淡水魚蝦細(xì)菌病診斷與防控技術(shù)研究進(jìn)展

藺凌云，潘曉藝，袁雪梅，姚嘉赟，徐 洋，尹文林，沈錦玉

（浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江省魚類營(yíng)養(yǎng)與健康重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江湖州 313001）

1 淡水魚蝦主要細(xì)菌病

1.1 淡水魚主要細(xì)菌病

1.1.1 細(xì)菌性敗血?。ū┌l(fā)性出血?。?該病是危害最大、流行地區(qū)最廣、流行季節(jié)最長(zhǎng)、造成損失最嚴(yán)重的一種淡水養(yǎng)殖魚類急性傳染病。已報(bào)道的病原包括嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌和維氏氣單胞菌等[1-3]。根據(jù)以下臨床癥狀和病理變化，可初步作出診斷：病魚全身廣泛性充血、肛門紅腫，腹部膨大；肝、脾、腎、膽囊腫大充血，部分魚可見嚴(yán)重肌肉充血。

1.1.2 細(xì)菌性腸炎 這里的腸炎病專指腸道致病菌所引起的一種傳染性疾病，草魚和青魚最易發(fā)病。報(bào)道的病原有嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌和腸型點(diǎn)狀氣單胞菌等[4-5]?？筛鶕?jù)以下兩點(diǎn)做出初步判斷：一是腸道充血發(fā)紅，尤以后腸段明顯，肛門紅腫、外突，腸腔內(nèi)有很多淡黃色黏液；二是從肝、腎或血中可以檢出產(chǎn)氣單胞菌。

1.1.3 細(xì)菌性爛鰓 此病發(fā)病季節(jié)長(zhǎng)，流行范圍廣，在各養(yǎng)殖階段都易發(fā)生，常造成大批魚種死亡。其病原為柱狀黃桿菌[6]。根據(jù)魚體發(fā)黑、鰓絲腫脹、黏液增多、鰓絲末端腐爛缺損、軟骨外露等癥狀，可進(jìn)行初步診斷。

1.1.4 鏈球菌病 該病是養(yǎng)殖魚類重要的細(xì)菌性疾病之一，是近年來羅非魚的主要病害。其病原有海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、副乳房鏈球菌和格氏乳球菌[7-8]。主要診斷依據(jù)為魚在水面做螺旋狀或旋轉(zhuǎn)游動(dòng)，身體呈“C”形或逗號(hào)形彎曲；慢性感染的魚以眼球突出、渾濁等癥狀作出初步診斷依據(jù)。

1.1.5 遲緩愛德華氏菌病 該病是由遲緩愛德華氏菌引起的魚類和牛蛙等水生動(dòng)物疾病的統(tǒng)稱?？筛鶕?jù)患病魚的癥狀和流行情況，作出初步診斷：用解剖針刺穿病魚病灶部位有膿狀物流出，腎臟和肝臟明顯腫大，并大多伴有膿腫病灶，肛門周圍紅腫。

1.1.6 鮰類腸敗血癥 鮰類腸敗血癥是由鮰愛德華氏菌引起的一種細(xì)菌性疾病，臨床上以頭蓋穿孔或腸道敗血為特征，主要感染鮰科魚類?？筛鶕?jù)病魚頭蓋穿孔、腸道敗血和其他內(nèi)臟器官有出血、壞死等典型癥狀作出初步診斷。

1.1.7 諾卡氏菌病 病魚大體上分為軀干結(jié)節(jié)和鰓結(jié)節(jié)2種類型。諾卡氏菌可用選擇性培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。另在病魚結(jié)節(jié)處取少許膿汁制成涂片，革蘭氏染色，如鏡檢發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性絲狀菌，可初步診斷。

1.2 淡水蝦主要細(xì)菌病

1.2.1 急性肝胰腺壞死病 2010年以來，該病在我國(guó)迅速擴(kuò)散，只要流行于亞太對(duì)蝦重要養(yǎng)殖區(qū)。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其病原為攜帶編碼毒素蛋白pirAB質(zhì)粒的特異弧菌，其中報(bào)道最多的是副溶血弧菌[9-11]。此外，歐文斯氏弧菌[12]、坎貝氏弧菌[13-14]及哈維氏弧菌進(jìn)化枝的成員[15]也可引起對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病，這些弧菌均攜帶有編碼毒力蛋白pirA和pirB基因的質(zhì)粒。已建立的分子診斷技術(shù)，包括常規(guī) PCR[16-18]、qPCR[19]和 LAMP[20-21]，均是以該毒力蛋白基因?yàn)榘谢蜻M(jìn)行檢測(cè)的。也可采用TCBS平板培養(yǎng)觀察綠色菌落的數(shù)量，作為預(yù)測(cè)和初步診斷的手段。

1.2.2 螺原體病 近年來，在克氏原螯蝦、南美白對(duì)蝦、羅氏沼蝦及青蝦中相繼發(fā)現(xiàn)了螺原體感染的病例[22-24]。利用螺原體侵染血細(xì)胞后形成包涵體及病原體具游動(dòng)性的特點(diǎn)，通過光鏡可進(jìn)行快速診斷。

2 淡水魚蝦主要細(xì)菌病害診斷技術(shù)

2.1 基于病原菌生理生化特征的檢測(cè)方法

從發(fā)病魚蝦中分離病原細(xì)菌，通過培養(yǎng)物特征（菌落形態(tài)、菌體形狀等）及生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行細(xì)菌病害的初步診斷，是最常用和最基本的檢測(cè)方法。劉杰等[25]采用API 20 NE生理生化檢測(cè)試劑盒與16S rDNA基因序列比對(duì)，對(duì)導(dǎo)致黃顙魚暴發(fā)性流行病的病原進(jìn)行了鑒定，確定為嗜水氣單胞菌。

2.2 基于分子生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)方法

2.2.1 常規(guī)定性PCR檢測(cè)方法 該方法特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單，可快速識(shí)別檢測(cè)樣品中的微量病原菌，是水產(chǎn)病害快速檢測(cè)中應(yīng)用最為廣泛和成熟的方法，包括普通PCR、巢式PCR和多重PCR。Dangtip等[18]以副溶血弧菌毒力蛋白基因ToxA和ToxB為靶基因，建立了巢式PCR，可快速檢測(cè)引發(fā)對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的致病性副溶血弧菌，其靈敏度較一步法PCR提高了100倍。艾克特等[26]建立了一種以鮰愛德華氏菌Ser C基因、肺炎克雷伯菌Khe基因、遲鈍愛德華氏菌Muk F基因和嗜水氣單胞菌Hly A基因等為目的基因的多重PCR，檢測(cè)出患病黃鱔體內(nèi)感染的細(xì)菌主要是肺炎克雷伯菌和嗜水氣單胞菌。

2.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR） 基 于 對(duì)PCR進(jìn)程進(jìn)行實(shí)時(shí)檢測(cè)的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，通過對(duì)水生動(dòng)物的細(xì)菌感染狀況定量分析，可為水生動(dòng)物細(xì)菌病害的早期預(yù)防和控制提供有力的科學(xué)依據(jù)。Su等[27]以無乳鏈球菌16-23S rRNA基因間隔區(qū)為靶序列，建立了檢測(cè)無乳鏈球菌的SYBR Green I qPCR，20 μL反應(yīng)體系中最低可檢測(cè)出8.6個(gè)拷貝的目的DNA。該方法為無乳鏈球菌在被感染魚體各器官中的分布及增殖情況提供了一種定量工具。

2.2.3 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP） 該方法在恒溫（65 ℃左右）條件下就可以完成核酸擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)果可直接肉眼觀察。目前，LAMP已被用于多種淡水魚蝦細(xì)菌病原的檢測(cè)，如嗜水氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血弧菌、海豚鏈球菌和無乳鏈球菌等。Zhou等[28]設(shè)計(jì)開發(fā)的LAMP芯片，自動(dòng)化程度高，樣本及試劑用量少，30 min內(nèi)可同時(shí)檢測(cè)10種水產(chǎn)病原菌。與傳統(tǒng)的微生物學(xué)方法相比，該LAMP芯片的臨床靈敏度和特異性分別為96.2%和93.8%。

2.2.4 16S rRNA檢測(cè)技術(shù) 16S rRNA基因片段的分析方法主要有克隆測(cè)序、探針雜交和酶切片段多態(tài)性分析。目前，該技術(shù)被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖細(xì)菌病原的檢測(cè)。王國(guó)良等[29]從患典型癥狀的烏鱧體內(nèi)分離病原菌，對(duì)其16S rRNA基因序列進(jìn)行測(cè)定，分析了相關(guān)細(xì)菌相應(yīng)序列的同源性，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)生樹。結(jié)果表明，該菌株的16S rRNA基因序列與諾卡氏菌屬的相似性達(dá)99.9%，據(jù)此鑒定菌株為鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nocardia seriolea）。

2.2.5 核酸探針雜交法 利用特異性標(biāo)記DNA或RNA探針同病原微生物中與探針互補(bǔ)的靶核苷酸序列進(jìn)行雜交，以此確定宿主是否攜帶特定病原，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)和診斷快速等優(yōu)點(diǎn)。Soltani等[30]根據(jù)鏈球菌屬和乳球菌屬的16S rRNA保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，通過PCR擴(kuò)增菌株靶序列，擴(kuò)增產(chǎn)物與預(yù)先標(biāo)記在膜上的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行反向線點(diǎn)雜交、顯影。該技術(shù)能快速、敏感和特異地檢測(cè)海豚鏈球菌、無乳鏈球菌、副乳房鏈球菌和格氏鏈球菌4種常見水產(chǎn)病原細(xì)菌。

2.2.6 基因芯片技術(shù) 基于核酸雜交技術(shù)發(fā)展起來的基因芯片技術(shù)，適用于大規(guī)模、高通量的病害檢測(cè)，可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種靶基因的同時(shí)檢測(cè)。Shi等[31]根據(jù)細(xì)菌16S rDNA設(shè)計(jì)寡核苷酸探針構(gòu)建基因芯片，對(duì)包括副溶血弧菌、嗜水氣單胞菌和海豚鏈球菌在內(nèi)的8種常見魚類病原菌進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法與微生物常規(guī)培養(yǎng)和16S rRNA基因測(cè)序方法一致，適用于水產(chǎn)病害的初步診斷及水產(chǎn)動(dòng)物體內(nèi)潛在病原菌的快速鑒定。

2.3 基于免疫學(xué)相關(guān)技術(shù)的檢測(cè)方法

2.3.1 免疫酶技術(shù) 該方法利用了抗原-抗體反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏感性，通過肉眼或顯微鏡觀察及分光光度計(jì)測(cè)定，達(dá)到病原鑒定及定量的目的。酶聯(lián)免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）和斑點(diǎn)雜交（Dot-ELISA）是目前應(yīng)用最廣泛的免疫酶技術(shù)。祝璟琳等[32]建立了無乳鏈球菌的間接ELISA快速檢測(cè)法，與海豚鏈球菌等其他常見水產(chǎn)病原菌無交叉反應(yīng)。不僅能夠檢測(cè)已發(fā)病的羅非魚，而且能夠檢測(cè)無癥狀的帶菌羅非魚，該方法的建立有助于快速準(zhǔn)確地診斷由無乳鏈球菌引起的羅非魚鏈球菌病。

2.3.2 免疫熒光技術(shù) 利用某些熒光素，通過化學(xué)方法與特異性抗體結(jié)合制成熒光抗體，產(chǎn)生熒光，借助熒光顯微鏡可檢測(cè)或定位被檢病原。王淑嫻等[33]通過不同顏色的量子點(diǎn)，標(biāo)記副溶血弧菌抗體和遲緩愛德華氏菌抗體，加入氧化石墨烯淬滅熒光，構(gòu)建了捕獲目標(biāo)細(xì)菌的探針。副溶血弧菌和遲緩愛德華氏菌的檢出限分別為1.5×104和2.1×104CFU/mL，在病原的早期診斷中具有良好的應(yīng)用潛質(zhì)。

2.3.3 膠體金免疫層析技術(shù) 該技術(shù)以膠體金為標(biāo)記物，利用特異的抗原抗體反應(yīng)來放大反應(yīng)，通過直接觀察顏色變化就可以判定結(jié)果，具有快速、簡(jiǎn)便、不需要專業(yè)儀器設(shè)備和結(jié)果肉眼可辨等優(yōu)點(diǎn)，適用于生產(chǎn)一線養(yǎng)殖戶臨床及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。有學(xué)者針對(duì)淡水魚蝦主要病原菌制備了多種膠體金免疫層析試紙條，如嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、遲緩愛德華氏菌、副溶血弧菌、柱狀黃桿菌和海豚鏈球菌等。

2.3.4 抗體芯片技術(shù) 抗體芯片多采用雙抗夾心法，將多種特異性抗體高密度、有序地固定在處理后的芯片載體上，用于捕獲待檢樣品中的靶抗原?？蓪?duì)多個(gè)樣品中的多種抗原進(jìn)行平行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見。李永芹等[34]制備了針對(duì)6 株魚類常見病原菌的檢測(cè)免疫芯片，可同時(shí)檢測(cè)鏈球菌、鰻弧菌、熒光假單胞菌、遲鈍愛德華氏菌、殺鮭氣單胞菌和海分支桿菌。

3 淡水魚蝦細(xì)菌病的防控技術(shù)

3.1 監(jiān)測(cè)預(yù)警防控技術(shù)

水產(chǎn)動(dòng)物病原快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，極大地促進(jìn)了水產(chǎn)動(dòng)物重大疫病的監(jiān)測(cè)和預(yù)警工作。目前，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已啟動(dòng)了國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)管理系統(tǒng)，加強(qiáng)了對(duì)重大疫病的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查，根據(jù)各地上傳的監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)自動(dòng)按照預(yù)警級(jí)別分析形成預(yù)警數(shù)據(jù)。各地可根據(jù)預(yù)警級(jí)別有針對(duì)性地采取相應(yīng)預(yù)防措施。

3.2 免疫防控技術(shù)

免疫防控是控制淡水魚蝦細(xì)菌性流行病最有效的方法。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，國(guó)外已批準(zhǔn)100余種針對(duì)24種水產(chǎn)病原魚類的疫苗上市。我國(guó)魚類疫苗的研究起步較晚，目前研制的針對(duì)大宗淡水魚類的疫苗也有近20種，多種疫苗在實(shí)驗(yàn)室顯示出良好的免疫保護(hù)效果，部分疫苗進(jìn)入田間試驗(yàn)階段，其中嗜水氣單胞菌滅活疫苗已取得新獸藥證書。

免疫增強(qiáng)劑能夠提高魚體產(chǎn)生抗體的能力，同時(shí)也是有效增強(qiáng)魚蝦非特異性免疫力的有效方法。目前已開發(fā)出脂多糖[35]、殼寡糖[36]和植物提取物[37]等免疫增強(qiáng)劑，部分在生產(chǎn)上得到了應(yīng)用。

3.3 藥物防控技術(shù)

目前，抗生素及某些化學(xué)藥物仍然是淡水魚蝦細(xì)菌病害防治的主要手段。抗生素在有效控制水產(chǎn)病害的同時(shí)，也帶來了病原菌耐藥性增強(qiáng)、藥物殘留和水產(chǎn)品質(zhì)量安全等問題。因此，含有免疫活性物質(zhì)的中草藥[38]被不斷開發(fā)運(yùn)用于水產(chǎn)病害的防治，如大蒜、大黃、五倍子、黃連和黃芩等。中草藥不僅具有抗菌、抗病毒和提高魚蝦免疫功能的作用，且毒性低、毒副作用少、不產(chǎn)生抗藥性，符合綠色漁藥的開發(fā)要求，具有巨大的開發(fā)前景。

3.4 生態(tài)防控技術(shù)

生態(tài)調(diào)控通過水質(zhì)調(diào)節(jié)、底質(zhì)改良和科學(xué)混養(yǎng)等措施，增加養(yǎng)殖環(huán)境的生物多樣性，提高養(yǎng)殖生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)的效率，為養(yǎng)殖動(dòng)物營(yíng)造穩(wěn)定、健康的生存和生長(zhǎng)環(huán)境。目前研究最多的是微生態(tài)技術(shù)[39]，通過在水體中投放有益微生物，主要是光合細(xì)菌、芽孢桿菌、放線菌、蛭弧菌、硝化和反硝化細(xì)菌等，改善水質(zhì)的理化因子、菌相和藻相，為養(yǎng)殖動(dòng)物創(chuàng)造了一個(gè)相對(duì)良好的生態(tài)環(huán)境。有益菌在水產(chǎn)動(dòng)物腸道內(nèi)的定植及新陳代謝產(chǎn)物也對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育起到了一定的促進(jìn)作用。

探索合適的生物防控因子，依據(jù)養(yǎng)殖動(dòng)物的食物鏈耦合效應(yīng)和不同生態(tài)位的配置，建立經(jīng)濟(jì)效益和病害防控同步提升的立體生態(tài)養(yǎng)殖模式。如在浙江一帶應(yīng)用成功的蝦鱉混養(yǎng)，利用中華鱉對(duì)病弱蝦的攝食，可有效防控南美白對(duì)蝦病害的發(fā)生[40]。

3.5 綜合防控技術(shù)

水產(chǎn)病害的發(fā)生是水環(huán)境、病原微生物及養(yǎng)殖動(dòng)物相互作用失衡的結(jié)果，導(dǎo)致病害流行的因素復(fù)雜多變。因此，將病害防治各項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行集成以防止病害暴發(fā)，才是最有前途最有效的途徑。

[1] 張玉芬，孟麗軍，張文麗，等. 鯉魚細(xì)菌性敗血癥病原菌的研究[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2010，29（5）：287-290.

[2] 田甜，胡火庚，陳昌福. 團(tuán)頭魴細(xì)菌性敗血癥病原菌分離鑒定及致病力研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（3）：341-345.

[3] 黃小麗，汪開毓. 斑點(diǎn)叉尾鮰維氏氣單胞菌病的診斷與防治[J]. 水產(chǎn)科技情報(bào)，2009，6（5）：240-241.

[4] 張錫林，王有模，唐學(xué)清，等. 大口鯰細(xì)菌性腸炎的病原分離和病理學(xué)研究[J]. 淡水漁業(yè)，1998（3）：6-7.

[5] 李軍，閔正沛，徐伯亥，等. 草魚腸型點(diǎn)狀氣單胞菌的分離和鑒定[J]. 水利漁業(yè)，2007（2）：107-108.

[6] 王良發(fā)，謝海俠，張金，等. 我國(guó)淡水魚類柱形病病原菌柱狀黃桿菌的遺傳多樣性[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2010，34（2）：367-377.

[7] 葉雪平，華建權(quán)，杭小英，等. 梭魚鏈球菌病病原的初步研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2008，（4）：607-609.

[8] 周素明，李安興，馬躍，等. 養(yǎng)殖魚類鏈球菌病病原的分離鑒定及其16S rDNA分析[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2007（2）：68-71.

[9] TRAN L，NUNAN L，RENMAN R M，et al.Determination of the infectious nature of the agent of acute hepatopancreatic necrosis syndrome affecting penaeid shrimp[J]. Diseases of aquatic organisms，2013（105）：45-55.

[10] LIGHTNER D V，REDMAN R M，PANTOJA C R，et al. Early mortality syndrome affects shrimp in Asia[J].Global aquaculture advocate，2015，15（1）：40.

[11] LEE C T，CHEN I T，YANG Y T，et al. The opportunistic marine pathogen Vibrio p-arahaemolyticus becomes virulent by acquiring a plasmid that expresses a deadly toxi-n[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of Amer-ica，2015，112（34）：10798-10803.

[12] LIU L，XIAO J，XIA X，et al. Draft genome sequence of Vibrio owensii strain SH-14，which causes shrimp acute hepatopancreatic necrosis disease[J]. Genome announcemen-ts，2015，3（6）：e01395.

[13] DONG X，WANG H，XIE G，et al. An isolate of Vibrio campbellii carrying the pirVP gene causes acute hepatopancreatic necrosis disease[J]. Emerging microbes and infections，2017，6（1）：e2.

[14] HAN J E，TANG K F J，ARANGUREN L F，et al. Characterization and pathogenicity of acute hepatopancreatic necrosis disease natural mutants，pirABvp（‐）V. parahaemolyticus，and pirABvp（+）V. campbellii strains[J]. Aquaculture，2017，470：84-90.

[15] KONDO H，VAN P T，DANG L T，et al. Draft genome sequence of non-Vibrio parah-aemolyticus acute hepatopancreatic necrosis disease strain KC13.17.5，isolated from di-seased shrimp in Vietnam[J]. Genome announcements，2015，3（5）：e00978.

[16] SIRIKHARIN R，TAENGCHAIYAPHUM S，SANGUANRUT P，et al. Characterization and PCR detection of binary，Pir-like toxins from Vibrio parahaemolyticus isolates that cause ac-ute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND）in shrimp[J]. Plos one，2015，10（5）：0126987-0127002.

[17] HAN J E，TANG K F J，TRAN L H，et al.Photorhabdus insect-related（Pir）toxin-li-ke genes in a plasmid of Vibrio parahaemolyticus，the causative agent of acute hepat-opancreatic necrosis disease（AHPND）of shrimp[J]. Diseases of aquatic organisms，2015，113（1）：33-40.

[18] DANGTIP S，SIRIKHARIN R，SANGUANRUT P，et al. AP4 method for two-tube nested PCR detection of AHPND isolates of Vibrio parahaemolyticus[J].Aquaculture reports，2015（2）：158-162.

[19] HAN J E，TANG K F J，LIGHTNER D V，et al. qPCR assay for detecting and quantify-ing a virulence plasmid in acute hepatopancreatic necrosis disease（AHPND）due to pathogenic Vibrio parahaemolyticus[J]. Aquaculture，2015，422：12-15.

[20] KOIWAI K，TINWONGGER S，NOZAKI R，et al.Detection of acute hepatopancreatic necr-osis disease strain of Vibrio parahaemolyticus using loop-mediated isothermal amplific-ation[J]. Journal of fish diseases，2016，39（5）：603-606.

[21] ARUNRUT N，KAMPEERA J，SIRITHAMMAJAK S，et al. Sensitive visual detection of AHP-ND bacteria using loop-mediated isothermal amplification combined with DNA-functio-nalized gold nanoparticles as probes[J]. Plos one，2016，11（3）：e0151769.

[22] WANG W，GU W，DING Z，et al. A novel spiroplasma pathogen causing systemic infection in the crayfish Procambarus clarkii（Crustacea：decapod），in China[J]. FEMS microbiology letters，2005，249（1）：131-137.

[23] LIANG T，LI X，DU J，et al. Identification and isolation of a spiroplasma pathogen from diseased freshwater prawns，Macrobrachium rosenbergii，in China：A new fresh water crustacean host[J].Aquaculture，2011，318：1-6.

[24] XIU Y，WU T，MENG X，et al. Identification and isolation of a spiroplasma pathogen from diseased oriental river prawn，Macrobrachium nipponense，in China：A new freshwater crustacean host[J]. Aquaculture，2015，437：270-274.

[25] 劉杰，龍宜楠，黃鈞，等. 黃顙魚暴發(fā)性流行病病原的分離鑒定及其3種毒力基因檢測(cè)[J]. 淡水漁業(yè)，2015，45（2）：56-61.

[26] 艾克特，徐佩，周靜文，等. 5種淡水細(xì)菌的多重PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，2015，34（5）：321-326.

[27] SU Y L，F(xiàn)ENG J，LI Y W，et al. Development of a quantitative PCR assay for mon-itoring Streptococcus agalactiae colonization and tissue tropism in experimentally infe-cted tilapia[J]. Journal of fish diseases，2016（39）：229-238.

[28] ZHOU Q J，WANG L，CHEN J，et al. Development and evaluation of a real-time fluo-rogenic loop-mediated isothermal amplification assay integrated on a micro fluidic disc chip（on-chip LAMP）for rapid and simultaneous detection of ten pathogenic bacte-ria in aquatic animals[J].Journal of microbiological methods，2014（104）：26-35.

[29] 王國(guó)良，徐益軍，金珊. 烏鱧致病諾卡氏菌的鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2008（3）：449-454.

[30] SOLTANI M，PIRALI E，SHAYAN P，et al.Development of a Reverse Line Blot Hybridiz-ation method for Detection of some Streptococcal/Lactococcal Species，the causative agents of Zoonotic Streptococosis/Lactococosis in farmed fish[J]. Iranian journal of microbiology，2012，4（2）：70-74.

[31] SHI Y H，CHEN J，LI C H，et al. Detection of bacterial pathogens in aquaculture sa-mples by DNA microarray analysis[J]. Aquaculture，2012（338）：29-35.

[32] 祝璟琳，李大宇，肖煒，等. 羅非魚源無乳鏈球菌的間接ELISA快速檢測(cè)方法[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2016，40（12）：1906-1914.

[33] 王淑嫻，曲梁靜，葉海斌，等. 基于氧化石墨烯的生物免疫傳感器同時(shí)檢測(cè)副溶血弧菌及遲緩愛德華氏菌的研究[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2017，7（2）：18-21.

[34] 李永芹，繩秀珍，戰(zhàn)文斌，等. 6種魚類病原菌的免疫反應(yīng)分析及其檢測(cè)免疫芯片的 構(gòu)建[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2010，40（8）：48-54.

[35] 胡火庚，汪成竹，陳昌福. 三種致病菌粗脂多糖（LPS）對(duì)團(tuán)頭魴的免疫原性[J]. 飼料工業(yè)，2010，31（8）：21-23.

[36] 黃鑫瑋，楊莎莎，劉毅，等. 殼寡糖對(duì)幼建鯉生長(zhǎng)性能、脂肪代謝、非特異性免疫功能和腸道健康的影響[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2015，27（7）：2106-2114.

[37] 馬俊享，羅從彥，董延民. 天然植物復(fù)合提取物對(duì)鱸魚和大菱鲆幼魚生長(zhǎng)及免疫力的影響[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，2011（4）：81-83.

[38] 何愛華，張曦，陶琳麗，等. 6種中草藥對(duì)4種淡水魚致病菌體外抑菌作用的研究[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，2011，7（2）：73-76.

[39] HAI N V. Research findings from the use of probiotics in tilapia aquaculture：a review[J]. Fish & shellfish immunology，2015，45（2）：592-597.

[40] 林鋒，劉莉，曹錚，等. 蝦鱉混養(yǎng)模式的水質(zhì)特征及對(duì)蝦產(chǎn)量的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015（4）：239-240，269.