吡非尼酮對艦船煙霧所致吸入性肺損傷大鼠的防護(hù)作用

段欣欣，王成彬，2，韓志海，呂建新

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)檢驗醫(yī)學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院，浙江溫州 325000；2.解放軍總醫(yī)院檢驗科，北京 100853；3.海軍總醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100048）

艦船火災(zāi)是作戰(zhàn)時經(jīng)常遇到的情況，艦船內(nèi)部非金屬材料在燃燒時釋放出大量的有毒氣體、粉塵及顆粒物質(zhì)，船員極易因暴露于此環(huán)境而引起肺組織和呼吸道的吸入性損傷。吸入性損傷發(fā)病隱匿，病情危重，具有熱力損傷和化學(xué)物質(zhì)損害的特點［1-2］，若未及時治療，可迅速發(fā)展為呼吸衰竭，危及生命。近年來，海軍艦船大量新型復(fù)合材料的應(yīng)用增加了煙霧成分的復(fù)雜性，主要包括CO，CO2，H2S和NOx等有害氣體，有時甚至含氯化氫、氯化氰、氰化氫等高毒性氣體，對人體的危害比單一的有毒氣體毒性要大得多，嚴(yán)重者可迅速致人死亡［3］。艦船火災(zāi)有害煙氣生成速度快、種類多、成分復(fù)雜、危害大，污染艦船室內(nèi)大氣環(huán)境，嚴(yán)重傷害船員身體健康［4］，已成為國內(nèi)外研究熱點之一。

當(dāng)人體吸入有毒氣體、熱力物質(zhì)或刺激性顆粒后，會引起上呼吸道、氣管支氣管以及肺實質(zhì)損傷［5］，使單核巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等活化和聚集，釋放氧自由基及多種炎癥性細(xì)胞因子等，同時肺組織血管內(nèi)皮細(xì)胞和中性粒細(xì)胞發(fā)生黏附導(dǎo)致肺組織內(nèi)微血管阻塞，局部組織缺氧缺血加重，血管內(nèi)皮通透性增加，使肺組織水腫進(jìn)一步加速，加重肺部炎癥反應(yīng)［6-7］。目前對煙霧吸入性損傷的藥物治療主要有皮質(zhì)激素類、肺表面活性物質(zhì)類和表皮生長因子［8］。皮質(zhì)激素的大量使用帶來的不良反應(yīng)大，可致機(jī)體免疫力下降，產(chǎn)生藥物依賴和激素抵抗等一系列不良反應(yīng)，肺表面活性物質(zhì)類制劑的主要來源是動物肺組織，制備困難，來源少［9］，且在用藥劑量和給藥時機(jī)等方面還需要進(jìn)一步的研究。表皮生長因子的最佳給藥時機(jī)和給藥途徑等問題也仍在研究中［10］，故目前尚缺乏安全有效的早期干預(yù)和延緩疾病進(jìn)展的手段。

吡非尼酮（pirfenidone，PFD）是一種近年來上市的新型小分子藥物，臨床可用于輕度特發(fā)性肺纖維化的早期治療［11］，同時該藥還在腎臟疾?。ň衷钚怨?jié)段性腎小球硬化癥）、肥厚性心肌病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和惡性腫瘤等方面有廣泛研究［12］。有研究表明，PFD可抑制多種細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6），IL-17和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等［13］，具有抗炎和抗氧化作用［14］。PFD抑制大鼠肺組織中NF-κB和絲裂原活化的蛋白激酶信號通路相關(guān)因子發(fā)揮保護(hù)作用的藥物機(jī)制已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點［15-16］。同時韓楓等［17］的研究結(jié)果表明，PFD對百草枯所致急性肺損傷大鼠具有一定的保護(hù)作用，但目前還尚未有PFD對艦船煙霧所致大鼠吸入性肺損傷保護(hù)作用的研究。本研究采用自制煙霧吸入性損傷裝置，在大鼠正?；顒訝顟B(tài)下，進(jìn)行自主煙霧的吸入，排除麻醉及其他影響，采用艦船內(nèi)部7種非金屬材料并按一定比例配制，氣體檢測儀實時監(jiān)測裝置內(nèi)部各種氣體成分變化，模擬艦船燃燒環(huán)境，構(gòu)建艦船煙霧致肺損傷大鼠模型。同時使用PFD進(jìn)行干預(yù)，初步探討PFD對艦船煙霧所致急性肺損傷的防護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥品、試劑和主要儀器

清潔級健康成年雄性Wistar大鼠54只，體質(zhì)量160～200 g，由解放軍總醫(yī)院實驗動物中心提供，合格證號SCXK（京）2016-0006。大鼠于動物中心清潔房中飼養(yǎng)，溫度21～24℃，濕度50%～60%，晝夜12 h節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。本實驗通過解放軍總醫(yī)院倫理委員會審查，所有大鼠均在麻醉狀態(tài)下處死。

PFD（純度99%，湖北威德利化學(xué)科技有限公司）；IL-6，IL-17和TNF-α ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

Cobasb血氣分析儀（瑞士羅氏），1510酶標(biāo)檢測儀（美國Thermo Fisher公司），TopPette微量加樣器（Dragonlab公司），BX53TR光學(xué)顯微鏡（Olympus公司），ST16R臺式離心機(jī)（美國Thermo Fisher公司），88870006數(shù)字金屬浴（美國Thermo Fisher公司），F(xiàn)A2004B精密電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 發(fā)煙材料

發(fā)煙材料（海軍總醫(yī)院饋贈），包含聚雙馬（Ⅲ型）泡沫材料：主要組分為雙馬來酰胺聚合物；NH/福樂斯發(fā)泡橡塑絕熱制品：主要組分為橡膠和塑料復(fù)合體；EA-100阻燃白膠：主要組分為膠黏劑、無機(jī)填料；LZN-1高性能阻尼材料：主要組分為橡膠、硫化劑、膠黏劑等；JYJPJ85/SC艦船用低煙無鹵電纜：主要組分為聚乙丙烯塑料；WQF-2硅丙乳膠漆：主要組分為硅丙乳膠；裝飾板：主要組分為鋁板、木板和膠黏劑。將7種艦船非金屬材料按一定用量比，稱量后剪成均勻小塊，置于潔凈的塑料袋中密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 自制煙霧發(fā)生裝置

自制煙霧吸入性損傷裝置（圖1）由發(fā)煙室和動物室兩部分組成。兩室中間有孔相通，發(fā)煙室內(nèi)部安有風(fēng)扇使煙霧均勻流通在整個裝置。發(fā)煙室內(nèi)徑31 cm×40 cm×28 cm，內(nèi)置遙控電磁加熱器、發(fā)煙鐵盤、鼓風(fēng)扇。動物室內(nèi)徑31 cm×40 cm×28 cm，室壁的透視窗口用于觀察動物煙熏后的狀況，外部壁上安有煙霧檢測儀監(jiān)測裝置內(nèi)艦船煙霧的成分，包括O2，CO，CO2和H2S，遙控電磁爐開關(guān)、溫濕度監(jiān)控儀，用于實時監(jiān)控發(fā)煙裝置內(nèi)的溫度和濕度。

Fig.1 Smoke generator.A：Front view of the smoke generator；B：Overlooking of the smoke generator，consisting of a smoke room and an animal room（As the shown by the black arrow in the figure）.There is a hole between two rooms，and smoke is kept inside the interior of the fan so that smoke is evenly circulated throughout the device.

1.4 艦船煙霧致吸入性肺損傷大鼠模型的制備

取配比稱量處理好的艦船材料放入發(fā)煙室的鐵盤上，置于遙控電磁爐加熱器上，關(guān)閉發(fā)煙室門，打開動物室門，放入要致傷的大鼠后關(guān)閉，檢查裝置氣密情況，打開發(fā)煙裝置總電源開關(guān)、氣體成分分析儀、氣體采樣泵及溫濕度監(jiān)測器開關(guān)，使用遙控裝置打開電磁爐加熱器開關(guān)并將其調(diào)至功率最大檔位，1 min后可觀察到發(fā)煙室內(nèi)迅速充滿煙霧，加熱3 min后關(guān)閉電磁加熱器。待達(dá)到暴露時間15 min后，打開動物室取出大鼠，置于空氣中。

1.5 動物分組及處理

清潔級健康雄性Wistar大鼠54只，采用隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為3組，正常對照組、煙霧吸入損傷組和PFD 300 mg·kg-1（溶于5%二甲亞砜生理鹽水）組，每組18只。由前期實驗摸索可知，PFD劑量為500 mg·kg-1時，大鼠死亡率可達(dá)83%，劑量為200 mg·kg-1時，保護(hù)作用效果不明顯，大鼠死亡率為67%，劑量為300 mg·kg-1時，大鼠未發(fā)生死亡，故以300 mg·kg-1為最終用藥劑量。正常對照組和煙霧吸入損傷組ip給予2 mL 5%二甲亞砜。給藥30 min后，煙霧吸入損傷組與PFD組分別放入自制發(fā)煙裝置中，艦船煙霧吸入15 min后，取出置于通風(fēng)環(huán)境中。每組分別于12，24和48 h各取6只腹主動脈取血。

1.6 動脈血氣分析

各組暴露后12，24和48 h大鼠腹主動脈取血1 mL，于30 min內(nèi)采用羅氏Cobasb血氣分析儀進(jìn)行動脈血氣分析。

1.7 ELISA法檢測血清中IL-6，IL-17和TNF- α的含量

各組暴露后12，24和48 h大鼠血液樣本，1006×g離心15 min后取上清液。按說明書采用雙抗體夾心法檢測血清中的IL-6，IL-17及TNF-α的水平。

1.8 肺含水率和MDA含量的測定

腹主動脈取血后，處死大鼠，取右肺前葉，拭干表面血液后稱濕重并記錄，放入60℃烤箱烤72 h至恒重并記錄干重。肺含水率（%）=（肺濕重-肺干重）/肺濕重×100%。

取右肺中葉組織100 mg，置于液氮中研磨，按1∶9比例加入生理鹽水，制成10%的肺組織勻漿，取0.1 mL勻漿液，用BCA法定量勻漿中蛋白含量，然后按照試劑盒說明書進(jìn)行MDA含量測定。

1.9 HE染色檢測肺組織病理變化

取右肺下葉置于4%甲醛中浸泡固定24 h，石蠟包埋，4 μm連續(xù)切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗結(jié)果計量資料以x±s表示，采用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用最小顯著法（LSD-t），P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PFD對大鼠動脈血氣的影響

與正常對照組相比，煙霧吸入損傷組O2分壓（partial pressure of oxygen，paO2）降低，CO2分壓（arterial blood carbon dioxide partial pressure，paCO2）升高（P＜0.05），說明艦船煙霧吸入對大鼠paO2和paCO2有一定的影響；與艦船煙霧吸入損傷組相比，PFD組paO2升高，paCO2降低（P＜0.05），說明PFD能改善艦船煙霧吸入后大鼠的paO2與paCO2，PFD組與正常對照組相比，能恢復(fù)到正常對照組水平（表1）。

Tab.1 Effect of pirfenidone（PFD）on partial pressure of oxygen（paO2）and arterial blood carbon dioxide partial pressure（paCO2）in rats with smoke inhala?tion injury

2.2 PFD對大鼠血清IL-6，IL-17和TNF- α水平的影響

與正常對照組相比，煙霧吸入損傷組各時相點IL-6，IL-17及TNF-α含量均上升（P＜0.05）；與煙霧吸入損傷組相比，同時相點PFD組IL-6，IL-17及TNF-α含量均下降（P＜0.05）；說明PFD能降低炎癥因子的表達(dá)。PFD組與正常對照組相比無明顯的改變（表 2）。

2.3 PFD對大鼠肺組織含水率和MDA含量的影響

與正常對照組相比，煙霧吸入損傷組在煙霧吸入損傷暴露后，肺組織的含水率和MDA水平均明顯升高（P＜0.05）；與煙霧吸入損傷組比，PFD組肺組織的含水率和MDA水平均則明顯降低（P＜0.05）（表3）。

Tab.2 Effect of PFD on serum interleukin-6（IL-6），IL-17 and tumor necrosis factor- α（TNF- α）levels in rats with smoke inhalation injury

Tab.3 Effect of PFD on water content of lung tissue and content of MDA in rats with smoke inhalation injury

2.4 PFD對大鼠肺組織大體觀察及組織病理的影響

肺大體觀察可見各時相點正常對照組大鼠兩肺呈肉粉色，顏色均勻，未見腫脹、出血及壞死；煙霧吸入暴露處理后可見兩肺明顯充血水腫，肺表面早期有針尖樣出血點，部分可見多處斑片狀出血，氣管內(nèi)有白色泡沫狀液體；PFD組大鼠各時相點肺部出血水腫較煙霧吸入損傷組減輕；煙霧吸入損傷組，12 h肺組織表面明顯可見出血塊，24和48 h肺組織表面為針尖樣出血點（圖2）。

光鏡下觀察可見各時相點正常對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)完整、清晰，肺泡壁薄、光滑，肺泡間隔均勻一致，間充質(zhì)無充血或細(xì)胞浸潤；煙霧吸入暴露處理后可見大鼠肺泡壁、肺泡間隔增厚及肺泡上皮組織增生，肺泡間隔可見炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡擴(kuò)張或萎陷，間隔增厚，間充質(zhì)血管充血，微血栓形成，PFD組，肺泡間充質(zhì)、肺泡壁和上皮組織炎癥細(xì)胞浸潤較煙霧吸入損傷組減輕，但仍有部分炎細(xì)胞浸潤。煙霧吸入損傷組在12 h時炎癥細(xì)胞浸潤較多，24和48 h炎癥細(xì)胞浸潤逐漸減少。PFD組12 h仍有少許炎癥細(xì)胞浸潤，24和48 h肺泡中炎癥細(xì)胞浸潤減少，肺泡萎陷程度減輕（圖3）。

Fig.2 Effect of PFD on general view of lung tissue of rats with smoke inhalation injury.See Tab.1 for rat treatment.The arrows show bleeding points.

Fig.3 Effect of PFD on lung histopathology of rats with smoke inhalation injury（HE staining）.See Tab.1 for rat treatment.Arrows show inflammatory cell infiltration.

3 討論

本研究動脈血氣分析顯示，大鼠在煙霧吸入處理后出現(xiàn)低氧血癥，paO2降低，paCO2升高，PFD可升高各時間點煙霧吸入損傷組大鼠的paO2，降低paCO2；各時間點PFD干預(yù)組可有效降低肺含水率，其中12 h組肺含水率降低最為明顯。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物，其含量可反映組織中自由基的多少及脂質(zhì)過氧化程度［18］，煙霧吸入損傷組MDA含量增加表明煙霧吸入破壞肺組織的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，各時間點PFD組肺組織MDA含量與煙霧吸入損傷組相比顯著下降，表明PFD對煙霧吸入肺損傷作用機(jī)制可能與清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化和減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)，這與Maher［19］的研究結(jié)論相符。肺組織的HE染色結(jié)果表明，大鼠在煙霧吸入處理后出現(xiàn)明顯的病理學(xué)變化，主要表現(xiàn)為組織水腫、充血、炎細(xì)胞浸潤，而PFD干預(yù)組對肺組織病理學(xué)變化有改善作用。有研究表明，PFD的早期治療可明顯改善肺組織水腫和低氧血癥的癥狀［20］。

在煙霧吸入性損傷病理生理變化中，過氧化反應(yīng)和炎癥反應(yīng)是兩個重要的過程，細(xì)胞因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在吸入性損傷的致病機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用［21］。煙霧吸入性損傷使肺泡巨噬細(xì)胞過度刺激產(chǎn)生大量氧自由基、IL-6和TNF-α等，使毛細(xì)血管通透性增加，導(dǎo)致水腫程度加重［22］。Tsuchiya等［23］的研究表明，PFD可能通過抑制氧自由基的產(chǎn)生，從而抑制NF-κB和NF-κB誘導(dǎo)的一些細(xì)胞因子如IL-6和TNF-α，進(jìn)而改善肺水腫和肺部炎癥反應(yīng)。IL-6可促進(jìn)細(xì)胞間黏附分子Ⅰ的表達(dá)，并促進(jìn)淋巴細(xì)胞的分化和炎性激活，使炎性損傷反應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)［24］。本研究結(jié)果顯示，PFD可降低煙霧吸入致肺損傷大鼠血清IL-6水平；TNF-α被認(rèn)為是引起急性肺損傷最重要的細(xì)胞促炎因子之一，是一種多功能促炎因子，可激活NF-κB介導(dǎo)其他細(xì)胞因子的合成與釋放，啟動炎癥級聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的吞噬能力，促進(jìn)中性粒細(xì)胞脫顆粒和釋放溶酶體，增強(qiáng)PMN呼吸爆發(fā)，產(chǎn)生過多的氧自由基，誘導(dǎo)肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞過度活化，阻礙肺組織有效灌流和充分氧合［25］。本研究結(jié)果顯示，PFD可降低煙霧吸入致肺損傷大鼠血清的TNF-α水平。IL-17是一種細(xì)胞促炎因子，也是炎癥反應(yīng)的微調(diào)因子，有研究表明其可能在T細(xì)胞、C-X-C趨化因子（IL-8和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2等）與中性粒細(xì)胞的激活和募集之間起介導(dǎo)作用，并參與調(diào)控機(jī)制［26］。另外，IL-17還刺激支氣管上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞合成、釋放中性粒細(xì)胞活化因子，增強(qiáng)彈性蛋白酶活性。本研究結(jié)果顯示，PFD降低煙霧損傷大鼠血清中的IL-17水平。

綜上所述，PFD可能通過抑制氧自由基的產(chǎn)生，從而抑制NF-κB或其他信號途徑誘導(dǎo)的一些細(xì)胞因子的合成與釋放來減輕炎癥反應(yīng)對煙霧吸入性大鼠肺損傷作用。實驗研究證明，PFD對煙霧吸入性損傷具有一定的防護(hù)作用，但具體通過作用何種信號途徑及作用機(jī)制，以及用藥濃度和最適用藥節(jié)點的選擇上還需進(jìn)一步深入研究。