分子對接技術(shù)在中藥抗炎活性成分篩選和作用機制研究中的應(yīng)用

朱銳靈，沈 悅，馬飛鴻，劉 鵬，湯 建，

（1.江蘇大學藥學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.亳州學院中藥學院，安徽亳州 236800）

中藥是我國幾千年來傳承下來的瑰寶，因多組分、多靶點、多途徑起效的特點使其在治療炎癥，特別是在頑固性的慢性炎癥方面有著獨特的優(yōu)勢。但是，受研究思路和實驗條件的限制，目前抗炎中藥的藥效物質(zhì)和相關(guān)作用機制的研究面臨諸多困難［1］。計算機輔助藥物設(shè)計（computer aided drug design）具有直觀、合理和便捷等特點，藥物研究領(lǐng)域得到廣泛使用，并逐漸成為中藥與現(xiàn)代化進程連接的橋梁。其中，分子對接（molecular docking）技術(shù)在中藥活性成分的虛擬篩選和確定作用靶標等方面已成功運用并展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢［2］。本文就分子對接技術(shù)在中藥抗炎活性成分篩選及抗炎靶標確定方面的應(yīng)用進行綜述，以供后續(xù)研究借鑒。

1 分子對接的含義

分子對接是通過化學計量學方法模擬分子的幾何匹配和能量匹配，來尋找小分子（配體）與生物大分子（受體）之間最佳結(jié)合模式的過程，包括剛性對接、半柔性對接以及柔性對接［3］。對接中常采用半柔性對接，指對接過程中受體是剛性而配體是柔性（可在一定范圍內(nèi)變化）。它兼顧計算量與模型預(yù)測準確性兩方面的優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于小分子和大分子間的對接。常用的軟件有AutoDock，Dock和Sybyl等。

針對某一特定的靶標蛋白，利用相關(guān)軟件對中藥化合物庫進行虛擬篩選，尋找與靶蛋白結(jié)合密切的候選化合物，再進行生物活性測定，最終篩選出具有活性的化合物。分子對接作為一種高效的輔助篩選手段，在中藥有效物質(zhì)基礎(chǔ)研究方面有著廣泛的應(yīng)用前景。

2 分子對接在中藥抗炎活性成分篩選中的應(yīng)用

炎癥是機體對感染或組織損傷作出的天然防御機制是一個復雜的病理過程。炎癥介質(zhì)指的是炎癥過程中形成、釋放并參與炎癥反應(yīng)的活性物質(zhì)，常見的炎癥介質(zhì)包括炎癥細胞因子〔腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、白細胞介素（inter?leukin，IL）、干擾素（interferon，IFN）和集落刺激因子等〕、脂類炎癥介質(zhì)〔花生四烯酸（arachidonic acid，AA）代謝物等〕、胺類炎癥介質(zhì)（組胺和5-羥色胺等）、自由基類物質(zhì)及黏附分子等［4］。

2.1 以炎癥細胞因子為靶標的中藥活性成分篩選分子對接

細胞因子是機體的免疫細胞和非免疫細胞經(jīng)刺激而合成和分泌的小分子蛋白質(zhì)，能調(diào)節(jié)多種細胞生理功能。TNF-α參與多種炎癥的信號通路，而且可以調(diào)節(jié)其他細胞因子的合成和釋放。IL家族（如IL-6和IL-8）是由活化的單核-巨噬細胞及淋巴細胞等產(chǎn)生的一類細胞因子，參與炎癥反應(yīng)的部分或者全過程。IL-6主要是刺激免疫細胞的增殖和分化，參與機體的免疫應(yīng)答，進而增加炎癥反應(yīng)。IL-8是巨噬細胞和上皮細胞分泌細胞因子，能刺激機體中的中性粒細胞和淋巴細胞等發(fā)生趨化、脫顆粒，釋放一系列活性物質(zhì)，導致機體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。在炎癥的病理檢查中，發(fā)現(xiàn)大量的炎癥細胞。一些細胞因子如IL-1，IL-6，IL-8和TNF-α等促進了炎癥細胞的聚集和活化及炎癥介質(zhì)的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，在大多數(shù)炎癥中可檢測到上述某些細胞因子的水平升高［4］。

沈霞等［5］以細胞因子IL-6為研究靶點，采用AutoDock 4.2軟件進行分子對接篩選連翹中抗炎的化學物質(zhì)。從中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫TCMSP2.0（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）中選取150種連翹化學成分，PDB數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org/pdb）下載IL-6的復合物三維結(jié)構(gòu)。軟件對接結(jié)果顯示，74種成分與靶蛋白IL-6的結(jié)合能優(yōu)于原配體L-酒石酸與IL-6的結(jié)合能-3.8 kcal·mol-1。得分排序前三的是五環(huán)三萜類化合物：樺木酮酸（betulonic acid）、樺木酸（betulinic acid）、齊墩果酸（oleanolic acid）。分子對接的結(jié)果與前期藥理活性數(shù)據(jù)具有一致性：齊墩果酸和樺木酸具有顯著的抗炎活性，對脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導的U937細胞產(chǎn)生的IL-6抑制率分別為86.9%和80.2%［6］。樺木酮酸也具有明確的抗炎活性，能夠有效抑制LPS誘導的RAW264.7細胞中誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和 PGE2水平［7］，這說明基于AutoDock分子對接虛擬篩選IL-6抑制劑具有一定的準確性。

鄭春松等［8］利用計算機模擬方法研究中藥羌活治療骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的活性成分。在查閱相關(guān)文獻和檢索治療靶數(shù)據(jù)庫（Therapeutic Target Database）的基礎(chǔ)上，確定IL-1β，IL-6，TNF-α和iNOS為治療OA疼痛的靶點，在PDB中下載其含配體的蛋白質(zhì)復合物晶體結(jié)構(gòu)。在北京大學天然產(chǎn)物庫（http：//pkuxxj.pku.edu.cn/UNPD）下載96個羌活化學成分結(jié)構(gòu)，利用Discovery Studio（DS）中的LigandFit模塊進行分子對接：刪除蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的溶劑和配體，加氫，尋找活性位點，配體進行力場優(yōu)化。對接后采用DOCK-SCORE排序，分值高于原配體的化合物被視為羌活抗炎鎮(zhèn)痛的活性成分。利用Cytoscape軟件繪制羌活活性成分和炎性靶點作用網(wǎng)絡(luò)圖，發(fā)現(xiàn)羌活抗炎鎮(zhèn)痛的關(guān)鍵靶點是IL-1β，IL-6和TNF-α，且與靶點結(jié)合的主要活性成分是香豆素苷類化合物：香柑酚-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（bergaptol-O-β-D-glucopyranoside）、秦皮苷（fraxoside）、6′-O-E-阿魏酰紫花前胡苷（6′-OE-feruloylnodakenin）、5-甲氧基補骨脂素-8-O-β-D-葡萄糖（5-methoxy-8-O-β-D-glucosyloxypso?ralen）。前期的藥理活性實驗發(fā)現(xiàn)，秦皮苷（1 mg·L-1）對LPS誘導的RAW246.7細胞中IL-1α的抑制率為47.1%，是秦皮重要的抗炎活性成分［9］，在一定程度上證明分子對接結(jié)果與羌活抗炎活性數(shù)據(jù)具有一致性，這為從羌活中開發(fā)治療OA的新藥提供了依據(jù)。但目前尚無香柑酚-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和5-甲氧基補骨脂素-8-O-β-D-葡萄糖苷的抗炎活性報道和上述香豆素苷類化合物對潛在作用靶點IL-1β，IL-6和TNF-α的系統(tǒng)研究，還需進一步的藥理實驗對上述對接結(jié)果進行驗證。

Yadav等［10］利用分子對接軟件Scigress Explorer考察沉香木油中的化合物與炎癥靶標IL-1，IL-6，TNF-α和環(huán)氧合酶1（cyclooxygenase-1，COX-1）的結(jié)合能力。結(jié)果表明，化合物沉香螺旋醇（agaro?spirol），沉香雅檻藍醇（jinkoh-eremol）和茅蒼術(shù)醇（hinesol）比沉香木油中其他化合物有更強的結(jié)合力，表現(xiàn)出較好的抗炎潛力。在12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate，TPA）致炎的小鼠模型中，與空白對照組相比，沉香木油劑量依賴性地降低TPA引起的耳腫脹和升高的丙二醛水平，同時也降低促炎因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平，進一步表明了分子對接的有效性與可靠性。

劉旭等［11］以苦參堿為配體，將其與6個炎癥因子（TNF-α，IL-1α，IL-1β，IL-6，COX-1和COX-2）受體分子對接，發(fā)現(xiàn)苦參堿與TNF-α受體結(jié)合得分最高。依據(jù)對接結(jié)果和藥物拼接原理，從美國癌癥研究所（National Cancer Institute，NCI）數(shù)據(jù)庫中篩選出可用于拼接的小分子化合物（活性基團），以苦參堿為母體設(shè)計了4077個新衍生物，MOE軟件分子對接，發(fā)現(xiàn)其中98個衍生物的得分高于苦參堿的對接得分。綜合考慮類藥性及實際合成的可行性，制備了其中19個與TNF-α受體對接結(jié)合分值較為優(yōu)異的衍生物。在小鼠炎癥模型中，有4個化合物對耳腫脹抑制效果強于苦參堿；有6個化合物對足腫脹抑制效果強于苦參堿，其中3個化合物對兩項指標的作用強度均高于苦參堿。這說明分子對接技術(shù)在設(shè)計活性衍生物方面具有良好的指導作用，但與實際藥理實驗結(jié)果仍有一定的差異，需要在后續(xù)的實驗中修正相關(guān)參數(shù)，進一步提高準確度。

2.2 以花生四烯酸代謝途徑為靶標的中藥活性成分篩選分子對接

AA是不飽和脂肪酸，主要存在于細胞膜磷脂中。當機體受到刺激時，生物膜上的磷脂酶被激活，促使大量的AA從膜磷脂中被釋放，游離的AA主要通過COX和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）參與的兩條代謝途徑，生成與炎癥相關(guān)的前列腺素（prostaglandin，PG）類代謝物和產(chǎn)生白三烯（leukotriene，LT）類代謝產(chǎn)物［12］。

大黃、羌活和秦艽有著確切的抗炎活性，3味藥材組成的中藥化學成分庫包含了400多個小分子化合物。利用DS 4.0中的Hiphop模塊構(gòu)建靶標抑制劑藥效團模型，篩選3味中藥的化學成分庫，獲得5-LOX和LTA4H潛在活性成分。DS 4.0和CDOCKER模塊進一步篩選藥效團初篩所得成分，考慮藥效團匹配值、分子對接得分值和分析配體與受體之間的相互作用力，確定大黃中的revandchi?none 4、羌活中的二十三烷酸和二十四烷酸以及秦艽中的褐煤酸甲酯這4個成分為靶標5-LOX和LTA4H的雙效抑制劑［13］。一些含有脂肪酸的親脂性成分具有良好的抗炎活性，如從2種海兔中提取的含有二十三烷酸、二十四烷酸的脂溶性部位對LPS誘導的RAW264.7細胞中的iNOS和LOX具有顯著的抑制作用［14］。但目前尚無關(guān)于上述單體化合物的詳細的抗炎活性和分子機制報道，對于分子對接結(jié)果，還需要進一步的藥理實驗進行驗證。

為分析銀翹解毒軟膠囊的主要活性成分，從數(shù)據(jù)庫中檢索該方9味中藥得到1053個化合物分子，采用Cerius 2，DS 2.5和AutoDock 4.0軟件優(yōu)化處理配體和受體，完成分子對接。分析對接數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，羽扇豆醇（lupeol）、豆甾醇（stigmasterol）和甘草次酸（glycyrrhetinic acid）等95個化合物與16個呼吸道感染靶蛋白有較強的相互作用，進而推測這些分子可能是該藥治療疾病的活性成分［15］。分子對接結(jié)果中關(guān)于羽扇豆醇和豆甾醇的描述與前期的藥理實驗結(jié)果具有一致性：在LPS致炎的小鼠模型中，羽扇豆醇對小膠質(zhì)細胞的活化狀態(tài)和升高的TNF-α，iNOS和IL-1β水平具有顯著的抑制作用［16］；羽扇豆醇對TPA誘導的CD-1小鼠上皮組織中的iNOS和COX-2蛋白表達亦有明顯抑制作用［17］。豆甾醇明顯降低LPS誘導的COX-2和iNOS的mRNA水平，減少PGE2和NO的釋放［15］。甘草次酸對LPS誘導的RAW264.7細胞有確切的抗炎活性，能顯著抑制iNOS和COX-2蛋白表達和相應(yīng)的mRNA水平［18］，但是在文獻［15］的分子對接結(jié)果中，甘草次酸并不是“藥-靶網(wǎng)絡(luò)圖”中網(wǎng)絡(luò)度和介數(shù)較高的26個活性成分之一。這種不一致可能是因為分子對接中圈定的靶點并不是甘草次酸的真正結(jié)合位點。文獻［15］中網(wǎng)絡(luò)度最高的2個化合物3β-羥基-20-蒲公英萜烯（20-taraxaster-3β-ol）和蒲公英甾醇（taraxasterol）結(jié)構(gòu)相似，區(qū)別是前者雙建存在于20（21）位，而后者雙鍵存在于20（30）位。蒲公英甾醇具有顯著的抗炎活性［19］，這與分子對接結(jié)果高度一致，鑒于二者結(jié)構(gòu)相近和分子對接結(jié)果，推測3β-羥基-20-蒲公英萜烯也具有抗炎活性，但該化合物在植物中含量較低，缺少相關(guān)的藥理活性報道。

車前草具有清熱利尿和抗炎的活性，但對其抗炎機制研究較少。為研究車前草的活性成分的抗炎機制，選擇3種具有不同小分子配體的COX-2復合物（PDB ID：1CX2，1PXX，4COX）為靶點，應(yīng)用分子對接方法（Sybyl-X 1.1）篩選出車前草中34種小分子化合物，排名前7的抗炎活性成分依次是桃葉珊瑚苷（aucubin）、車前草苷B（plantainoside B）、阿魏酸（ferulic acid）、6-羥基木犀草素（6-hydroxyluteolin）、芹菜素（apigenin）、京尼平苷酸（geniposidic acid）和梓醇（catalpol）［20］，這與報道的藥理實驗結(jié)果具有一致性。桃葉珊瑚苷（10 μmol·L-1）對IL-1β誘導的軟骨細胞中的iNOS和COX-2蛋白含量的抑制率分別為40%和25%，同時顯著抑制基質(zhì)金屬蛋白酶3（matrix metalloproteinases-3，MMP-3）和MMP-9表達［21］。阿魏酸（100 μmol·L-1）對LPS/IFN-γ誘導的RAW264.7細胞中iNOS有顯著的抑制活性，對COX-2也表現(xiàn)一定的抑制作用［22］。芹菜素能夠顯著抑制LPS誘導的BV-2細胞中COX-2，COX-1和iNOS蛋白表達，對p38和JNK等酶的磷酸化也具有良好的抑制作用［23］。京尼平苷酸（100 mg·kg-1）對AA大鼠足腫脹程度有明顯得抑制作用，對血清中的TNF-α和IL-1β的抑制率為28.0%和21.7%［24］。梓醇顯著抑制LPS/IFN-γ共同誘導星形膠質(zhì)細胞炎癥基因iNOS，COX-2和Toll樣受體4（Toll-like receptor4，TLR4）的表達，降低NO和活性氧的生成［25］。這表明利用分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)車前草的抗炎活性成分具有較高的可行性。

曾茂貴等［26］利用分子對接法探討扶正抑瘤復方制劑對COX的作用。下載COX-1（PDBID：1PGG）和COX-2（PDB ID：6COX）晶體結(jié)構(gòu)，利用Gerius 2軟件處理受體：去溶劑、去配體、加氫；同時對配體—該復方制劑中230個化學成分進行力場優(yōu)化、加電荷等。LiganFit模塊進行分子對接、打分，篩選出分值高于原配體的化合物。發(fā)現(xiàn)與COX-1和COX-2結(jié)合較好的化合物分別有22個和7個，其中木犀草素（luteolin）、芹菜素、槲皮素（quercetin）和二氫赤松素（dihydropinosylvin）等化合物同時抑制COX-1和COX-2，揭示復方制劑可能通過協(xié)同作用抑制COX發(fā)揮抗炎活性。藥理實驗發(fā)現(xiàn)，木犀草素（80 mg·kg-1）可抑制角叉菜膠致炎的大鼠足爪腫脹，顯著降低足炎癥組織PGE2生成，并顯著抑制COX-2蛋白表達［27］。槲皮素也具有廣泛的抗炎活性，對痛風性關(guān)節(jié)炎模型大鼠血清和滑膜中炎癥因子IL-1β，TNF-α和COX-2蛋白水平具有顯著的抑制作用［28］。

Saranya等［29］以5-LOX 和COX-2為靶點，與近海植物中常見的4種活性化合物金合胞酮O（agal?lochaol O）、樺木酸、含羞草醇D（mimosol D）和丁香酚（eugenol）進行分子對接。結(jié)果顯示，4個配體在5-LOX和COX-2的活性位點都有較好的結(jié)合，表明化合物通過對5-LOX和COX-2的抑制，阻止AA的代謝而發(fā)揮抗炎作用。一定程度上，分子對接結(jié)果得到前期藥理實驗的支持。前期實驗中發(fā)現(xiàn)樺木酸有顯著的抗炎活性［6，30］，ELISA法測定其抑制COX-1和COX-2活性的IC50分別為115和11.4 μmol·L-1。金合胞酮O（100 μmol·L-1）對LPS誘導的RAW264.7細胞中的IL-6和TNF-α的抑制率分別是52.6%和44.5%，對NF-κB也具有一定的抑制作用；含羞草醇D對LPS誘導的RAW264.7細胞中的NO和TNF-α的IC50分別是3和6.5 μmol·L-1；丁香酚（2 μmol·L-1）對LPS誘導的RAW264.7細胞中COX-2和PGE2具有顯著的抑制作用，對COX-2 mRNA水平也有明顯抑制作用［31-32］，對多形核粒細胞中的5-LOX和L6TC4的 IC50分別是 26 和 30 μmol·L-1［33］。這說明分子對接技術(shù)在虛擬篩選COX-2抑制劑方面具有較高的“命中率”，能有效協(xié)助抗炎化合物庫的建立和篩選。

中藥黃芩對阿爾茨海默病（Alzheimer disease，AD）有一定的療效，其活性機制涉及到對COX的抑制。為解析黃芩化學成分與COX的相互作用，給治療AD提供一定理論依據(jù)，馬宏躍等［34］采用軟件Molegro Virtual Docker（MVD）預(yù)測配體和受體的相互作用，并根據(jù)配體預(yù)測大分子蛋白的活性位點。從PDB數(shù)據(jù)庫下載COX-2復合物三維結(jié)構(gòu)（PDB ID：6COX），用MVD分析其活性位點。將黃芩中4種主要黃酮類成分黃芩苷（baicalin）、漢黃芩苷（wogonoside）、黃芩素（baicalein）和漢黃芩素（wogonin）與COX-2對接，分析結(jié)合位點和打分值，發(fā)現(xiàn)苷類（黃芩苷和漢黃芩苷）比苷元類（黃芩素、漢黃芩素）的有著更高的抑制活性，因為苷中糖片段作用于活性口袋的S2位點，增加了結(jié)合力。這4個黃酮類化合物都有良好的抗炎活性，20 μmol·L-1的黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素對LPS誘導的RAW 264.7的NO釋放和iNOS活性有著顯著的抑制作用，且黃芩苷的活性略高于黃芩素；漢黃芩素顯著抑制COX-2活性，但黃芩苷和黃芩素對COX-2的抑制作用較弱［35-36］。分子對接結(jié)果與藥理實驗具有一定程度的一致性，能夠為黃芩治療AD的可行性和機制提供一定的研究依據(jù)。

Honmore等［37］從高良姜中分提取分離得到的高良姜精（galangin）和5-羥基-7-（4"-羥基-3"-甲氧基苯基）-1-苯基-3-庚酮的化合物，將其與COX-2對接，顯示出較好的結(jié)合力。該結(jié)果得到前期藥理數(shù)據(jù)的支持：高良姜精（5 μmol·L-1）對LPS誘導的J774A.1細胞中COX-2和iNOS的抑制率分別為58.6%和60.3%，對NO和PGE2的釋放也具有顯著抑制活性［38］，這一定程度上證實了分子對接結(jié)果的可靠性。

劉培勛課題組［39］基于計算機輔助藥物設(shè)計方法探討黃連解毒湯抗炎藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，從數(shù)據(jù)庫中檢索黃連解毒湯組方藥材黃連、黃芩、黃柏和梔子的化學成分，共計222種。針對炎癥靶點COX-2，IKK-2和PDE-4等受體，將受體與配體進行分子對接，按照分值高低排序，篩選活性較優(yōu)的化合物。其中10-乙酰京尼平苷（10-acetylgeniposide）、紅景天苷（salidroside）、藁本內(nèi)酯（Z-ligustilide）、漢黃芩素-5-β-D-葡萄糖苷（wogonin-5-β-D-glucoside）和蘆丁（rutin）等28個小分子化合物同時抑制2～3個靶標蛋白，特別是10-乙酰京尼平苷和紅景天苷對3個靶標均呈現(xiàn)明顯抑制作用。上述分子對接結(jié)果的一部分在藥理實驗中得到了驗證：藁本內(nèi)酯能夠有效抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞中iNOS和COX-2的表達和相應(yīng)的mRNA水平［40］。在血管性癡呆大鼠模型中，紅景天苷對海馬區(qū)COX-2和NF-κB表達有顯著抑制作用［41］。該課題組還研究了中藥血必凈抗炎作用藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和多靶點作用［42］。從中藥與有效成分數(shù)據(jù)庫檢索血必凈復方中的化學成分，同源建模得到炎癥靶點5-LOX的三維結(jié)構(gòu)，利用Sitemap確定活性位點，Glide模塊將小分子配體與炎癥靶點5-LOX和COX-2對接和建立IKK-2的抑制活性藥效團，篩選血必凈中的活性成分。分析發(fā)現(xiàn)，血必凈化學成分中與靶點5-LOX，COX-2和IKK-2結(jié)合效應(yīng)較好的小分子化合物分別有30，36和8個。其中16個分子對靶點5-LOX和COX-2有較好的結(jié)合效應(yīng)，特別是迷迭香酸（rosmarinic acid）對3個靶點均有明顯結(jié)合能力，具有潛在的雙（多）重抑制作用。迷迭香酸對人和小鼠的炎癥癥狀具有顯著的抑制作用，對于TPA致炎的小鼠耳組織COX-2蛋白和mRNA有顯著的抑制作用［43］。上述兩個例子都從分子層次上闡釋了中藥復方的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和多靶點作用效應(yīng)，為中藥復方的臨床應(yīng)用提供科學依據(jù)，也為尋找新型抗炎藥物提供一定的參考和借鑒。

2.3 以其他炎癥介質(zhì)為靶標的中藥活性成分篩選分子對接

Mann 等［44］研究可食性木奶果（Baccaurea sapida）的藥用活性成分，并用分子對接技術(shù)預(yù)測其對類風濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）的抗炎活性成分。質(zhì)譜鑒定出木奶果中的10種化合物，其中6種化合物：水楊酸（salicylic acid）、芥子酸（sinapic acid）、槲皮素、楊梅素（myricetin）、對香豆酸（p-coumaric acid）和綠原酸（chlorogenic acid）具有一定的抗炎活性。金黃色葡萄球菌表面蛋白A（staphylococal protein A，SPA）是引發(fā)RA的重要因素，使用AutoDock軟件對接6種抗炎化合物和SPA，發(fā)現(xiàn)槲皮素對SPA的抑制常數(shù)為47.01，結(jié)合能為-5.90 kcal·mol-1，是最有潛力的基于SPA抑制的抗炎化合物。這提示木奶果的甲醇提取物具有顯著的抗炎潛力。

鄭春松［45］采用分子對接技術(shù)研究獨活寄生湯治療OA的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及作用靶點。檢索獨活寄生湯組方藥材的化學成分，構(gòu)建獨活寄生湯化學成分庫。選取已經(jīng)明確的OA治療靶點蛋白聚糖酶1和2（ADAMTS-4和5）、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-8、MMP-9、MMP-11、MMP-13、COX-2、IKK-β和5-LOX為受體，在LigandFit模塊中進行分子對接，DOCK-SCORE打分篩選出獨活寄生湯的藥效成分264個。其中184個化合物可以同時抑制2個及以上靶蛋白，如異洋丁香酚苷（isoacteoside）能 與 MMP-1，MMP-2，MMP-3，MMP-8，MMP-9，MMP-11，MMP-13，5-LOX 和IKK-β有較好的作用，丁子芽鞣素（eugeniin）能與MMP-1，MMP-2，MMP-7，MMP-8，MMP-9，MMP-11，IKK-β和5-LOX有較好的作用，綠原酸能與MMP-1，MMP-3，MMP-8，MMP-9，MMP-13和IKK-β有較好的作用。藥理實驗發(fā)現(xiàn)，異洋丁香酚苷（80 μmol·L-1）具有確切的抗炎活性，能顯著抑制LPS誘導的RAW 264.7細胞中的TNF-α，IL-6，IL-1β，COX-2，iNOS，COX-2和iNOS的mRNA水平，降低磷酸化IKKα/β含量，并有效阻滯LPS誘導的HEK293T細胞中TLR4的二聚化進程［46］；體外實驗中，丁子芽鞣素（30 μmol·L-1）對 HT1080 細胞中的 MMP-2和MMP-9抑制作用顯著，IC50分別為9.0和82 μmol·L-1［47］；綠原酸（20 μmol·L-1）具有確切的抗炎活性，顯著抑制IL-1β誘導的軟骨細胞中的MMP-1，MMP-3和MMP-13的mRNA水平，提高基質(zhì)金屬蛋白酶抑制物-1 mRNA水平，對NF-κB的激活狀態(tài)和IκBα的降解具有顯著的抑制作用［48］。綠原酸（每只5.7 mg）對TPA致炎的小鼠上皮細胞中的iNOS，COX-2和IKK-β表現(xiàn)出顯著的抑制作用，并有效抑制IκBα的降解［49］。部分分子對接結(jié)果得到前期藥理實驗數(shù)據(jù)的支持，這說明分子對接技術(shù)在預(yù)測獨活寄生湯藥效成分和解釋多靶標作用機制方面具有較高的可行性，有良好的應(yīng)用前景。

3 反向分子對接在中藥抗炎活性成分作用機制研究中的應(yīng)用

反向?qū)蛹夹g(shù)是指以分子對接技術(shù)為基礎(chǔ)，將單一或者多個配體活性化合物作為研究對象，對數(shù)據(jù)庫中大量的蛋白受體進行對接篩選，按照對接能量高低排序并分析，找到潛在的靶蛋白。該技術(shù)可以確定生物活性已知的小分子化合物作用的潛在靶蛋白，進而為解析其作用機制提供新思路［50］。

中藥成分奇任醇（kirenol）對RA有確切的療效，顯著抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的足腫脹，提高大鼠脾細胞的增殖能力，降低CD4+T細胞比例，抑制二甲苯所致的急慢性炎癥。為進一步確證奇任醇治療RA的作用靶點，采用分子對接軟件AutoDock比較奇任醇對RA相關(guān)靶點TNF-α，IL-1和IL-6的結(jié)合能力［51］。分子對接結(jié)果顯示，奇任醇與IL-6結(jié)合能與相互作用優(yōu)于TNF-α和IL-1，這為奇任醇治療RA的免疫機制提供了一個新的解釋。

林兵［52］從豆豉姜的二氯甲烷部分提取分離得到化合物9，9′-O-二-（E）-阿魏?；?內(nèi)消旋-5，5′-二甲氧基開環(huán)異落葉松樹脂酚（LC36）。LC36對LPS誘導的RAW264.7細胞產(chǎn)生的TNF-α和NO有明顯的抑制活性，IC50分別為10.4 和22.9 mg·L-1；LC36 0.1 μmol·L-1對破骨細胞的中酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）酶有顯著抑制作用，表明該化合物具有良好的抗炎潛力。將LC36與RA靶蛋白（P38 MAPK，JAK1，JAK3，MEK1，組織蛋白酶 K，Syk和c-JNK）進行分子對接來預(yù)測靶點。MVD軟件分析化合物與7個靶蛋白結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)該化合物與P38 MAPK、MEK1和組織蛋白酶K的對接能量值低于原配體，并且通過氫鍵和疏水作用與這3個蛋白結(jié)合，較好地嵌于蛋白的活性腔中。細胞熱轉(zhuǎn)變分析（cellular thermal shift assay，CETSA）證明了該化合物在細胞內(nèi)可與MEK1和組織蛋白酶K蛋白結(jié)合，說明分子對接技術(shù)在靶點預(yù)測方面有一定的可行性，同時也表明該化合物是通過多個靶點發(fā)揮治療RA作用。

化合物D182是一種海洋來源的共生菌產(chǎn)物，對LPS誘導的RAW264.7細胞中TNF-α和IL-6有明顯的抑制作用，其作用靶點可能位于骨髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）中。MyD88是TLR2，TLR4和TLR6三條信號通路共同具有的髓樣分化因子初次應(yīng)答基因。通過模擬分子對接（DS 3.0）選擇TLR2，TLR4和TLR6信號通路中共有的蛋白MyD88、IL-1受體相關(guān)激酶4（interleukin-1 receptor-associated kinase4，IRAK4）和IRAK1進行研究。分子對接模擬這幾種蛋白與D182的結(jié)合作用，發(fā)現(xiàn)D182與IRAK4存在較好的結(jié)合能力，對接結(jié)果預(yù)測D182和IRAK4活性中心的氨基酸通過氫鍵和離子鍵結(jié)合。由于在TLR信號通路中，IRAK4通過其磷酸化而影響下游通路，細胞實驗中發(fā)現(xiàn)D182處理細胞后，可以抑制LPS引起的細胞中IRAK4的磷酸化和IRAK4的降解，這也證實了D182對TLR共有的下游通路MyD88有一定的抑制作用［53］。

含有異噁唑雜環(huán)的甘草次酰胺類衍生物TY501能抑制RAW264.7細胞的增殖，且作用強于陽性對照藥潑尼松龍［54］。劉巍等［55］應(yīng)用反向分子對接預(yù)測TY501抗炎的可能作用靶點。將TY501與PDB數(shù)據(jù)庫中檢索到的P38 MARK等5種炎癥相關(guān)受體的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)進行分子對接（MOE軟件），分析結(jié)果圖與對接分值，發(fā)現(xiàn)MMP的活性中心的金屬離子是部分酸性非甾體抗炎藥中結(jié)合基團所必需的位點，并推測出TY501的抗炎作用機制可能與MMP相關(guān)。

蟾毒靈（bufalin）是中藥蟾酥的活性成分，具有顯著的抗腫瘤和抗炎活性，為深入闡明作用機制，采用反向分子對接預(yù)測潛在的作用靶蛋白［56］。使用AutoDock軟件，虛擬篩選蟾毒靈的13個潛在靶蛋白，發(fā)現(xiàn)抗炎靶點可能是二磷酸腺苷核糖聚合酶〔poly（ADP-ribose）polymerase，PARP〕、iNOS和FK506結(jié)合蛋白，其中PARP的可信度最高。PARP家族是由PARP-1和其他的酶組成，其中PARP-1可導致ATP耗竭細胞死亡，氧化應(yīng)激和炎癥轉(zhuǎn)錄因子的啟動，其功能與蟾酥的藥理效應(yīng)有著良好的相關(guān)性。蟾毒靈0.3和0.6 mg·kg-1可顯著抑制角叉菜膠致炎的大鼠足跖腫脹和炎癥組織中iNOS，COX-2，TNF-α和胞核內(nèi) NF-κB p65 的蛋白水平［57］。分子對接應(yīng)用于預(yù)測蟾毒靈抗炎的結(jié)合蛋白，對研究蟾毒靈的作用機制具有一定的意義。

獨腳金內(nèi)酯類化合物GR24通過對NF-κB信號通路的阻斷作用表現(xiàn)出顯著的抗炎活性。為進一步闡明作用機制，利用分子反向?qū)蛹夹g(shù)確定GR24在NF-κB信號通路中的潛在作用靶點［58］。通過分析從PDB檢索到的62個靶蛋白結(jié)構(gòu)，與GR24分子對接分值最高的3種靶蛋白分別為PARP1，酪蛋白激酶2和蛋白激酶B。通過表面結(jié)合模式，二維平面圖分析及與PARP1抑制劑對比，表明GR24具有作為PARP1抑制劑的可能性，為研究獨腳金內(nèi)酯的抗炎作用及機制提供參了考依據(jù)。

中藥成分黃連堿具有顯著的抗炎活性，為深入研究該化合物對炎癥通路的調(diào)節(jié)機制，利用反向分子對接技術(shù)，對炎癥通路相關(guān)蛋白進行虛擬篩選，以確定黃連堿的高親和性靶蛋白［59］。選取TLR4/NF-κB、P38MAKP和Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導轉(zhuǎn)錄激活因子3炎癥通路上30個蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，利用AutoDock Tools對所有蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和小分子配體進行加氫、加電荷等處理，AutoGrid計算靶標蛋白的活性位點，AutoDock對黃連堿在活性區(qū)域位點進行構(gòu)象搜索，根據(jù)對接自由能的高低，篩選出親和力高的靶蛋白。最終得到4個與黃連堿具有高親和性的靶蛋白（P13Kδ，P13Kγ，IKKβ和 P13Kα）。PYMOL1.5.0.4與LigPlot+軟件分析分子對接結(jié)果，發(fā)現(xiàn)黃連堿與結(jié)合位點形成氫鍵和疏水作用，從而緊密結(jié)合在活性位點上，推測黃連堿通過抑制上述4個靶蛋白阻礙炎癥信號傳遞，影響下游蛋白的表達，進而發(fā)揮抗炎作用。

4 結(jié)語

傳統(tǒng)的中醫(yī)理論結(jié)合現(xiàn)代化的科技手段有助于進一步闡釋中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機制。利用計算機模擬方法探討中藥的作用機制，不僅可以彌補藥理學實驗方法的缺陷，減少研究的盲目性［2，23，60］，更重要的是在中藥新藥研究領(lǐng)域，建立全新的理念和先進的研究手段，提高新藥研究成功率為中藥的發(fā)展提供新途徑。眾多的虛擬篩選結(jié)果得到了體內(nèi)外藥理實驗的支持，說明分子對接技術(shù)在虛擬篩選中藥活性方面具有一定的可行性。當然，也存在分子對接結(jié)果與實際藥理實驗不一致的情況［11，15］。同時分子對接（虛擬篩選）與藥理實驗還存在一定的脫節(jié)現(xiàn)象，分子對接中選用的中藥活性成分，可能不易制備或含量較低，缺乏相關(guān)的藥理實驗數(shù)據(jù)；而藥理實驗中選擇的中藥成分往往是含量較高、易于制備的，但其活性不一定顯著。目前一些利用分子對接技術(shù)發(fā)現(xiàn)中藥活性成分的研究僅限于虛擬篩選階段，并未提供實際的藥理實驗驗證，缺乏完整性。后續(xù)的相關(guān)研究中，應(yīng)注重分子對接與實驗驗證的連貫性和完成性，逐步修正軟件參數(shù)的設(shè)置，提高預(yù)測的準確性。

中藥在抗炎免疫方面具有良好的臨床應(yīng)用記錄，盡管具備了液質(zhì)聯(lián)用等現(xiàn)代色譜技術(shù)手段，但完全地確定其藥效物質(zhì)仍面臨諸多困難，多種物質(zhì)的協(xié)同作用也增加了活性機制的復雜性。以分子對接為主要手段的網(wǎng)絡(luò)藥理學在確定抗炎中藥的物質(zhì)基礎(chǔ)和闡明作用機制方面有著特殊的優(yōu)勢。計算理論方法與軟件的不斷完善將使分子對接技術(shù)在中藥抗炎方面發(fā)揮更大的作用。