV9002)；DAB顯色試劑盒(20 ×)購(gòu)自中杉金橋(ZLI-9019)；CD45-APC/Cy7小鼠抗體購(gòu)自Biolegend(103116)、CD3-PE/Cy7小鼠抗體購(gòu)自Biolegend(100320)。

多通道生理儀(BIOPAC Systems, Inc.)；血壓檢測(cè)儀(BP-2000 Series II, Visitech Systems)；電泳儀(北京六一儀器廠，DYY-C)；電泳槽(上海天能，VE-180)；電轉(zhuǎn)槽(上海天能，VE-186)；多功能酶標(biāo)儀(Multiskan GO)；化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀(Tanon-5500)；正向顯微鏡(Leica DM6000 B)；低溫高速離心機(jī)(Beckman)；流式細(xì)胞儀(BD FACSCantoTM)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 免疫組化方法檢測(cè)組織的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

取小鼠皮膚組織常規(guī)固定，將石蠟包埋的切片(4 μm)二甲苯脫蠟后在不同濃度梯度酒精溶液中由高向低浸泡浸水，并使用0.3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。在檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中通過(guò)微波熱誘導(dǎo)表位回收法揭開(kāi)抗原。用羊血清阻斷非特異性結(jié)合，然后用目標(biāo)單克隆抗體雜交，4℃溫育過(guò)夜。用超敏二步法試劑盒孵育后DAB顯色試劑盒鏡下顯色，蘇木素染色，鏡下觀察。

1.3.2 Western blot方法檢測(cè)腎臟組織中的蛋白表達(dá)

提取新鮮小鼠腎臟全蛋白，用BCA法檢測(cè)蛋白濃度。采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，流轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，封閉液(0.1%緩血酸銨緩沖液配制5%脫脂奶粉)室溫封閉2 h，加特異性抗體4℃孵育過(guò)夜，0.1%緩血酸銨緩沖液洗膜3次后加辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的IgG室溫孵育1 h，洗膜3次后，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀自動(dòng)曝光顯影后使用Image J軟件分析灰度，結(jié)果以目的蛋白/β-actin灰度值比值表示蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)主動(dòng)脈血管中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)情況，本研究剝離小鼠胸主動(dòng)脈和腹主動(dòng)脈血管，將其剪碎消化至單個(gè)細(xì)胞懸液后，加入流式抗體CD45-APC/Cy7、CD3-PE/Cy7，充分混勻后室溫避光孵育30 min，上機(jī)檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈血管中浸潤(rùn)的白細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞的百分率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 PSGL-1參與高鹽誘導(dǎo)的高血壓發(fā)生發(fā)展

本研究給予PSGL-1-/-小鼠和PSGL-1+/+小鼠高鹽(6% NaCl)或正常鹽(0.4% NaCl)喂養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)，對(duì)于PSGL-1+/+小鼠，高鹽喂養(yǎng)組的收縮壓、舒張壓和平均脈壓均明顯高于正常鹽喂養(yǎng)組(P< 0.05)；而對(duì)于PSGL-1-/-小鼠，高鹽喂養(yǎng)組和正常鹽喂養(yǎng)組的血壓并無(wú)明顯變化(P> 0.05)(圖1)。提示PSGL-1在鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。

2.2 PSGL-1參與高鹽誘導(dǎo)的皮膚組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)

本研究用免疫組織化學(xué)染色法對(duì)小鼠皮膚組織浸潤(rùn)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞特異性染色，發(fā)現(xiàn)在PSGL-1+/+小鼠高鹽喂養(yǎng)后皮膚組織的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量明顯增多，而PSGL-1-/-小鼠高鹽喂養(yǎng)后其T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量并未發(fā)現(xiàn)明顯的變化(圖2，圖3)。表明PSGL-1在炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)過(guò)程中起重要作用，PSGL-1的缺失抑制高鹽誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞在組織中的浸潤(rùn)。

注：WT：PSGL-1+/+小鼠；KO：PSGL-1-/-小鼠；NS：0.4% NaCl；HS：6% NaCl。下同。與其它組小鼠比較，one-way ANOVA，* P< 0.05。圖1 頸動(dòng)脈插管法檢測(cè)PSGL-1+/+小鼠和PSGL-1-/-小鼠動(dòng)脈血壓的變化Note.WT: PSGL-1+/+mice; KO: PSGL-1-/-mice; NS: 0.4% NaCl; HS: 6% NaCl. The same below. Compared with rats in the other groups, one-way ANOVA, * P< 0.05.Fig.1 Blood pressure in PSGL-1+/+ and PSGL-1-/- mice measured by carotid catheterization

注：標(biāo)尺=50 μm。圖2 T淋巴細(xì)胞在PSGL-1+/+和PSGL-1-/-小鼠皮膚組織的浸潤(rùn)情況Note.Bars=50 μm.Fig.2 Infiltration of T lymphocytes in the skin of PSGL-1+/+ and PSGL-1-/- mice

注：標(biāo)尺=50 μm.圖3 巨噬細(xì)胞在PSGL-1+/+和PSGL-1-/-小鼠皮膚組織的浸潤(rùn)情況Note.Bars=50 μm.Fig.3 Infiltration of macrophages in the skin of PSGL-1+/+ and PSGL-1-/- mice

2.3 PSGL-1參與高鹽誘導(dǎo)的主動(dòng)脈血管中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)的調(diào)節(jié)

用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠主動(dòng)脈血管中炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量，發(fā)現(xiàn)在PSGL-1+/+小鼠高鹽喂養(yǎng)后小鼠主動(dòng)脈血管中CD45+白細(xì)胞和CD3e+T細(xì)胞的浸潤(rùn)數(shù)量明顯增多，而PSGL-1-/-小鼠高鹽喂養(yǎng)后其浸潤(rùn)數(shù)量并沒(méi)有出現(xiàn)明顯變化(圖4A，4B)，證明PSGL-1參與高鹽誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞向主動(dòng)脈中浸潤(rùn)的過(guò)程。PSGL-1缺失對(duì)此過(guò)程有抑制作用，從而抑制炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。

2.4 PSGL-1參與高鹽誘導(dǎo)的腎臟炎癥因子表達(dá)的調(diào)節(jié)

腎臟是機(jī)體血壓調(diào)節(jié)的重要器官，為了進(jìn)一步驗(yàn)證機(jī)體炎癥反應(yīng)發(fā)生情況，本研究檢測(cè)了腎臟IL-6、IL-1β、TNF-α蛋白水平的表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PSGL-1+/+小鼠，高鹽喂養(yǎng)組腎臟IL-6、IL-1β、TNF-α的表達(dá)明顯高于正常鹽喂養(yǎng)組；而PSGL-1-/-小鼠，高鹽喂養(yǎng)組與正常鹽喂養(yǎng)組腎臟IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)無(wú)明顯差異(圖5A，5B，5C)。表明PSGL-1基因缺失對(duì)高鹽誘導(dǎo)的腎臟炎癥反應(yīng)有抑制作用。

2.5 PSGL-1參與高鹽誘導(dǎo)的腎臟纖維化水平的調(diào)節(jié)

為了檢測(cè)高鹽對(duì)腎臟損傷的影響，本研究檢測(cè)了腎臟中作為腎臟損傷的標(biāo)示蛋白結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connective tissue growth factor，CTGF)[17]的表達(dá)情況。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PSGL-1+/+小鼠高鹽喂養(yǎng)組腎臟CTGF蛋白表達(dá)量明顯高于正常鹽喂養(yǎng)組；而PSGL-1-/-小鼠腎臟中，高鹽喂養(yǎng)組CTGF蛋白的表達(dá)與正常鹽喂養(yǎng)組無(wú)明顯差異(圖6)。結(jié)果表明，PSGL-1基因缺失對(duì)高鹽誘導(dǎo)的腎臟纖維化具有抑制作用。

3 討論

高鹽攝入是鹽敏感性高血壓發(fā)生發(fā)展的重要因素，鹽敏感性高血壓發(fā)生發(fā)展的機(jī)理主要包括腎臟對(duì)鈉水代謝調(diào)節(jié)、血管平滑肌的收縮、交感神經(jīng)系統(tǒng)興奮等[5, 18 - 19]。近年來(lái)，鹽敏感性高血壓被認(rèn)為是一種低度炎癥性疾病，免疫系統(tǒng)在鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展中的作用引起研究者的重視。高鹽等環(huán)境刺激下，作為與選擇素(selectin)結(jié)合的配體，白細(xì)胞表面的P-選擇素糖蛋白配體-1(PSGL-1)識(shí)別并結(jié)合表達(dá)在活化的內(nèi)皮細(xì)胞表面的選擇素，促進(jìn)白細(xì)胞在血管內(nèi)皮的粘附和浸潤(rùn)[9 - 10, 12, 20]，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)高鹽飲食誘發(fā)野生型小鼠發(fā)生鹽敏感性高血壓，且其麻醉狀態(tài)下血壓升高值與其它小鼠鹽敏感高血壓模型的血壓升高值相近，如去氧皮質(zhì)酮(deoxycorticosterone，DOCA)緩釋誘發(fā)小鼠鹽敏感性高血壓模型[21]，血管緊張素II誘導(dǎo)的高血壓模型[22]等。人類收縮壓低于120 mmHg時(shí)為理想血壓，高于140 mmHg時(shí)為高血壓[23]，其差值與本實(shí)驗(yàn)中血壓升高值相近。另外野生型小鼠高鹽飲食后動(dòng)脈血管和皮膚中炎癥細(xì)胞(T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)浸潤(rùn)、炎癥因子(IL-6、IL-1β、TNF-α)及腎臟纖維化標(biāo)識(shí)蛋白(結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，CTGF)表達(dá)增加，而PSGL-1敲除后小鼠并未發(fā)生以上現(xiàn)象。該結(jié)果提示PSGL-1可能通過(guò)炎癥反應(yīng)參與了鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展及其靶器官的損傷。

注：A：主動(dòng)脈血管中浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞圖譜(流式細(xì)胞術(shù)散點(diǎn)圖)。B：浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞在主動(dòng)脈血管細(xì)胞中的比例。與其它組小鼠比較，one-way ANOVA，* P< 0.05。圖4 白細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞在PSGL-1+/+和PSGL-1-/-小鼠主動(dòng)脈血管中的浸潤(rùn)Note.A: Inflammatory cells in the aorta (flow cytometry scatter plot). B: Percentage of infiltrating inflammatory cells in aortic vascular cells. Compared with rats in the other groups, one-way ANOVA,* P< 0.05.Fig.4 Infiltration of leukocytes and T lymphocytes in the aorta of PSGL-1+/+ and PSGL-1-/- mice

有研究表明，高鹽誘導(dǎo)Dahl鹽敏感大鼠發(fā)生高血壓同時(shí)，腎臟浸潤(rùn)性T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞顯著增加[11]，腎臟中浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子[11, 24]，直接或間接參與了鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展和靶器官損傷[25 - 26]。IL-6、IL-1β和TNF-α均是炎癥反應(yīng)發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用的炎癥因子或促炎因子[27]。IL-6可通過(guò)進(jìn)一步介導(dǎo)巨噬細(xì)胞在腎臟中的浸潤(rùn)增加或增殖[11, 28 - 29]；IL-1β經(jīng)炎癥小體導(dǎo)致腎臟炎癥和腎臟纖維化[30]；IL-17激活RhoA/Rho激酶促進(jìn)內(nèi)皮功能障礙等參與高血壓及靶器官損傷；TNF-α作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞促使其分泌其他炎癥因子促進(jìn)炎癥反應(yīng)[29]，同時(shí)通過(guò)抑制eNOS表達(dá)以抑制血管舒張作用，或通過(guò)調(diào)節(jié)腎臟的血液動(dòng)力學(xué)和排泄功能[31]，促進(jìn)高血壓及靶器官損傷的發(fā)生發(fā)展[11, 32]。本研究發(fā)現(xiàn)，高鹽喂養(yǎng)小鼠的血壓明顯升高，并伴隨其皮膚T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)增多和腎臟組織中IL-6、IL-1β、TNF-α表達(dá)量升高，而PSGL-1缺陷小鼠高鹽喂養(yǎng)后并未引起其血壓、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和腎臟組織炎癥因子表達(dá)量的明顯變化，顯示PSGL-1可能通過(guò)炎癥反應(yīng)參與鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展，但具體的作用機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。

注：A、B、C：分別為小鼠腎臟中IL-6、IL-1β、TGF-α蛋白的相對(duì)表達(dá)量。與其它組小鼠比較，one-way ANOVA，* P< 0.05。圖5 PSGL-1+/+和PSGL-1-/-小鼠腎臟中IL-6、IL-1β和TNF-α蛋白表達(dá)Note.A, B, C: The expression of IL-6, IL-1β, TGF-α in the kidney of PSGL-1+/+ and PSGL-1-/- mice, respectively. Compared with rats in the other groups, one-way ANOVA, * P< 0.05.Fig.5 Interleukin-6, interleukin-1β, and tumor necrosis factor-α expression in the kidney of PSGL-1+/+ and PSGL-1-/- mice

注：與其它組小鼠比較，one-way ANOVA，* P< 0.05。圖6 PSGL-1+/+和PSGL-1-/-小鼠腎臟中CTGF蛋白的表達(dá)Note.Compared with rats in the other groups, one-way ANOVA,* P< 0.05.Fig.6 Connective tissue growth factor expression in the kidney of PSGL-1+/+ and PSGL-1-/- mice

結(jié)締組織生長(zhǎng)因子CTGF是一種炎癥介質(zhì)，CTGF的表達(dá)受炎癥因子(如TNF-α，IL-1β，TGF-β等)及其它細(xì)胞外基質(zhì)酶等多種炎癥介質(zhì)的調(diào)節(jié)[33]，腎臟在發(fā)生損傷時(shí)CTGF表達(dá)升高。作為促纖維化因子TGF-β的下游信號(hào)介質(zhì)，CTGF表達(dá)增加可能是器官纖維化發(fā)生發(fā)展的中心環(huán)節(jié)，CTGF與TGF-β結(jié)合增強(qiáng)TGF-β與其受體的二聚化[34]，進(jìn)一步促進(jìn)TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)，促進(jìn)組織纖維化，導(dǎo)致腎臟功能損傷[35]。CTGF能通過(guò)激活αvβ5整合素，凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶1，p38/JNK和AP-1/NF-κB通路，上調(diào)IL-6的表達(dá)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，在高鹽喂養(yǎng)野生型小鼠發(fā)生高血壓的同時(shí)，腎臟中CTGF的表達(dá)量明顯增多，而PSGL-1缺失小鼠高鹽喂養(yǎng)后血壓和CTGF的表達(dá)量都無(wú)明顯變化，表明PSGL-1缺失能夠抑制高鹽誘導(dǎo)的組織炎癥反應(yīng)發(fā)生而導(dǎo)致的血壓升高和腎臟器官損傷。但是，高鹽誘導(dǎo)的高血壓和腎臟損傷之間的因果關(guān)系還有待進(jìn)一步研究。

高血壓控制的根本目的是靶器官損傷的預(yù)防與治療。本研究揭示了PSGL-1通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)在高鹽誘導(dǎo)的鹽敏感性高血壓的發(fā)生發(fā)展和靶器官損傷中的重要作用，并初步探索了PSGL-1通過(guò)調(diào)控T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)參與鹽敏感性高血壓的可能機(jī)制，為高血壓的預(yù)防和治療提供了新的理論依據(jù)。

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